白酒中兩種萜烯類化合物的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性

張 倩，朱婷婷，黃明泉，魏金旺,*，吳繼紅，霍嘉穎

（1.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048;2.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301）

白酒作為中國(guó)的國(guó)酒，具有悠久的歷史，在中國(guó)傳統(tǒng)文化中占有獨(dú)特的地位[1]。白酒中的風(fēng)味成分僅占總質(zhì)量的2%～3%[2]，但種類繁多，目前在白酒中檢測(cè)到的微量化合物已超過(guò)2 000 種[3]。這些微量化合物是構(gòu)成白酒獨(dú)特風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中很多是功能性組分[4-8]。結(jié)合中外對(duì)飲酒與健康的研究，適量飲用白酒對(duì)人體健康有益。當(dāng)前黨中央和國(guó)務(wù)院制定了“健康中國(guó)”的發(fā)展戰(zhàn)略，向健康白酒發(fā)展是中國(guó)白酒發(fā)展的新趨勢(shì)[9]，但白酒中功能性組分對(duì)人體健康作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是機(jī)體正常代謝產(chǎn)物[10]，ROS濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，機(jī)體內(nèi)累積過(guò)多的ROS會(huì)造成多種疾病。正常情況下，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在著抗氧化防御系統(tǒng)，另外，膳食補(bǔ)充抗氧化活性物質(zhì)對(duì)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的ROS、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡具有重要意義，尤其是機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，補(bǔ)充外源性抗氧化劑尤其重要[11-13]。萜烯類化合物是一類廣泛存在于植物、動(dòng)物體內(nèi)的碳?xì)浠衔颷14]。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的萜烯類化合物在白酒中不斷檢測(cè)出，清香型與醬香型白酒中共檢測(cè)到69 種，包括萜烯醚、萜烯醇、萜烯酮、萜烯醛和萜烯酯[15-16]，在濃香型白酒中檢測(cè)到30 種[17]、藥香型白酒中檢測(cè)到52 種[18]，其中藥香型董酒中萜烯含量較高，主要原因是董酒的特殊百草入曲釀制工藝[19]。另外在醬香型、濃香型和清香型原酒、酒醅及大曲中也均檢測(cè)到萜烯類化合物[15,17-18]。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，萜烯具有抗氧化活性。2012年Bourgou等[20]從精油中分離出4 種萜類化合物，通過(guò)氧自由基吸收能力測(cè)試證明其體外抗氧化活性。2019年Wang等[21]對(duì)葡萄酒中7 種主要萜類化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)0.4～8.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍的萜類化合物具有抗菌活性，6.25～50.00 mg/mL萜類化合物具有抗氧化活性，認(rèn)為其可作為食品工業(yè)天然抗菌劑和抗氧化劑的新潛在來(lái)源。萜烯化合物中的雙環(huán)倍半萜類β-石竹烯（β-caryophllene alcohol，BCP）具有重要的功能作用，如2018年Ames-Sibin等[22]證明215 mg/L和430 mg/L BCP可抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng);2019年Aguilar-ávila等[23]的研究表明10 mg/kg BCP可減弱神經(jīng)性疼痛。無(wú)環(huán)萜類香葉基丙酮（geranylacetone，GAT）也具有功能活性，2019年Schepetkin等[24]發(fā)現(xiàn)植物精油中含有的GAT可調(diào)節(jié)人體嗜中性粒細(xì)胞的反應(yīng)。雖然已有研究表明BCP和GAT具有功能活性，但所研究的劑量水平都遠(yuǎn)高于白酒中的水平，目前為止鮮有對(duì)白酒中、低質(zhì)量濃度下BCP和GAT抗氧化作用的研究。

作為我國(guó)北方清香型的代表白酒之一，牛欄山二鍋頭酒以清香純正、入口醇甜爽凈、酒體協(xié)調(diào)、尾凈香長(zhǎng)的特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛(ài)[25]。本研究利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（head space solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對(duì)13 種牛欄山二鍋頭原酒中的微量萜烯化合物進(jìn)行定性定量分析，同時(shí)按酒中劑量范圍，利用2,2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷模型探究其細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，以期為健康白酒的進(jìn)一步研究與發(fā)展提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13 種牛欄山二鍋頭原酒，3 種商品酒（十五年珍品二鍋頭（52度）、百年二鍋頭（45度）、百年紅牛欄山（52度）由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠提供，于4 ℃保存。

