曲道峰 陸詩(shī)銚 陳躍文 黃東萍 龔俏玲 易松強(qiáng) 韓劍眾*

（1 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018 2 江西省畜牧技術(shù)推廣站 南昌330046

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）廣泛分布于細(xì)菌和古生菌的基因組中，它是由RNA 介導(dǎo)的、可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng)，與細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可以識(shí)別并剪切加工質(zhì)粒等外源遺傳物質(zhì)，進(jìn)而降低基因的水平轉(zhuǎn)移。CRISPR 位點(diǎn)由重復(fù)序列和間隔序列組成，與前導(dǎo)序列、Cas 蛋白基因共同構(gòu)成了CRISPR 系統(tǒng)[1]。重復(fù)序列保守性高，具有回文結(jié)構(gòu)，能轉(zhuǎn)錄并形成RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)[2]。間隔序列是高度可變的，研究發(fā)現(xiàn)噬菌體、大質(zhì)粒等外源性可移動(dòng)遺傳原件是主要來(lái)源。前導(dǎo)序列和重復(fù)序列相互連接，當(dāng)細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生新的間隔序列時(shí)，可以識(shí)別該新序列并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前crRNA（CRISPR RNAs-）。在CRISPR位點(diǎn)附近存在CRISPR 相關(guān)蛋白質(zhì)（CRISPR-associated，Cas）基因，可以編碼Cas 蛋白，CRISPR/Cas 系統(tǒng)有3 個(gè)類型，即CRISPR/Cas 系統(tǒng)類型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，依據(jù)Cas蛋白基因的差別每個(gè)類型可細(xì)分為幾個(gè)亞類[3]。Haft 等根據(jù)cas 基因的相似程度將其分為45 個(gè)家族，在每個(gè)CRISPR 位點(diǎn)中都存在cas1 和cas2家族基因，可用這兩個(gè)家族基因作為分子標(biāo)記來(lái)鑒定CRISPR 系統(tǒng)[4]。

腸桿菌科經(jīng)常是醫(yī)學(xué)和科學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)，作為影響公共健康的一個(gè)重要標(biāo)志，在公共衛(wèi)生領(lǐng)域中對(duì)細(xì)菌食源性病原體進(jìn)行深入研究意義頗深[5]。志賀菌屬于腸桿菌科，是細(xì)菌性痢疾的病原體，同時(shí)也是一種最古老的人類特異性病原菌，有研究發(fā)現(xiàn)志賀菌屬在35 000-170 000年之前就已經(jīng)進(jìn)化，與人類的起源和發(fā)展關(guān)系密切[4]。志賀氏菌根據(jù)O 抗原可分為4 種類型，分別為痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內(nèi)志賀氏菌[6]。在我國(guó)，福氏志賀氏菌比較常見，而基于CRISPR 系統(tǒng)特點(diǎn)的研究還比較少，且研究結(jié)果不一致[7]。本文主要比較和分析了40 株基因測(cè)序的志賀氏菌的CRISPR 位點(diǎn)，研究在不同志賀氏菌種中CRISPR 位點(diǎn)結(jié)構(gòu)上的差異，對(duì)間隔序列與插入序列的同源性進(jìn)行比較，判斷CRISPR 位點(diǎn)與RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)系[8]。

1 材料和方法

1.1 材料

從NCBI genome 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取40 株志賀氏菌的遺傳信息和基因組全序列（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome），其中包括6 株鮑氏志賀氏菌（Shigellaboydii），5株痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae）、18 株福氏志賀氏菌（Shigellaflexneri）以及11 株宋內(nèi)氏志賀氏菌（Shigellasonnie）?；蚪M序列及其GenBank 編號(hào)見表1。

表1 40 株志賀氏菌基因組序列信息匯總Table1 The information of the genome sequence of 40 strains of shigella

1.2 志賀氏菌中CRISPR 位點(diǎn)分析

在CRISPRs Database（http：//crispr.i2bc.parissaclay.fr/crispr/）網(wǎng)站上查找并獲取40 株志賀氏菌CRISPR 的重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer），分析其CRISPR 位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，同時(shí)在CRISPR Finder（http：//crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/）和CRT（CRISPR Recognition Tool）軟件中進(jìn)行查找預(yù)測(cè)[9]。

