趙城彬 尹歡歡 鄢健楠 劉景圣 杜 琛 牛 希 齊寶坤

（1 吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院 小麥和玉米深加工國家工程實驗室 長春130118 2 東北農業(yè)大學食品學院 哈爾濱150030）

大豆中含有40%左右的蛋白質，被認為是經濟、安全且最具發(fā)展?jié)摿Φ闹参锏鞍踪Y源之一[1]。大豆蛋白屬全價蛋白，具有良好的功能性和較高的營養(yǎng)價值，富含必需氨基酸，與魚、肉、蛋、奶接近，是一種優(yōu)質的植物蛋白，被廣泛應用于食品加工中[2]。大豆分離蛋白（SPI）是大豆油工業(yè)的副產物，其蛋白質含量高于90%，由脫脂豆粕在低溫下除去水溶性非蛋白成分而制得，其結構、組成和性質與純大豆蛋白幾乎相同[3]。為了反映營養(yǎng)物質的消化利用特性，根據體內消化情況建立體外消化模型，將復雜的體內胃、腸消化系統轉化成體外模擬消化體系，從而實現了消化特性研究的可行性和便捷性，在營養(yǎng)成分消化吸收及有效成分生物利用等方面的應用越來越廣泛[4]。目前，國內外涉及蛋白質體外模擬消化研究對象主要為小麥蛋白、大豆蛋白和菜籽蛋白等植物蛋白[5]以及乳清蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白等動物蛋白[6]，采用的消化酶主要包括胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰液素等。然而，大豆蛋白分子在空間排布上具有緊密的折疊結構，導致其對蛋白酶的消化作用不敏感[7]，這極大地降低了大豆蛋白的消化效率。Tang 等[8]研究發(fā)現對豌豆球蛋白進行預處理，使其緊密結構變得松散，利于蛋白質消化。胡少新等[9]研究指出對大豆蛋白進行適當的加熱變性處理能夠提高胰蛋白酶酶解效率，獲得抗氧化活性強的功能性蛋白肽。熱處理能夠使大豆蛋白緊密的結構展開，變得松散，導致分子內部的酶作用位點暴露出來，從而利于蛋白酶與作用位點結合，促進其對大豆白質的消化作用。目前，關于熱處理下SPI 體外模擬消化產物結構和分子質量分布鮮有研究報道，且SPI亞基組成、分子結構與體外消化率之間關系方面的報道更是罕見。本試驗對熱處理后的SPI 進行體外模擬胃消化，利用凝膠電泳分析SPI 亞基的降解情況，采用紅外光譜法分析蛋白質二級結構，通過體積排阻-凝膠色譜法分析蛋白質分子質量分布，探究熱處理對SPI 體外模擬胃消化產物的結構和分子質量分布的影響，為建立及評價大豆蛋白營養(yǎng)消化模式及影響SPI 消化特性的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（陜豆125），陜西省農業(yè)科學院；胃蛋白酶，諾維信生物技術有限公司；三硝基苯磺酸（TNBS），美國Sigma 公司；無水乙醇、NaOH、HCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O 等化學試劑均為國產分析純級。

1.2 設備與儀器

DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；FD 5-3 型冷凍干燥機，美國SIM公司；1600PC 紫外-可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；Mini-Protean 4 電泳儀，美國Bio-Rad 公司；MAGNA-IR560 傅里葉變換紅外光譜系統，美國尼高力公司；HiLoad 16/60 Superdex 200、Sephadex G-75 制備級預裝凝膠層析柱，美國GE 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白（SPI）的制備 SPI 的制備根據Petruccelli 等[10]的方法。將脫皮、粉碎的大豆過60 目篩，采用正己烷40 ℃脫脂2 h。將脫脂豆粕與水以料液比1∶10 的比例混合，采用NaOH 溶液調節(jié)pH 值至8.0，室溫下堿提1 h，然后10 000×g 離心30 min，取上清液，用HCl 溶液調節(jié)上清液pH值至4.5，靜置后6 000×g 離心30 min，取沉淀，將沉淀水洗后復溶，用NaOH 溶液調節(jié)pH 值至7.0，以10 000×g 離心30 min，然后將上清液凍干，即得SPI。通過凱氏定氮法（GB/T5009.5-2010）測得SPI 中蛋白質含量為90.84%。