BCP、GAT、L-乙酸薄荷酯（色譜純，純度＞98.0%）北京百靈威科技有限公司;NaCl、濃鹽酸（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HepG2細(xì)胞 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基 美國(guó)Corning公司;0.25%胰蛋白酶 美國(guó)Gibco公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 上海源葉生物科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8 日本Dojindo公司;胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、AAPH、抗生素、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、乙醇（高效液相色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;RIPA細(xì)胞溶解緩沖液 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）和總蛋白檢測(cè)試劑盒 南京建成生物技術(shù)研究所;ROS、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所;無(wú)菌去離子水 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司;BL-2200H電子分析天平 島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司;精密酒精計(jì) 河間市黎民居玻璃儀表廠;MPS 2XL固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣器 德國(guó)Gerstel公司;50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）自動(dòng)固相微萃取頭美國(guó)Supelco公司;7890B-5977A GC-MS聯(lián)用儀、DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱 美國(guó)Agilent公司;PSHJ-5雷磁pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;CCL-170B-8細(xì)胞培養(yǎng)箱 新加坡ESCO科技有限公司;Costar 96 孔板美國(guó)Corning公司;SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Molecular Devices公司;TGL-20B-C高速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME萃取樣品

樣品處理：用飽和氯化鈉溶液稀釋酒樣至乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，取8.0 mL于20 mL頂空瓶中，并加入10.0 μL內(nèi)標(biāo)（L-乙酸薄荷酯，終質(zhì)量濃度5.02 μg/L），混勻后進(jìn)行自動(dòng)HS-SPME結(jié)合GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣氦氣流速：1.5 mL/min;不分流進(jìn)樣;色譜柱DB-FFAP（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。

MS條件：電子電離源（electron ionization，EI），電子轟擊能量70 eV;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度150 ℃;傳輸線溫度與最終柱溫箱的溫度保持一致;全掃描模式，質(zhì)量范圍m/z35～450。

1.3.3 SPME分析條件

參考范文來(lái)等[18]的方法，分析條件為：固相萃取頭涂層DVB/CAR/PDMS，膜厚度50/30 μm;樣品在50 ℃下預(yù)熱5 min后，將SPME纖維頭插入酒樣上方，50 ℃下吸附萃取45 min。萃取后，將SPME纖維頭迅速插入GC-MS進(jìn)樣口中，于250 ℃解吸5 min，采用全掃描模式。

1.3.4 定性定量分析

萜烯類化合物的定性主要結(jié)合質(zhì)譜、標(biāo)準(zhǔn)物比對(duì)定性。

通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量：先用飽和氯化鈉溶液稀釋無(wú)水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為10%，再用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使之與酒樣稀釋后的pH值一致，作為模擬酒樣。將標(biāo)準(zhǔn)化合物BCP和GAT溶解于模擬酒樣以制備已知質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后梯度稀釋成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取8.0 mL于20 mL頂空瓶中，并加入20.0 μL終質(zhì)量濃度為5.02 μg/L的內(nèi)標(biāo)物（L-乙酸薄荷酯），依次對(duì)各梯度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行頂空固相微萃取，采用選擇離子法掃描進(jìn)行測(cè)定。最后，以待測(cè)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度比為縱坐標(biāo)，建立內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 體外細(xì)胞模型法評(píng)價(jià)萜烯類化合物的抗氧化活性

1.3.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%血清、50 μg/mL抗生素的DMEM培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，該細(xì)胞屬于單層貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁達(dá)到90%時(shí)，使用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，每2～3 d進(jìn)行一次傳代。取對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.2 萜烯化合物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

為避免萜烯化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品濃度，先將細(xì)胞接種到Costar 96 孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3 次，樣品組加入100 μL不同質(zhì)量濃度的萜烯化合物，對(duì)照組加入相同體積的無(wú)FBS培養(yǎng)液，每組設(shè)置4 個(gè)平行，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：As、Ab、Ac分別為樣品組、對(duì)照組、CCK-8對(duì)照組吸光度。