1.3 CRISPR 結(jié)構(gòu)的核酸序列分析

將志賀氏菌的CRISPR 序列進(jìn)行BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）線上比對(duì)，利用Clustal X 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)CRISPR BLAST 和CRISPR Finder 對(duì)志賀氏菌的CRISPR 位點(diǎn)的重復(fù)間隔序列進(jìn)行對(duì)比分析，再利用WebLogo 將CRISPR1～3，CRISPR-Q1～Q4 的重復(fù)序列進(jìn)行可視化。

1.4 間隔序列的同源序列查找

將各菌種的間隔區(qū)提交到IS Finder 和INTEGRALL 網(wǎng)站進(jìn)行在線比對(duì)，通過(guò)CRISPRs Database 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，尋找已有的間隔序列中的外源同源序列，以及新發(fā)現(xiàn)的間隔序列，分析間隔區(qū)序列的同源序列是否來(lái)源于外源DNA。使用BLAST 和CRISPRTarget 來(lái)分析間隔序列。

1.5 CRISPR 位點(diǎn)與RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的相關(guān)性分析

預(yù)測(cè)CRISPR 重復(fù)序列的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)RNAfold 網(wǎng)站對(duì)CRISPR 位點(diǎn)的重復(fù)序列進(jìn)行RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并研究重復(fù)間隔序列的基數(shù)差異CRISPR1～3，CRISPR Q1～Q4 是否直接影響RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的莖環(huán)穩(wěn)定性。

1.6 CRISPR 位點(diǎn)的質(zhì)粒相關(guān)性分析

在NCBI 網(wǎng)站上查詢并下載相關(guān)菌株質(zhì)粒的完整序列，菌株CRISPR 位點(diǎn)數(shù)量與菌株的質(zhì)粒數(shù)量之間的關(guān)系采用非參數(shù)檢驗(yàn)Wilcoxon rank sum test 進(jìn)行比較分析。由Origin 8.5 軟件完成相關(guān)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 志賀氏菌中CRISPR 結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的基因組分布情況

研究了40 株志賀氏菌并查找其CRISPR 位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)CRISPR 位點(diǎn)241 個(gè)，其中可疑位點(diǎn)（Possible CRISPR）235 個(gè)，可確定位點(diǎn)（Confirmed CRISPR）6 個(gè)，且發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)CRISPR 位點(diǎn)位于染色體上，只有2 個(gè)CRISPR 位點(diǎn)位于質(zhì)粒上。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)這40 株菌的平均CRISPR 個(gè)數(shù)是6個(gè)，其中6 株鮑氏志賀氏菌的平均CRISPR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)是2.5 個(gè)，5 株痢疾志賀氏菌的平均個(gè)數(shù)是13.8 個(gè)，18 株福氏志賀氏菌的平均個(gè)數(shù)是5.5 個(gè)，以及11 株宋內(nèi)氏志賀氏菌的平均個(gè)數(shù)是5.3 個(gè)。統(tǒng)計(jì)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，痢疾志賀氏菌1617 這一菌株中的CRISPR 位點(diǎn)個(gè)數(shù)高達(dá)50 個(gè)，其中可疑位點(diǎn)49 個(gè)。而鮑氏志賀氏菌4444-74、痢疾志賀氏菌WRSD3、宋內(nèi)氏志賀氏菌786_SSON 等菌株中均只含有一個(gè)CRISPR 位點(diǎn)。

成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列和它的輔助蛋白（CRISPR-associated，Cas）構(gòu)成了CRISPR/Cas 系統(tǒng)。cas 基因有45 個(gè)家族，對(duì)40 株志賀氏菌的CRISPR/Cas 系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該菌CRISPR/Cas 系統(tǒng)均屬于Ⅰ-E 型，未發(fā)現(xiàn)Ⅱ類和Ⅲ類的Cas 系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)241 個(gè)CRISPR 位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)研究，根據(jù)位點(diǎn)的相似性，該細(xì)菌的CRISPR 可分為8 類：CRISPR1，CRISPR2，CRISPR3，CRISPRQ1，CRISPR -Q2，CRISPR -Q3，CRISPR -Q4 和CRISPR-Q5。CRISPR1 位于核心基因cysD/iapcysH 和cysD/iap-cysH 之間，距離CRISPR2 約20 kb。CRISPR1-3 的Cas 結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的保守性。總的來(lái)說(shuō)，在5 個(gè) 可疑CRISPR 中，CRISPR-Q1，CRISPR-Q2，CRISPR-Q4，CRISPR-Q5在大多數(shù)志賀氏菌中廣泛分布。這5 個(gè)可疑CRISPR 序列包含一些獨(dú)特的分隔符，暗示他們是保守的CRISPR。此外，還發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的CRISPR 位點(diǎn)僅顯示一個(gè)重復(fù)，CRISPR-Q5 在菌株中出現(xiàn)的次數(shù)并不多，故本文不作研究。