1.3.2 SPI 體外模擬消化 將SPI 分散于蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2 h，配成5%的蛋白溶液，然后對蛋白溶液進行熱處理，熱處理條件分別為70℃處理20 min，85 ℃處理10 min，85 ℃處理20 min，85 ℃處理30 min，100 ℃處理20 min，然后迅速冰浴冷卻，待用。將人工模擬胃液緩沖液（pH 1.2，84 mmol/L HCl 溶液，35 mmol/L NaCl 溶液）的溫度控制在37 ℃，待體系溫度穩(wěn)定后添加胃蛋白酶（酶活3 000 U/g），使酶與底物比為1∶100，攪拌混勻后添加到蛋白溶液中，在恒定的溫度和pH條件下進行消化反應1 h[11]。消化結束后調節(jié)pH值至7.0，將消化產物凍干后4 ℃保存，備用。以未經熱處理的SPI 消化產物為對照樣。

1.3.3 水解度測定 根據Adler-Nissen[12]的研究，水解度（DH）采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測定。在弱堿性條件下TNBS 與游離氨基酸反應生成的產物在波長340 nm 處有吸收峰，而在酸性條件下即終止反應。繪制標準曲線L-Leu（0～2.0 mmol/L）。DH 的計算公式如下：

式中，AN1——蛋白水解前氨基氮的含量（mg/g 蛋白）；AN2——蛋白水解后氨基氮的含量（mg/g蛋白）；Npb——蛋白底物中肽鍵的氮含量（mg/g蛋白），大豆球蛋白的為109.2 mg/g。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測定 蛋白質的SDS-PAGE 測定參照Yadav 等[13]的方法。樣品緩沖液：0.05 mol/L Tris-鹽酸緩沖液，2.5% β-巰基乙醇，0.02%溴酚藍，1%SDS 和5%甘油。將樣品溶于樣品緩沖液中配成3 mg/mL 的蛋白溶液，95 ℃加熱5 min 后上樣，上樣量為10 μL。濃縮膠質量分數為5%，分離膠質量分數為15%。濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結束后，采用考馬斯亮藍R250 染色，脫色后用Tanon 凝膠成像系統拍照。

1.3.5 傅里葉紅外光譜（FTIR）測定 FTIR 的測定參照Zhao 等[14]的方法。將1 mg 蛋白樣品與100 mg 溴化鉀研磨均勻后壓片，置于紅外光譜儀中測定。波數掃描范圍4 000～500 cm-1，掃描次數64 次，波數精度0.01 cm-1，分辨率4 cm-1，測定溫度25 ℃。利用Peakfit Version 4.12 軟件譜圖擬合處理，根據其峰面積計算蛋白質各二級結構含量。

1.3.6 分子質量分布測定 采用體積排阻-凝膠色譜（SEC-HPLC）對蛋白樣品的分子質量分布進行測定[15]。使用Agilent 高效液相系統和HiLoad 16/60 Superdex 200 制備級預裝層析柱。將樣品溶于蒸餾水中配成10 mg/mL 的溶液，10 000×g 離心10 min，采用0.22 μm 濾膜過濾后上樣，上樣量為1 mL。設置柱體積為120 mL，柱溫25 ℃。Superdex 200 凝膠柱的流動相為50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），洗脫速率為1 mL/min。SephadexG-75 凝膠柱的流動相為0.03 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0），洗脫速率為0.5 mL/min。洗脫后于280 nm 處檢測洗脫液的吸光度。建立相對分子質量與保留時間的回歸方程，根據保留時間估算出蛋白質的分子質量。

1.3.7 統計分析 每個試驗重復3 次，采用SPSS V17.0 軟件進行ANOVA 差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。采用Origin8.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 水解度分析