1.3.5.3 萜烯化合物對(duì)AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞中ROS的影響

將細(xì)胞接種到Costar 96 孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)為4 組，分別為空白組、樣品組、AAPH組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組設(shè)4 個(gè)平行。清洗細(xì)胞后，每孔加入100 μL 10 μmol/L DCFH-DA溶液，在培養(yǎng)箱中孵育20 min后，用無(wú)FBS培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，以除去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，之后樣品組加入100 μL不同質(zhì)量濃度GAT和BCP，AAPH組和空白組加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)20 min后取出，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3 次后，將100 μL 200 μmol/L AAPH溶液加入樣品組和AAPH組，同時(shí)向空白組加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h后取出，利用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定吸光度[26]。陽(yáng)性對(duì)照組處理較為簡(jiǎn)單，加入10 μmol/L DCFH-DA溶液培養(yǎng)并清洗細(xì)胞后，加入100 μL 1∶1 000稀釋的Rosup，于培養(yǎng)箱中孵育0.5 h后測(cè)定熒光吸光度，其中Rosup為ROS檢測(cè)試劑盒中的ROS陽(yáng)性對(duì)照試劑，Rosup是一種混合物，在較短時(shí)間內(nèi)刺激細(xì)胞可顯著提高ROS水平。

1.3.5.4 萜烯化合物對(duì)氧化損傷細(xì)胞內(nèi)MDA含量和抗氧化酶活性的影響

將細(xì)胞接種到Costar 24 孔板中，每孔加入1.0 mL細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為3 組，分別為空白組、樣品組和AAPH組（此評(píng)價(jià)指標(biāo)的抗氧化實(shí)驗(yàn)未設(shè)置其他陽(yáng)性對(duì)照組，AAPH組即為陽(yáng)性對(duì)照組：細(xì)胞經(jīng)過(guò)AAPH誘導(dǎo)后，產(chǎn)生強(qiáng)烈氧化應(yīng)激，使細(xì)胞受到較大的氧化損傷，后同）。棄去培養(yǎng)液后，樣品組每孔加入600 μL不同質(zhì)量濃度GAT和BCP，空白組和AAPH組加入等體積的無(wú)血清培養(yǎng)液，孵育2 h后，棄去培養(yǎng)液并用PBS清洗3 次，樣品組和AAPH組每孔加入600 μL 200 μmol/L AAPH溶液以引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，空白組加入等體積的無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育3 h，棄去培養(yǎng)液并用PBS清洗3 次后，每孔加入150 μL 1.0 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，在4 ℃下裂解20 min，將裂解后的細(xì)胞在10 000×g條件下離心10 min，取上清液按照各試劑盒說(shuō)明書測(cè)定脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA和抗氧化酶（CAT、GSH-Px、SOD）活力。采用BCA試劑盒對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.5 萜烯化合物對(duì)氧化損傷細(xì)胞中GSH濃度的影響

將細(xì)胞接種到Costar 24 孔板中，每孔加入1.0 mL細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)為3 組，分別為空白組、樣品組和AAPH組。按照1.3.5.4節(jié)處理細(xì)胞，加入200 μmol/L AAPH溶液孵育清洗后，每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5 min 后，加入含血清培養(yǎng)基以終止消化，棄去上清液，收集孔板底部細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移至離心管，將試劑盒中的蛋白去除劑加入離心管，在-80 ℃和37 ℃條件下，迅速反復(fù)凍融3 次，以更好去除細(xì)胞內(nèi)蛋白。靜置5 min后，在10 000×g條件下離心10 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定GSH濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.3.5節(jié)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行4 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 17.0軟件中最小顯著性差異法進(jìn)行顯著性差異分析，柱形圖用Origin 8.5軟件繪制。通過(guò)Masshunter B.07.00軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛欄山二鍋頭酒中萜烯類化合物的確定

應(yīng)用HS-SPME-GC-MS法對(duì)13 種牛欄山二鍋頭原酒和3 種商品酒中的萜烯類化合物進(jìn)行測(cè)定，對(duì)GAT和BCP兩種化合物通過(guò)內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確定量，該方法能夠滿足白酒中痕量萜烯類化合物定量分析要求（表1）。由于β-大馬酮、β-杜松烯和反式-橙花叔醇無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品，單個(gè)化合物的相對(duì)含量采用其與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值的比進(jìn)行半定量分析，各萜烯類化合物的質(zhì)量濃度見(jiàn)表2、3。