為了鑒定志賀氏菌中的cas 基因，從40 株志賀氏菌中選取9 株具有代表性的菌株，用CRISPR位點(diǎn)圖來(lái)研究CRISPR1～3 的相關(guān)信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這9 株菌都有CRISPR3 結(jié)構(gòu)，除福氏志賀氏菌外其它3 類的CRISPR 位點(diǎn)都比較復(fù)雜，含有很多cas 基因和其它基因片段，也包含很多插入序列。由圖1表明，cas 基因的排列順序具有高度的一致性，其排列順序?yàn)閏as2-cas1-cas6-cas5-cas7-cse2-cse1-cas3。

2.2 重復(fù)序列與Cas 蛋白的進(jìn)化分析

由表2可知，即使在同種細(xì)菌中的不同種類的菌株之間，CRISPR 位點(diǎn)重復(fù)序列的堿基數(shù)量和分布也有顯著的區(qū)別，而且同類細(xì)菌中重復(fù)序列數(shù)也不存在規(guī)律性。比如鮑氏志賀氏菌中的15 個(gè)CRISPR 位點(diǎn)中共含有重復(fù)區(qū)域個(gè)數(shù)60 個(gè)，且僅有1 次重復(fù)。痢疾志賀氏菌的69 個(gè)CRISPR 位點(diǎn)中共包含重復(fù)序列個(gè)數(shù)157 個(gè)，其中重復(fù)數(shù)最高可達(dá)35 個(gè)。18 株福氏志賀氏菌的99 個(gè)CRISPR位點(diǎn)中共含有202 個(gè)重復(fù)序列個(gè)數(shù)，平均每株重復(fù)個(gè)數(shù)在11～15 個(gè)之間。11 株宋內(nèi)志賀氏菌的58個(gè)CRISPR 位點(diǎn)中共含有137 個(gè)重復(fù)序列個(gè)數(shù)，重復(fù)個(gè)數(shù)16 個(gè)的菌株較多。

對(duì)40 株志賀氏菌的重復(fù)序列進(jìn)行遺傳聚類分析（圖2a），發(fā)現(xiàn)不能對(duì)不同種細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。9株菌株的CRISPR/Cas 系統(tǒng)中均含有cas3 基因，且是廣泛分布的，其表達(dá)“R-環(huán)解旋酶-退火酶”。對(duì)9 株志賀氏菌進(jìn)行遺傳聚類分析（圖2b），與重復(fù)序列相似，cas3 基因的保守性較強(qiáng)，不可區(qū)分同種細(xì)菌的不同菌株。

圖1 9 株志賀氏菌CRISPR1～3 位點(diǎn)的分布Fig.1 The distribution of CRISPR1～3 of 9 Shigella strains

表2 不同CRISPR 位點(diǎn)重復(fù)序列的分析Table2 Analysis of the repeat sequence of different CRISPR loci

2.3 前導(dǎo)序列和間隔序列的特征分析

研究發(fā)現(xiàn) 40 株志賀氏菌的CRISPR 位點(diǎn)中存在516 條間隔序列，其序列長(zhǎng)度呈高度統(tǒng)一，29 bp 長(zhǎng)度的重復(fù)序列與32 bp 長(zhǎng)度的間隔序列相匹配，27 bp 長(zhǎng)度的重復(fù)序列與69 bp 長(zhǎng)度的間隔序列相匹配，39 bp 長(zhǎng)度的重復(fù)序列與49 bp 長(zhǎng)度的間隔序列相匹配。將一個(gè)重復(fù)序列和一個(gè)與之相鄰的間隔序列稱為一個(gè)重復(fù)單元，統(tǒng)計(jì)表明40 株志賀氏菌中重復(fù)單元序列長(zhǎng)度基本在100 bp 以下，因此大膽假設(shè)在CRISPR 位點(diǎn)附近存在這樣的基因——它擁有能夠嚴(yán)格調(diào)控重復(fù)單元長(zhǎng)度的功能。

