鄧婷婷 黃文勝 葛毅強 陳 穎*

（1 中國檢驗檢疫科學研究院 北京100176 2 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083 3 科技部中國農村技術開發(fā)中心 北京100045）

目前世界各國出于經濟、衛(wèi)生、環(huán)保等各種目的，紛紛對轉基因生物及其產品加強管理和檢測。包括中國在內的50 多個國家和地區(qū)相繼頒布并實行了“轉基因標識制度”，對轉基因生物及其加工產品進行標識和管理。近年來，隨著各國有關轉基因生物（Genetically Modified Organism，GMO）標簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO 含量下限有所規(guī)定。很多國家不但要求對轉基因食品進行定性檢測，還要對食品中的GMO 含量進行定量檢測，以便標識，其標識的閾值一般在0.9%～5%之間[1-4]。而建立轉基因產品的檢測技術尤其是精準定量檢測技術是實施轉基因產品標識的技術前提。轉基因成分的精準定量技術將隨著全世界標識制度的完善和發(fā)展日趨重要。

我國轉基因水稻研究處于國際領先水平，由我國自主研發(fā)的轉基因抗蟲水稻Bt 汕優(yōu)63 品系是采用基因槍法將人工合成的Bt 基因cry1Ac/cry1Ab 導入受體水稻明恢63 基因組中經多代選育出來的，經抗蟲試驗，其防蟲效果在95%以上[5-6]。2009年，轉基因抗蟲水稻Bt 汕優(yōu)63（TT51-1）雖獲得農業(yè)部頒發(fā)的湖北省安全生產證書[7]，但尚未實現(xiàn)商業(yè)化種植，因此在大米及其制品的日常檢測和出入境檢測監(jiān)管中，該品系是我國重點關注的對象之一，需要建立轉基因大米及其制品的轉基因成分精準檢測方法。轉基因大米種類及其遺傳修飾的多樣性使得其檢測變得越來越困難，其定量檢測的要求也越來越高。隨著國內外檢測分析水平的提高，轉基因大米及其制品的檢測方法也將從最初定性分析逐漸轉為精準定量分析。作為具有商業(yè)化前景的轉基因大米品系TT51-1，目前的定量分析仍采用實時熒光PCR法，該方法需要根據(jù)標準樣品繪制的標準曲線來推測樣品中的轉基因含量，標準品、樣品的核酸提取質量以及PCR 擴增效率等均會對定量結果產生影響，很難達到較高的精確度，尤其是轉基因成分含量低于1%水平時[6，8-9]，難以滿足國際最低標識閾值0.1%[1]的檢測需求。

數(shù)字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）是在實時熒光PCR 基礎上發(fā)展起來的微量DNA分子定量技術。1999年由Vogelstein 和Kinzler 首次提出數(shù)字PCR 的概念[10]。如今的數(shù)字PCR 技術借助微流體平臺將樣本分成大量（數(shù)百，數(shù)千甚至數(shù)百萬個）微反應室，每個微反應室單獨進行PCR 擴增后，再判定各個終產物的陰陽性。根據(jù)泊松分布原理來計算初始模板濃度[11]。由于數(shù)字PCR 不需要校準物，能準確測量低拷貝的DNA 分子，使得它成為有效的核酸精準定量工具，在醫(yī)藥、環(huán)境等領域廣泛應用，如識別基因拷貝數(shù)的變異，低拷貝數(shù)核酸分子的檢測，DNA 質量分析或檢查單細胞水平的基因表達等[12-19]。目前有報道將數(shù)字PCR 技術用于轉基因作物精準定量檢測中[20]。Corbisier 等[21]最先將數(shù)字PCR 方法應用在轉基因成分的定量中，該研究將轉基因玉米Mon810 的數(shù)字PCR 定量結果與實時熒光定量結果相比較，定量結果較為一致。Burns 等[13]采用已驗證的實時熒光PCR 反應體系，評估數(shù)字PCR技術的絕對檢測限和定量限，也闡述了采用梯度預實驗的方式可使數(shù)字PCR 更精確地測量拷貝數(shù)。Fu 等[22]利用數(shù)字PCR 對MON810 等多品系轉基因作物的CaMV35s 啟動子和NOS 終止子進行定量分析，結果表明其定量檢測限為0.1%。Dobnik 等[23]利用微滴式數(shù)字PCR 方法分別建立兩個多重定量方法，可對12 個品系的轉基因玉米進行含量測定，其檢出限、重復性和真實性均符合國際標準中GMO 定量要求。其它研究也證明數(shù)字PCR可定量分析玉米、大豆、油菜及煙草等作物中的轉基因成分，這些研究結果均表明數(shù)字PCR 定量方法靈敏度高，準確度高于實時熒光PCR 方法[24-28]。