在溫度為70，85，100 ℃條件下對SPI 熱處理不同時間，然后進行體外模擬消化1 h。圖1顯示不同熱處理條件對SPI 水解度（DH）的影響。熱處理使SPI 消化產物的DH 增加，這說明不同熱處理條件SPI 的消化降解有一定促進作用，這是由于熱處理使蛋白質變性、結構展開，暴露分子內部的活性基團及酶結合位點，增加了對蛋白酶的敏感性，因此易被胃蛋白酶消化降解，導致DH 增加[16]。熱處理溫度的升高和時間的延長均使DH 先升高后降低，且熱處理溫度對DH 的影響更顯著。在85 ℃熱處理20 min 時，DH 達到最大值。然而，100 ℃的熱處理會顯著降低DH，且低于70 ℃熱處理的樣品。這可能是由于過高的熱處理溫度使SPI嚴重變性，導致蛋白質發(fā)生熱聚集，使暴露出來的酶解位點重新包埋，同時蛋白質球狀分子發(fā)生變形，不易與酶分子結合，導致酶對蛋白質的消化降解作用減弱。該結果與Sorgentini 等[17]的研究結果相似。

圖1 不同熱處理條件對SPI 水解度的影響Fig.1 Effect of different heat treatment conditions on degree of hydrolysis of SPI

2.2 SDS-PAGE 分析

不同熱處理條件下SPI 消化產物的SDSPAGE 圖譜見圖2。SPI 主要由具有酸性亞基（A1～4）及堿性亞基（B）的大豆球蛋白（11S）與具有α、α′及β 亞基的β-伴大豆球蛋白（7S）組成，這與Cucu 等[18]對大豆蛋白電泳分析得到的特征譜帶相似。未經熱處理的SPI 消化產物11S 亞基組分幾乎被完消化降解，而7S 亞基組分并沒有被降解。Zhao 等[19]研究發(fā)現大豆7S 蛋白較難被胃蛋白酶消化，這與本研究結果一致。熱處理對消化產物的亞基組成具有顯著影響，使SPI 體外消化模式發(fā)生改變，不易消化降解的7S 亞基組分被消化降解。70 ℃熱處理20 min 和85 ℃熱處理10～30 min均會使SPI 的7S 亞基組分被完全消化（c-f 泳道），而經100 ℃熱處理20 min 的消化產物電泳條帶中還可看到殘留有少量的7S 亞基組分（g 泳道），這表明影響SPI 消化性的主要因素為熱處理溫度。Peng 等[20]研究發(fā)現大豆多肽的緊密結構對胃蛋白酶的水解作用具有抗性，經熱處理使大豆蛋白結構展開，暴露出酶解位點，提高蛋白質消化性，使原本不易酶解的7S 亞基被降解。當熱處理溫度過高，使7S 球蛋白嚴重變性而形成熱聚集體，不易于酶與蛋白質結合，導致部分7S 亞基組分沒有被消化，這也與本文的水解度的變化規(guī)律相符。此外，熱處理會使SPI 的11S 亞基消化程度降低，其中A 亞基只有部分被消化降解，而B 亞基幾乎完全被降解，形成分子質量低于17 ku 或更低分子質量的組分。與未經熱處理的SPI 消化產物相比，經熱處理的SPI 在消化過程中被胃蛋白酶降解成更多的低分子質量組分。

圖2 不同熱處理條件下SPI 消化產物的SDS-PAGE 圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern of SPI digestion products at different heat treatment conditions

2.3 紅外光譜分析

因蛋白質的二級結構與其紅外光譜的酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）吸收密切相關，故可采用此方法分析蛋白質二級結構[21]。圖3為不同熱處理條件下SPI 消化產物的紅外光譜，所有SPI 消化產物在酰胺I 帶（Amide I）1 600～1 700 cm-1處具有強吸收峰。根據Carbonaro 等[22]的方法對酰胺I帶進行擬合，建立各二級結構與掃描波數的對應關系：1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結構，1 610～1 640 cm-1為β-折疊結構，1 660～1 700 cm-1為β-轉角結構，1640～1649 cm-1為無規(guī)卷曲結構，根據對應的峰面積計算各二級結構含量。