圖2 志賀氏菌相關(guān)序列進(jìn)化樹Fig.2 The termination-associated sequences of repeats

在INTEGRALL 上對(duì)這些間隔序列比對(duì)分析，無(wú)法查找到完全對(duì)應(yīng)的可移動(dòng)遺傳元件，而大部分間隔序列中存在長(zhǎng)度為12～15 bp 的序列，可以發(fā)現(xiàn)與其相對(duì)應(yīng)的來(lái)源于其它菌株的基因片段序列，比如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列、耐藥基因等可移動(dòng)基因元件[1]。在鮑氏志賀氏菌Sb227的CRISPR 中的間隔序列就有一段15 bp 的基因序列與克雷白氏肺炎桿菌中的質(zhì)粒pRBDHA|pspB 有一定的同源性，在痢疾志賀氏菌BU53M1 的CRISPR 結(jié)構(gòu)中的第2 個(gè)間隔序列就和硫堿弧菌屬HL-EbGR7 的整合酶基因IntI 24 有一定的同源基因，在鮑氏志賀氏CDC 3083-94 的CRISPR 結(jié)構(gòu)中的第3 段間隔序列中有13bp 的基因序列與大腸桿菌的轉(zhuǎn)座酶基因TnpR 具有一定的同源性。仍然存在某些間隔序列無(wú)法查找出與其同源的基因，也許是當(dāng)前INTEGRALL 數(shù)據(jù)庫(kù)中可移動(dòng)遺傳原件的相關(guān)數(shù)據(jù)還不是十分完整，也有可能是外源基因進(jìn)入該菌株后發(fā)生了堿基突變。

上述試驗(yàn)證明間隔序列中的一部分序列與其它菌種中的一些可移動(dòng)基因原件有一定的同源性，對(duì)同種細(xì)菌的不同株細(xì)菌而言，其間隔序列可能不存在同源性，這可能與同種細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境不同有關(guān)。生長(zhǎng)環(huán)境的不同決定了其CRISPR 位點(diǎn)結(jié)構(gòu)之間的差異。志賀氏菌和大腸桿菌之間關(guān)于CRISPR 位點(diǎn)的相同性和特異性尚待探索。一些間隔區(qū)與幾種已知的質(zhì)粒和細(xì)菌序列相關(guān)，而其它的甚至沒有已知的序列，這大概反映了未識(shí)別的噬菌體，質(zhì)?；蚣?xì)菌序列。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在CRISPR 位點(diǎn)的上游端也許含有一段前導(dǎo)序列，其長(zhǎng)度約在300～500 bp 之間。通過(guò)多重序列對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在CRISPR1-3，CRISPR-Q1～Q4 結(jié)構(gòu)的5'側(cè)翼區(qū)的1 000 bp 序列中出現(xiàn)較多的AAAAA 和TTTT 結(jié)構(gòu)，同時(shí)堿基突變較多，表明此區(qū)域基因移動(dòng)頻繁，與基因的啟動(dòng)調(diào)控有關(guān)[10]。

圖3 鮑氏志賀氏菌227 和痢疾志賀氏菌197 CRISPR 位點(diǎn)中間隔序列同源性序列分析Fig.3 The spacer homologous sequence analysis of Shigella boydii str.227 and Shigelladysenteriae str.197

2.4 CRISPR 位點(diǎn)與RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的相關(guān)性分析

之前研究表明CRISPR 重復(fù)序列可能形成穩(wěn)定的發(fā)夾形狀的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，部分具有回文性質(zhì)。通過(guò)RNAFold Web 檢測(cè)每個(gè)CRISPR 位點(diǎn)重復(fù)序列的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)最小自由能（MFE）。

圖4 重復(fù)序列的Weblogo 和其RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 The Weblogo and secondary structure of repeats