本研究以轉基因抗蟲大米（Oryza sativa L.）TT51-1 品系為研究對象，建立基于大米內標準基因SPS 和TT51-1 品系特異性基因的轉基因大米TT51-1 數(shù)字PCR 定量檢測方法，并應用于轉基因大米及米制品檢測中，以期為相關部門提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉基因大米LL62 標準樣品、轉基因大豆Roundup Ready 標準樣品、轉基因玉米Bt11 標準樣品，歐盟聯(lián)合研究中心標準物質與測量研究所及美國油脂化學家協(xié)會；TT51-1、KF6、M12、克螟稻等轉基因大米樣品、野生型大米明恢63（非轉基因）及其它實驗樣品均由本實驗室保存。

2×微滴式數(shù)字PCR 預混液、微滴生成槽、微滴生成油等，美國Bio-Rad 公司；2×Taq PCR MasterMix，美國ABI 公司；食品基因組提取試劑盒NucleoSpinRFood，美國MN 公司。

1.2 儀器與設備

微滴式數(shù)字PCR 儀QX200 系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；實時熒光PCR 儀7500，美國ABI 公司；Qubit 核酸蛋白分析儀，美國Thermo Scientific公司；樣品研磨機，德國IKA 公司；離心機，美國Beckman Coulter 公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提取 分別將各種樣品材料研磨至60 目粒度，按照食品基因組提取試劑盒NucleoSpinRFood 說明書進行DNA 提取并利用Qubit 核酸蛋白分析儀測定濃度。

1.3.2 引物和探針的設計及合成 為篩選適用于轉基因大米TT51-1 數(shù)字PCR 定量的引物探針，根據(jù)大米蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose phosphate synthase，SPS）和轉基因大米TT51-1 品系外源插入片段與大米基因組3’端交界處的序列，設計3對SPS 基因引物探針和2 對TT51-1 品系特異性基因的引物探針，由英濰捷基（上海）貿易有限公司進行合成和標記（表1）。

1.3.3 擴增體系和反應參數(shù) 數(shù)字PCR 擴增體系：2×微滴式數(shù)字PCR 預混液10 μL，SPS 及TT51-1 基因正、反向引物各1 μL（終濃度0.32 μmol/L），SPS 基因探針0.5 μL（終濃度0.12 μmol/L），TT51-1 基因探針0.5 μL（終濃度0.2 μmol/L），DNA 模板5μL。

數(shù)字PCR 反應參數(shù)：按上述體系配制好的數(shù)字PCR 反應混合液，加入微滴生成槽的加樣孔中，在其另一側加入微滴生成油后放入QX 200TM微滴生成器中，由儀器按固定程序生成微滴。將生成的微滴移至PCR 擴增板中進行加膜密封后放入普通PCR 儀，擴增程序：95 ℃，5 min，1 個循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，60 個循環(huán)；98 ℃10 min，1 個循環(huán)；12 ℃保存。將擴增產物放入微滴讀取儀中進行熒光檢測和陰陽性微滴數(shù)的讀取，采用Quantasoft 分析軟件（美國Bio-Rad 公司）自動計算數(shù)字PCR 反應體系中的SPS 和TT51-1 轉化體特異性基因的含量（copies/μL），再根據(jù)二者的比值計算得到樣品中TT51-1 轉基因成分含量（%）。

表1 SPS 和TT51-1 基因引物探針序列表Table1 The sequence of primers and probes of SPS and TT51-1

實時熒光PCR 擴增體系：2×Taq PCR 預混液10 μL，SPS 或TT51-1 基因正、反向引物各1μL（終濃度0.4 μmol/L），SPS 或TT51-1 基因探針0.5 μL（終濃度0.2 μmol/L），DNA 模板5 μL，利用ddH2O 補至20 μL。

實時熒光PCR 反應參數(shù)：95 ℃，10 min；95℃，10 s，60 ℃，45 s，45 個循環(huán)。

1.3.4 引物探針有效性和特異性 以轉基因大米TT51-1 品系為擴增模板，非轉基因大米明恢63和ddH2O 為對照，對SPS 基因的3 組引物探針和TT51-1 品系特異性基因的兩組引物探針進行有效性擴增。分別選取SPS 和TT51-1 品系特異性基因擴增效率最高的引物探針組后，以非轉基因大米明恢63、轉基因大米TT51-1、KF6、KMD、LL62品系常見作物大豆、玉米、小麥、高粱、油菜為模板，ddH2O 為空白對照，對SPS-F2/R2/P2 引物探針組的特異性進行分析。以100% TT51-1 轉基因大米、1% TT51-1 轉基因大米、非轉基因大米明恢63、轉基因克螟稻、KF6、M12、LL62、轉基因大豆Roundup Ready、轉基因玉米Bt11 為模板，ddH2O 為空白對照，對TT51-F2/R2/P2 引物探針組的特異性進行分析。