不同熱處理條件下SPI 消化產物的二級結構含量如圖4所示。未經熱處理的SPI 消化后，α-螺旋和無規(guī)卷曲含量增加，β-折疊和β-轉角含量降低，說明胃蛋白酶對蛋白質的消化主要破壞其β-結構。熱處理能夠使消化產物的α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低，而β-轉角與無規(guī)卷曲含量變化不顯著。李楊等[23]研究指出完全變性的7S 球蛋白二級結構也具有類似的變化趨勢。此外，相比于熱處理時間，熱處理溫度對SPI 消化產物二級結構的影響更大，導致α-螺旋含量先增加后降低，β-折疊含量先降低后增加。適當的加熱使大豆蛋白變性，結構展開，包埋在分子內部的作用位點暴露出來，使蛋白質發(fā)生解折疊，導致α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低；而過高的加熱溫度使蛋白質發(fā)生熱聚集，部分酶解位點重新包埋，同時變形的球狀分子不利于酶的水解，導致α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加[24]。這也表明高溫可能會導致α-螺旋結構解旋，進而通過分子間相互作用轉化為β-折疊結構，與Carbonaro 等[25]在豆科蛋白的溶解消化關系的研究結果相似。

2.4 分子質量分布分析

圖3 不同熱處理條件下SPI 消化產物的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of SPI digestion products at different heat treatment conditions

圖4 不同熱處理條件下SPI 消化產物的二級結構含量Fig.4 Secondary structure contents of SPI digestion products at different heat treatment conditions

體積排阻-凝膠色譜（SEC-HPLC）主要是根據多孔凝膠對不同分子大小蛋白質的不同排阻效應進行分離，從而測定蛋白質分子質量[26]。天然SPI 的Superdex 200 凝膠洗脫圖譜和蛋白質分子質量分布標準曲線如圖5所示。其標樣曲線的回歸方程為y=-0.0796x+6.5721，R2=0.9891。根據該回歸方程的保留時間估算出蛋白質的分子質量[27]。表1為不同熱處理條件下SPI 消化產物的分子質量分布。與天然SPI 相比，未經熱處理的SPI消化產物中大分子質量肽（＞100 ku）的含量顯著降低（P＜0.05），中等分子質量肽（10～100 ku）和小分子質量肽（＜3 ku）的含量顯著增加（P＜0.05），而中小分子質量肽（3～10 ku）的含量變化不顯著（P＞0.05），這說明胃蛋白酶能夠將大分子SPI 消化降解成小分子肽。與未經熱處理的SPI 消化產物相比，升高熱處理溫度或延長熱處理時間雖會增加大分子質量肽（＞100 ku）和中小分子質量肽（3～10 ku）的含量，但會降低中等分子質量肽（10～100 ku）和小分子質量肽（＜3 ku）的含量，這說明熱處理改變SPI 消化產物的分子質量分布。這可能是由于熱變性導致SPI 結構伸展，促進了可溶性和不溶性聚集體的形成[28]。胃蛋白酶消化降解這些變性蛋白形成的聚集體時，主要生成大分子質量肽，而小分子質量肽及氨基酸釋放較少。Iung 等[29]在對β-乳球蛋白的消化性研究中發(fā)現，采用胰蛋白酶水解β-乳球蛋白會產生較多小分子質量肽，而消化熱處理的β-乳球蛋白則會產生較多大分子質量肽，這與本研究結果相似。

圖5 天然SPI 的Superdex 200 凝膠洗脫圖譜（a）和蛋白質分子質量分布標準曲線（b）Fig.5 Superdex 200 gel elution spectrum of native SPI（a）and the molecular weight distribution curve of standard samples（b）

表1 不同熱處理條件下SPI 消化產物中蛋白分子質量分布Table1 Protein molecular weight distribution of SPI digestion products at different heat treatment conditions

3 結論

采用胃蛋白酶對熱處理后的大豆分離蛋白（SPI）進行體外模擬消化。熱處理會使SPI 消化產物的水解度增加，85 ℃熱處理20 min 時，DH 達到最大值。凝膠電泳分析表明熱處理使SPI 體外消化模式發(fā)生了改變，11S 亞基消化程度降低，同時不易消化降解的7S 亞基組分被消化降解，產生更多低分子質量的組分。紅外光譜分析表明熱處理的SPI 經消化后α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低。相比于熱處理時間，熱處理溫度對SPI 消化產物二級結構的影響更大。分子質量分布分析表明：熱處理會改變SPI 消化產物的分子質量分布，隨著熱處理溫度和時間的增加，大分子質量肽（＞100 ku）和中小分子質量肽（3～10 ku）的含量升高，而中等分子質量肽（10～100 ku）和小分子質量肽（＜3 ku）的含量呈下降趨勢。