由圖4a 可知，CRISPR1 和CRISPR2 位點(diǎn)的熱力學(xué)系最小自由能△G=-14.45 kcal/mol，CRISPR3位點(diǎn)的熱力學(xué)最小自由能△G=-8.71 kcal/mol。由圖4b 可得，CRISPR-Q1 中第1 個(gè)和末端重復(fù)序列之間的差異是明顯的，CRISPR-Q2，CRISPR-Q3和CRISPR-Q4 中的第1 個(gè)和末端重復(fù)之間沒有差異。熱力學(xué)集合的自由能△G=-14.75，-21.33，-9.76 和-17.92 kcal/mol。RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)在每個(gè)末端由環(huán)組成，莖在6～12 bp 之間，其中CRISPR-Q2的MFE（△G = -21.330 kcal/mol）大于其它CRISPR（P ＜0.05），而CRISPR2 的MFE（△G =-8.71 kcal/mol）是7 個(gè)CRISPR 位點(diǎn)中最小的，表明由于莖中堿基對(duì)數(shù)目較多，其二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)間隔序列數(shù)量與質(zhì)粒數(shù)量的相關(guān)性分析

如表3所示，對(duì)40 株志賀氏菌的重復(fù)和間隔序列數(shù)以及平均質(zhì)粒數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)共含有67個(gè)質(zhì)粒，平均含有1.7 個(gè)質(zhì)粒，其中有的菌株不含質(zhì)粒，有的菌株中高達(dá)7 個(gè)質(zhì)粒。6 株鮑氏志賀氏菌的平均質(zhì)粒個(gè)數(shù)為1 個(gè)，5 株痢疾志賀氏菌的平均質(zhì)粒數(shù)為0.6 個(gè)，18 株福氏志賀氏菌平均有1.33 個(gè)質(zhì)粒，11 株宋內(nèi)氏志賀氏菌的平均質(zhì)粒數(shù)為3.2 個(gè)，且均具有結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)（Conjugation Transfer）。分析志賀氏菌CRISPR 位點(diǎn)和質(zhì)粒的相關(guān)性后，未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒數(shù)與其有很大的關(guān)聯(lián)度，重復(fù)間隔序列多的菌株質(zhì)粒數(shù)并不一定多，反之亦成立。從相關(guān)性分析上無(wú)法得到間隔序列越多質(zhì)粒越少或越多的結(jié)論。通過(guò)其它文獻(xiàn)了解到質(zhì)粒是一個(gè)復(fù)雜的可移動(dòng)基因元件，需要通過(guò)繪制質(zhì)粒圖譜做進(jìn)一步的研究，這也是今后需要研究的方向。

表3 4 類志賀氏菌的重復(fù)間隔序列數(shù)與平均質(zhì)粒數(shù)Table3 The number of repeat interval and the average number of plasmid of 4 kinds of Shigella

3 討論

志賀氏菌是人類患病的重要病原體，細(xì)菌性痢疾是由志賀氏菌引起的一種急性腸道傳染病，在世界各地仍是一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題，造成了極大的經(jīng)濟(jì)上的重負(fù)，特別是在發(fā)展中國(guó)家已經(jīng)成為一個(gè)重大的健康威脅[5，11]。

CRISPR 簇是一個(gè)特殊DNA 重復(fù)序列家族，存在于細(xì)菌和古生菌基因組中，可作為防御外源遺傳物質(zhì)的“基因武器”[12]。在40%的已測(cè)序細(xì)菌和90%的已測(cè)序古生菌中存在CRISPR。CRISPR序列是由許多的重復(fù)序列區(qū)（repeat）和間隔序列區(qū)（spacer）組成，重復(fù)序列區(qū)保守，存在回文結(jié)構(gòu)，能夠形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)[13]，而間隔區(qū)是被細(xì)菌俘獲的外源DNA 序列。前導(dǎo)區(qū)域（leader）位于序列上游，作為CRISPR 序列的啟動(dòng)子[14]。在CRISPR 上游還有一個(gè)多態(tài)性的家族基因，該基因編碼的蛋白和CRISPR 序列區(qū)域一起發(fā)揮作用，被命名為CRISPR 關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated，cas）。當(dāng)前人們研究發(fā)現(xiàn)了cas1-cas10 等多種類型的cas 基因。cas 基因與CRISPR 序列共同進(jìn)化，在細(xì)菌中形成了高度保守的CRISPR/Cas 系統(tǒng)。