1.3.5 TT51-1 轉基因大米定量的絕對靈敏度和相對靈敏度 將轉基因大米TT51-1 DNA 溶液測定濃度進行2 倍梯度稀釋，直至內、外源基因含量均為2 copies/μL，即分別稀釋至3 pg 及1 pg（大米單個基因組質量約為0.5 pg）。共稀釋4 個梯度，每個梯度4 個重復試驗，進行內源基因SPS 和外源基因TT51-1 的雙重數(shù)字PCR 檢測。根據(jù)內、外源基因的定量值（數(shù)字PCR 測得的基因含量）和理論值（根據(jù)Qubit 核酸蛋白分析儀測得的DNA 濃度計算出的基因含量）繪制相關性曲線。

利用上述試驗建立的雙重數(shù)字PCR 定量體系，對非轉基因大米及質量分數(shù)分別為0.1%，1%，10%的轉基因大米TT51-1 樣品的內、外源基因分別進行定量檢測（3 次重復），根據(jù)儀器通過泊松分布原理計算出的內、外源基因含量（copies/μL），獲得各樣品的實際含量。

1.3.6 TT51-1 轉基因大米數(shù)字PCR 定量方法的精密度和重復性 針對質量分數(shù)低至0.1%，1%的TT51-1 轉基因大米樣品開展轉基因成分定量，每個樣品重復3 次，共設置6 個平行。根據(jù)內、外源基因拷貝數(shù)計算其SD、RSD 及相對偏差。

1.3.7 TT51-1 轉基因大米實時熒光PCR 方法定量結果 根據(jù)TT51-1 轉基因成分質量分數(shù)為100%，10%，5%，0.5%及0.1%的標準樣品制作內、外源基因的標準曲線，對質量分數(shù)0.1%，1%，10%的轉基因大米TT51-1 樣品DNA 進行實時熒光PCR 擴增并定量分析，與數(shù)字PCR 定量結果進行比較。

1.3.8 方法驗證 在相同的測試環(huán)境和驗證方法下，基于芯片式數(shù)字PCR 平臺，兩位試驗操作人員做兩組平行試驗。每個樣品設3 次重復，對質量分數(shù)為0.1%，0.5%，1%，5%的標準樣品進行芯片式數(shù)字PCR 定量研究。針對擴增微反應體系的分布情況，內、外源基因的定量拷貝數(shù)等逐一進行分析。

2 結果與分析

2.1 引物探針的有效性和特異性分析

所有SPS 和TT51-1 基因引物探針組的實時熒光PCR 擴增結果表明，SPS 基因的3 組引物探針和TT51-1 品系特異性基因的兩組引物探針均能有效擴增出各自對應的靶基因，SPS 基因F2/R2/P2 引物探針組和TT51-1 基因RB-F2/R2/P2引物探針組信號最強（圖1）。

圖1 SPS 及TT51-1 品系特異性基因各組引物探針篩選圖Fig.1 The effectiveness of the primers and probes of SPS and TT51-1 event-specific genes

為保證后續(xù)數(shù)字PCR 反應能到達最大效率，選取SPS-F2/R2/P2 和TT51-F2/R2/P2 兩組引物探針，對其特異性進行驗證。SPS-F2/R2/P2 引物探針組僅能擴增出大米成分，對其它禾本科植物玉米、小麥及大豆、玉米等作物均無擴增。TT51-F2/R2/P2 引物探針組僅能擴增出TT51-1 轉基因成分，其它轉基因大米克螟稻、KF6、M12、LL62，轉基因大豆Roundup Ready、轉基因玉米Bt11、陰性對照（非轉基因大米明恢63）和空白對照（ddH2O）均無擴增（圖2），即SPS-F2/R2/P2 和TT51-F2/R2/P2 引物探針組只能分別擴增大米和轉基因大米TT51-1 成分，其特異性均較好。