表 1 牛欄山二鍋頭原酒中萜烯類化合物的定量參數(shù)Table 1 Quantitative parameters for terpenoids in Niulanshan Erguotou base Baijiu

與之前研究[27]相比，本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確定性定量的微量萜烯化合物有：GAT、BCP、β-大馬酮、β-杜松烯和反式-橙花叔醇，其中GAT為二鍋頭酒中首次檢出。從單個(gè)萜烯來(lái)看，牛欄山原酒及商品酒中的質(zhì)量濃度一般為一微克每升到幾百微克每升，這5 種萜烯類化合物中，原酒中GAT、BCP、β-大馬酮、β-杜松烯、反式-橙花叔醇平均質(zhì)量濃度分別為0.006 3、0.107 5、0.048 7、0.008 8、0.001 6 mg/L，商品酒中GAT、BCP及反式-橙花叔醇平均質(zhì)量濃度為0.006 8、0.117 5、0.001 9 mg/L。部分萜烯類化合物可能對(duì)清香型牛欄山二鍋頭風(fēng)味有貢獻(xiàn)。香氣活力值（odor activity value，OAV）可以表征化合物對(duì)酒體香氣的貢獻(xiàn)，OAV的計(jì)算方式是香氣化合物的濃度與該化合物閾值之比，當(dāng)某化合物的OAV≥1時(shí)，認(rèn)為該化合物對(duì)酒樣香氣有重要貢獻(xiàn)，且OAV越大，表明該化合物對(duì)酒體香氣的貢獻(xiàn)越大。β-大馬酮在體積分?jǐn)?shù)46%乙醇水溶液中的閾值僅有0.12 μg/L[27]，經(jīng)計(jì)算，13 種牛欄山原酒中β-大馬酮的平均OAV為406.25;BCP在純水中的閾值為64.00 μg/L[28]，其平均OAV為1.68，其余3 種萜烯化合物OAV均小于1，β-大馬酮呈蜂蜜味，BCP呈苔蘚味，這兩種萜烯化合物可能是牛欄山二鍋頭原酒中重要的香氣化合物。

表 2 牛欄山二鍋頭原酒中萜烯類化合物定量結(jié)果（n＝ 3）Table 2 Quantification of terpenoids in Niulanshan Erguotou base Baijiu (n= 3)mg/L

表 3 牛欄山二鍋頭商品酒中萜烯類化合物定量結(jié)果Table 3 Quantification of terpenoids in Niulanshan Erguotou commercial Baijiumg/L

2.2 體外細(xì)胞模型法評(píng)價(jià)萜烯類化合物的抗氧化活性分析結(jié)果

2.2.1 萜烯化合物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

圖 1 GAT質(zhì)量濃度對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effect of GAT concentration on viability of HepG2 cells

由圖1可以看出，隨著GAT質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞存活率整體呈下降趨勢(shì)。當(dāng)GAT質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率較空白組有顯著性降低（P＜0.05），但此時(shí)細(xì)胞存活率高于80%，可視為細(xì)胞正常存活[29]。當(dāng)質(zhì)量濃度不小于5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率明顯降低，HepG2細(xì)胞在此質(zhì)量濃度下已經(jīng)受到較大損傷，不可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。綜合考慮酒樣中GAT質(zhì)量濃度以及為了探究不同質(zhì)量濃度GAT的抗氧化作用，最終選擇0.005、0.025、0.05、0.5 mg/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2 BCP質(zhì)量濃度對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of BCP concentration on viability of HepG2 cells

由圖2可以看出，隨著B(niǎo)CP質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞存活率整體呈下降趨勢(shì)，直到BCP質(zhì)量濃度達(dá)到0.5、5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率較空白組顯著降低（P＜0.05），但此時(shí)細(xì)胞存活率高于80%，可視為正常細(xì)胞[29]。當(dāng)BCP質(zhì)量濃度不小于50 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低，HepG2細(xì)胞在此質(zhì)量濃度下已受到較大損傷?？紤]到酒樣中BCP質(zhì)量濃度以及高質(zhì)量濃度BCP可以更準(zhǔn)確探究其抗氧化作用，最終選擇0.05、0.5、5 mg/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.2 萜烯化合物對(duì)AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞中ROS的影響