CRISPR 系統(tǒng)是細(xì)菌用以抵御外源移動(dòng)基因原件侵襲的免疫系統(tǒng)，其中CRISPR/Cas9 是一個(gè)新興的極具研究?jī)r(jià)值的基因編輯工具[15]。CRISPR系統(tǒng)可以抑制攜帶耐藥基因的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等外源基因的入侵，進(jìn)而防止耐藥基因在細(xì)菌種間的水平傳播，特別是致病細(xì)菌之間的傳播，對(duì)臨床治療和畜牧業(yè)意義重大。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)志賀氏菌的CRISPR 位點(diǎn)進(jìn)行分析，掌握志賀氏菌中CRISPR 位點(diǎn)的分布情況及結(jié)構(gòu)等信息，分析推測(cè)CRISPR 和外源質(zhì)粒之間的聯(lián)系，結(jié)果顯示間隔序列與許多耐藥基因和整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒間的同源性程度不同。

目前已確認(rèn)一些志賀氏菌的CRISPR 位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。本研究中對(duì)志賀氏菌CRISPR 結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析可能為闡明志賀氏菌CRISPR 結(jié)構(gòu)的功能提供信息。根據(jù)在CRISPRs Database 上得到的有效信息，志賀氏菌中的CRISPR 包括確定位點(diǎn)和可疑位點(diǎn)，以及獨(dú)特的間隔區(qū)域。間隔物形成的機(jī)制將為分析間隔物功能提供線索。在第1 個(gè)和最后1 個(gè)重復(fù)之間的基數(shù)差異CRISPR1～3 將直接影響RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[3]。

志賀氏菌中的一些CRISPR 位點(diǎn)高度保守，除CRISPR-Q1 外，可疑的CRISPR 僅包含兩個(gè)及兩個(gè)以下的間隔序列，這些間隔序列具有90%的相似性[10]。CRISPR-Q1 不太活躍，被認(rèn)為是古生菌株的象征。這些研究數(shù)據(jù)并沒有顯示CRISPR 作為志賀氏菌屬免疫系統(tǒng)的組成成分之一，而CRISPR-Q1 中的間隔序列的數(shù)目和是否存在CRISPR1 和CRISPR2 可能是與間隔物的其它特征相關(guān)聯(lián)。CRISPR-Q1 中的多個(gè)間隔區(qū)域在一些區(qū)域中表明CRISPR-Q1 可能參與CRISPR1 或CRISPR2 的功能[4]。

根據(jù)對(duì)cas 基因的分析，發(fā)現(xiàn)40 株志賀氏菌的cas 基因排列順序統(tǒng)一性極高，cas3 基因與重復(fù)序列一樣也具有相似的保守性，這和先前文獻(xiàn)[16]報(bào)道相一致。這表明在進(jìn)化過(guò)程中志賀氏菌也面臨著相似的選擇壓力。前導(dǎo)序列在同種細(xì)菌中保守性不是很強(qiáng)，堿基突變或堿基缺失現(xiàn)象易發(fā)生，說(shuō)明前導(dǎo)序列基因比較活躍，推測(cè)其與啟動(dòng)CRISPR 基因表達(dá)有關(guān)[17]。對(duì)間隔區(qū)序列進(jìn)行分析，雖然在Integrall 數(shù)據(jù)庫(kù)中不能找到與間隔序列完全匹配的序列，但能找到相關(guān)序列與間隔序列中部分序列完全匹配，同時(shí)這些序列多數(shù)來(lái)源于質(zhì)粒、噬菌體、耐藥基因、整合子和轉(zhuǎn)座子[18]。這說(shuō)明志賀氏菌的CRISPR 系統(tǒng)能抵御外源基因的侵襲，尚未發(fā)現(xiàn)CRISPR 位點(diǎn)數(shù)量與質(zhì)粒數(shù)量以及間隔序列數(shù)量與質(zhì)粒數(shù)量之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性[19]。作者預(yù)測(cè)該情況是因質(zhì)粒類型的不同，也許是因一些質(zhì)粒具有抵抗CRISPR 結(jié)構(gòu)的能力所致，這需要對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行更深入的研究。