2.2 TT51-1 轉基因大米品系定量絕對靈敏度

在所有稀釋梯度中，SPS 和TT51-1 基因定量體系的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別在0.63%～2.62%和0.96%～3.62%之間，所有稀釋梯度的RSD 值均遠小于25%，符合目前最嚴格的國際標準和歐盟定量方法要求[30-31]。其內、外源基因稀釋梯度曲線的R2分別為0.9998和0.9995，遠高于實時熒光PCR 定量要求的中0.98[31]，該體系所檢測的濃度梯度均具有很好的線性關系（圖3a）。由于TT51-1 是母本非轉基因水稻和父本轉基因水稻華恢1 號純合子雜交產生的雜合子（F1 代），其米粒（胚乳）中含有2 倍的母本基因組和1 倍的父本基因組，因此SPS/TT51-1 基因之比的理論值應為0.33。而實際結果中，SPS/TT51-1 基因拷貝數(shù)的比值在0.31～0.36 之間，其相對誤差在6%～9%之間（圖3b），即大米基因組在2～2 000 copies/μL 范圍時，定量的結果與理論值相符，該檢測體系能夠對含量低至2 copies/μL 的轉基因大米TT51-1 進行準確定量。

圖2 SPS-F2/R2/P2 及TT51-F2/R2/P2 引物探針組特異性擴增圖Fig.2 The specificity of primers and probes of SPS-F2/R2/P2 and TT51-F2/R2/P2

圖3 TT51-1 轉基因大米品系定量檢測線性關系及其絕對定量靈敏度Fig.3 Linear relationship and absolute sensitivity of quantitative detection of GM rice event TT51-1

2.3 TT51-1 轉基因大米數(shù)字PCR 定量方法的精密度和重復性

為了測試方法的精密度，對質量分數(shù)為0.1%和1%的樣品進行數(shù)字PCR 擴增。含量為0.1%的6 個TT51 大米平行樣品的定量結果分別為（0.098%±0.0073）%，（0.102±0.0093）%，（0.110±0.006）5%，（0.102±0.0027）%，（0.091 ±0.0043）%，（0.108±0.0034）%，所有樣品的3 次重復RSD 在7.30%～18.63%之間，與理論含量值的偏差在-8.77%～9.62%之間。含量為1%的6 個TT51大米平行樣品的定量結果分別為（1.111±0.034）%，（0.957 ± 0.051）%，（1.143 ± 0.016）%，（0.922 ±0.012）%，（1.090±0.047）%，（0.987±0.054）%，所有樣品的3 次重復RSD 在3.66%～7.98%之間，與理論含量值的偏差在-7.84%～14.28%之間。兩種低含量的TT51 大米樣品的相對偏差和RSD 值均遠小于常規(guī)定量要求的25%，表明該方法即使在對低含量的樣品進行重復定量時，其精密度和穩(wěn)定性均較為理想。在樣品配制時，只要保證混合均勻，即使GM 成分含量較低，也能利用數(shù)字PCR方法進行準確定量（圖4）。

圖4 TT51-1 樣品6 次重復定量結果Fig.4 Quantitative results of 6 replicates of GM rice TT51-1

2.4 轉基因大米TT51-1 數(shù)字PCR 與實時熒光PCR 方法定量結果比較

分別以數(shù)字PCR 與實時熒光PCR 方法對質量分數(shù)為0.1%和1%、10%的轉基因大米TT51-1樣品進行定量。數(shù)字PCR 定量結果中各樣品TT51-1 含量分別為（0.122±0.0043）%，（0.996±0.0303）%和（9.954 ± 0.1067）%，其與實際值的偏差分別為-1.31%，-2.95%，21.26%。各樣品多次重復試驗中，1%，10%樣品的RSD 值均小于5%，0.1% RSD 值也符合要求，表明本研究建立的微滴式數(shù)字PCR 定量方法對轉基因大米TT51-1 的定量靈敏度達0.1%（質量分數(shù)），其定量準確性和精密度符合國際通用要求（表2）。

實時熒光PCR 定量分析中，當內、外源基因PCR 擴增效率分別為97.16%和102.35%，內、外源基因的標準曲線R2都在0.99 以上，且各樣品內、外源基因的3 次重復RSD 值在1.08%～18.32%之間時，各質量分數(shù)定量值分別為（0.130±0.0022）%，（1.255±0.0229）%，（9.917±0.1630）%，其與實際值的偏差分別達到-0.83%，25.45%，29.77%（表2）。