AAPH是一種水溶性偶氮化合物，可以自發(fā)穩(wěn)定產(chǎn)生自由基[30]，其產(chǎn)生的自由基可誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)氧化損傷。細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化損傷，會(huì)導(dǎo)致其完整性受損，同時(shí)破壞細(xì)胞膜傳輸機(jī)制，增加細(xì)胞膜的通透性，使得AAPH可以輕易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，從而引起細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。因此可通過(guò)AAPH誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，由細(xì)胞內(nèi)ROS水平來(lái)反映其氧化損傷程度。針對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量，本研究選用細(xì)胞內(nèi)ROS熒光探針DCFH-DA法進(jìn)行測(cè)定。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可自由通過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下轉(zhuǎn)化為無(wú)熒光的DCFH，DCFH不能透過(guò)細(xì)胞膜，可被細(xì)胞內(nèi)的ROS進(jìn)一步氧化為具有熒光特性的DCF，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比[27]。最后采用熒光酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）處測(cè)定吸光度，通過(guò)各組熒光強(qiáng)度來(lái)確定影響效果。

圖 3 GAT對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig. 3 Effect of GAT on reactive oxygen species in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

圖 4 BCP對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig. 4 Effect of BCP on reactive oxygen species in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

如圖3、4所示，空白組未添加AAPH及樣品，細(xì)胞產(chǎn)生較低的ROS，經(jīng)過(guò)AAPH處理后細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，產(chǎn)生大量的ROS，熒光強(qiáng)度較空白組增加63.64%，經(jīng)不同質(zhì)量濃度GAT預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度分別降低36.28%、53.03%、67.62%、72.80%，經(jīng)低、中、高質(zhì)量濃度BCP處理后，ROS熒光強(qiáng)度分別降低62.90%、74.75%、86.91%。結(jié)果表明，經(jīng)不同質(zhì)量濃度GAT和BCP處理后細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05），與空白組相比也有顯著性差異（P＜0.05），且呈濃度依賴性，樣品組細(xì)胞中ROS的熒光強(qiáng)度甚至低于空白組，這表明這兩種萜烯化合物具有直接清除細(xì)胞內(nèi)ROS、防止細(xì)胞氧化損傷的作用。

2.2.3 萜烯化合物對(duì)氧化損傷細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響ROS過(guò)剩時(shí)會(huì)攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)，通過(guò)與多不飽和脂肪酸的雙鍵反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化并導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的積累。MDA在細(xì)胞內(nèi)的含量過(guò)高會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)影響其功能，進(jìn)而引起細(xì)胞代謝紊亂及功能障礙最終可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31]，因此MDA含量可以反映機(jī)體細(xì)胞氧化損傷程度。

圖 5 GAT對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 5 Effect of GAT on MDA content in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

圖 6 BCP對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 6 Effect of BCP on MDA content in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

如圖5、6所示，與空白組相比，AAPH組細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著增加（P＜0.05）。樣品組與AAPH組相比顯著降低（P＜0.05），GAT質(zhì)量濃度由低到高各組對(duì)MDA抑制率分別為70.11%、90.75%、95.37%、97.72%;BCP質(zhì)量濃度由低到高各組對(duì)MDA抑制率分別為95.14%、96.89%、98.44%。對(duì)于低質(zhì)量濃度的GAT（0.005、0.025 mg/L）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后，細(xì)胞內(nèi)MDA水平較空白組仍顯著升高，可能是由于GAT質(zhì)量濃度較低，無(wú)法將氧化損傷細(xì)胞內(nèi)MDA含量降至正常水平。曹光秀等[32]采用線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，發(fā)現(xiàn)BCP在較高劑量（102、306 mg/kg）作用下，皮質(zhì)中MDA含量降低，由此推斷出可能是由于BCP的抗氧化性對(duì)腦缺血再灌注大鼠具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)低質(zhì)量濃度GAT和BCP處理后細(xì)胞內(nèi)MDA含量都有所下降，表明這兩種萜烯化合物對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞具有保護(hù)作用，能夠維持細(xì)胞正常代謝。