實時熒光PCR 方法繪制的兩條標準曲線相關性及內、外源基因的PCR 擴增效率符合要求，當目標樣品含量為10%時，定量結果較為準確，而當樣品含量低至1%時，定量結果出現(xiàn)偏差。數(shù)字PCR 即使針對含量為0.1%的樣品，其偏差也不超過國際轉基因定量方法要求的25%。就定量分析來說，數(shù)字PCR 的定量準確性及靈敏度要好于實時熒光PCR。

表2 不同含量TT51-1 大米樣品數(shù)字PCR 定量結果Table2 Quantitative results of different samples of GM rice event TT51-1 by digital PCR

2.5 方法驗證

為驗證本研究建立的微滴式數(shù)字PCR 定量方法的準確性和精密度，在相同的測試環(huán)境和驗證方法下，基于芯片式數(shù)字PCR 平臺，兩位試驗人員做兩組平行試驗，每個樣品設3 次重復，對質量分數(shù)為0.1%，0.5%，1%，5%的標準樣品進行芯片式數(shù)字PCR 定量檢測。經優(yōu)化，Quantstudio 3D芯片式數(shù)字PCR 平臺上的內、外源基因空白對照均未出現(xiàn)非特異信號時，所有含量的TT51-1 樣品在芯片式數(shù)字PCR 平臺上所產生的陰性點和陽性點分離較好，無中間模糊區(qū)（圖5），所有重復樣品的系統(tǒng)精確性均在10%以內（Quantstudio 3D系統(tǒng)自動計算，數(shù)據(jù)未列出）。

圖5 不同含量TT51-1 樣品在芯片式數(shù)字PCR 平臺的定量結果Fig.5 Quantitative results of different contents of GM rice event TT51-1 by chip-based digital PCR

經計算，質量分數(shù)為1%和5%樣品的定量結果與理論值的偏差都在5%內，3 次重復的RSD 值都遠遠小于極限值25%，表明本方法對這兩組樣品的定量精準。而質量分數(shù)為0.1%和0.5%的樣品定量結果與理論值的偏差雖都大于10%，但小于極限值25%（表3），且重復性較好。本方法精準定量檢測靈敏度達0.1%，定量方法精密度和準確性符合要求。

表3 轉基因大米TT51-1 樣品芯片式數(shù)字PCR 平臺定量結果Table3 Quantitation of TT51-1 rice by chip-based digital PCR

3 結論與討論

實時熒光PCR 在進行轉基因產品定量時是根據(jù)已知濃度轉基因標準品的含量及其擴增Ct值制作標準曲線后，將未知濃度的轉基因樣品擴增結果帶入標準曲線進行含量計算。PCR 擴增效率、反應抑制物及標準品和樣品之間的背景差異等因素都引入偏差，導致其定量結果往往與實際值相差較大[13，21]。而數(shù)字PCR 技術是通過絕對定量樣品中的內參考基因和品系特異性基因的拷貝數(shù)，根據(jù)二者的比例直接計算出轉基因含量，無需標準品和標準曲線，因此比實時熒光PCR 依靠標準曲線來確定轉基因成分含量更加準確。數(shù)字PCR 因采用稀釋后獨立擴增的反應方式，故降低了DNA 溶液中酶活抑制物的濃度，與實時熒光PCR 相比提高了低含量樣品的檢測靈敏度。此外，數(shù)字PCR 采用擴增結束后直接計數(shù)的方法進行對靶標基因定量，其試驗操作的條件較為寬松。本研究采用與實時熒光PCR 同樣的引物探針和擴增參數(shù)，最終的定量結果卻比實時熒光PCR 更加準確、靈敏，也證明了這一點。本研究建立的數(shù)字PCR 方法在轉基因大米TT51-1 成分定量檢測中具有比實時熒光PCR 更大的應用價值。

定量分析方法在實際檢測中進行應用時，測量不確定度的分析具有重要的實際意義。之前的研究表明，基于實時熒光PCR 的轉基因成分定量過程中，由于內、外源基因擴增效率不一致帶來的不確定度以及采用低濃度標準品繪制標準曲線帶來的不確定度是測量不確定度的主要來源，其次是批內重復的不確定度[32-33]。該方法定量的動態(tài)范圍也受到極大地限制。而在數(shù)字PCR 中，由于無需標準曲線對樣品進行定量，因此該部分不確定度可認定為0。Bhat 等[34]認為反應室的容量是不確定度的主要來源，評定其相對不確定度在6%以下。這項發(fā)現(xiàn)可以用于其它數(shù)字PCR 測量的置信水平研究?？傊c實時熒光PCR 方法相比，影響其不確定度的主要因素已經改變。盡可能保證抽制樣的科學性和樣品批內的重復性，則可以減小定量的偏差和不確定度。