2.2.4 萜烯化合物對(duì)氧化損傷細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響

細(xì)胞內(nèi)酶抗氧化系統(tǒng)包含SOD、GSH-Px、CAT等，用以清除外源進(jìn)入或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的各種ROS分子和自由基，從而維持機(jī)體的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體受到各種有害刺激時(shí)，自由基會(huì)大量產(chǎn)生，超出了抗氧化系統(tǒng)的清除能力就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，造成氧化損傷[33]。SOD可催化超氧陰離子自由基生成過(guò)氧化氫和氧，生成的過(guò)氧化氫繼續(xù)被CAT和GSH-Px兩種抗氧化酶催化生成水和氧[34]，從而降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，防止自由基對(duì)機(jī)體造成損傷[35]。

表 4 萜烯對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響Table 4 Effect of terpenoids on antioxidant enzyme activities in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

如表4所示，與空白組相比，AAPH組3 種抗氧化酶的活力均顯著性降低，SOD、GSH-Px、CAT活力分別降低45.88%、56.89%、66.99%，表明經(jīng)AAPH處理后，細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，激發(fā)了HepG2細(xì)胞內(nèi)酶氧化應(yīng)激。樣品組與AAPH組相比3 種酶活力有顯著性增加，不同質(zhì)量濃度GAT給藥組SOD活力增加84.46%～212.46%，GSH-Px活力增加128.01%～189.99%，CAT活力增加201.47%～490.20%。值得注意的是，添加0.005 mg/L GAT后，樣品組中3 種酶活力與空白組相比無(wú)顯著性差異（P＜0.05），本次研究中13 種牛欄山二鍋頭原酒、3 種商品酒中GAT的平均質(zhì)量濃度分別為0.006 34 mg/L和0.006 8 mg/L，結(jié)果表明酒中該化合物的劑量可以使氧化損傷細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性恢復(fù)到正常水平。經(jīng)不同質(zhì)量濃度組BCP處理后，SOD活力增加120.00%～320.92%，GSH-Px活力增加124.05%～247.91%，CAT活力增加217.65%～677.45%。牛欄山二鍋頭原酒及商品酒中BCP平均質(zhì)量濃度分別為0.107 5、0.117 5 mg/L，該質(zhì)量濃度可以顯著升高氧化損傷細(xì)胞內(nèi)抗氧化活力。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明GAT和BCP這兩種萜烯化合物對(duì)AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷具有一定的防護(hù)作用，除了通過(guò)直接清除ROS自由基而發(fā)揮抗氧化作用，還通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)抗氧化活力而發(fā)揮作用。這一點(diǎn)在很多文獻(xiàn)中亦有分析，黃娜娜[35]研究了柑橘精油對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞模型的氧化損傷恢復(fù)作用，認(rèn)為柑橘精油及活性成分能夠使GSH-Px、SOD、CAT的活力明顯提升，揭示了其可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶活力而發(fā)揮保護(hù)作用。

2.2.5 萜烯化合物對(duì)氧化損傷細(xì)胞中GSH濃度的影響

GSH作為細(xì)胞內(nèi)重要的非酶系統(tǒng)抗氧化劑，可用作自由基清除劑，通過(guò)維持細(xì)胞生長(zhǎng)的氧化還原穩(wěn)態(tài)而在氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[36]，當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí)，GSH會(huì)被氧化成GSSH，因此GSH的濃度變化可用以評(píng)估細(xì)胞氧化損傷情況[37]。

圖 7 GAT對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH濃度的影響Fig. 7 Effect of GAT on glutathione concentration in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

圖 8 BCP對(duì)AAPH氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH濃度的影響Fig. 8 Effect of BCP on GSH concentration in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

細(xì)胞在正常狀態(tài)下，GSH濃度較高，未加樣品進(jìn)行保護(hù)，只加AAPH損傷處理的HepG2細(xì)胞，與空白組相比顯著下降（P＜0.05），下降率達(dá)49.86%，經(jīng)萜烯類化合物預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度顯著增加，且呈濃度依賴性。GAT低質(zhì)量濃度組至高質(zhì)量濃度組GSH濃度增加率分別為22.59%、43.67%、66.50%、83.22%，經(jīng)高質(zhì)量濃度組GAT（0.5 mg/L）處理后的細(xì)胞中GSH濃度與空白組仍有顯著性差異，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞的氧化損傷并未完全消除。BCP低質(zhì)量濃度組至高質(zhì)量濃度組GSH濃度增加率分別為66.52%、87.08%、99.92%，經(jīng)高質(zhì)量濃度BCP（5 mg/L）處理后的細(xì)胞中GSH濃度與空白組無(wú)顯著性差異，此時(shí)細(xì)胞的氧化損傷得到抑制甚至消除。以上結(jié)果表明，經(jīng)GAT和BCP處理后的細(xì)胞能夠阻止細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降，保護(hù)細(xì)胞免受AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷。相似的結(jié)論在其他文獻(xiàn)中也有得出，Ojha等[38]將魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病大鼠模型經(jīng)BCP處理后，不僅能減少促炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，還能恢復(fù)谷胱甘肽的消耗，這說(shuō)明BCP因其強(qiáng)大的抗氧化性和抗炎活性能對(duì)由魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病提供神經(jīng)保護(hù)的作用。目前有研究表明，高質(zhì)量濃度下的BCP和GAT具有一定的抗氧化作用，例如：25 mg/kg BCP可以使多柔比星誘導(dǎo)的慢性心臟毒性大鼠體內(nèi)MDA水平降低，抗氧化酶（SOD、CAT）及GSH活性升高[23]、60 μmol/L GAT具有較強(qiáng)的自由基清除能力[39]。另外，BCP對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞的抗氧化作用可能依賴于大麻素受體2型[40]，GAT在極性溶劑中清除自由基的機(jī)制歸因于順序質(zhì)子損失電子轉(zhuǎn)移，與羰基官能團(tuán)附近的烯丙基和烷基氫的存在有關(guān)[39]。與之前研究不同，本實(shí)驗(yàn)選擇與白酒中BCP、GAT的實(shí)際質(zhì)量濃度相似的范圍，綜合多種抗氧化作用指標(biāo)證明了BCP和GAT在白酒劑量水平（低質(zhì)量濃度）下也發(fā)揮著較強(qiáng)的抗氧化作用，為中國(guó)白酒的健康發(fā)展提供了理論參考。

3 結(jié) 論

本研究利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)13 種牛欄山二鍋頭酒中的GAT和BCP進(jìn)行測(cè)定，其中GAT在二鍋頭酒中為首次發(fā)現(xiàn)。按酒中劑量范圍利用AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷模型探究抗氧化性，研究發(fā)現(xiàn)GAT和BCP能夠清除氧化損傷細(xì)胞內(nèi)ROS、提高機(jī)體內(nèi)非酶系統(tǒng)抗氧化劑GSH的濃度，通過(guò)提高SOD、GSH-Px、CAT的活性增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)酶抗氧化系統(tǒng)，同時(shí)還可以防止脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA含量的增加，提高細(xì)胞的抗氧化能力，其抗氧化能力呈濃度依賴性增加。這一結(jié)果可為中國(guó)白酒的健康特性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)GAT和BCP在牛欄山二鍋頭酒中的劑量下，可發(fā)揮抗氧化作用，而且此劑量水平未超過(guò)美國(guó)香料生產(chǎn)者協(xié)會(huì)的香料限制標(biāo)準(zhǔn)，符合食品安全法規(guī)，是一種有效的白酒抗氧化劑。白酒是中國(guó)人的日常飲品，GAT和BCP可能具有協(xié)同抗氧化作用。今后，明晰其來(lái)源及代謝途徑，借助微生物調(diào)控的途徑有效提高GAT和BCP在白酒中的含量，可能會(huì)更好地發(fā)揮其抗氧化性。本研究?jī)H表明在與白酒含量相同的劑量范圍內(nèi)GAT和BCP單體具有抗氧化作用，但白酒這一復(fù)雜混合體系的生理活性及作用劑量還需進(jìn)一步研究。