食品中葉酸測(cè)定方法的研究進(jìn)展

王博倫，顧豐穎，劉子毅，張 帆，劉 昊，楊婷婷，王 鋒*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

葉酸（folate）是一類水溶性的B族維生素，由蝶呤、對(duì)氨基苯甲酸和一個(gè)或多個(gè)谷氨酸組成（圖1），廣泛存在于果蔬和谷物中。葉酸是人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，有助于人體細(xì)胞分裂、分化與增殖，通過促進(jìn)神經(jīng)末梢的發(fā)育來保障人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育與運(yùn)轉(zhuǎn)，在碳代謝循環(huán)、核酸的合成以及氨基酸的代謝中起著十分重要的作用[1-2]。目前，攝入人工合成葉酸是常用的葉酸補(bǔ)充途徑，但合成葉酸的過量攝入會(huì)引起一些并發(fā)癥[3-4]，諸如掩蓋VB12缺乏的初期表現(xiàn)、干擾機(jī)體對(duì)鋅的吸收和抗驚厥藥物發(fā)揮作用等。因此近些年天然強(qiáng)化葉酸食品越來越受到世界各國(guó)的重視。

圖 1 常見葉酸形式化學(xué)結(jié)構(gòu)[7]Fig. 1 Chemical structure of folate[7]

食品是人體獲取膳食葉酸的主要來源。天然食品中的葉酸主要是以葉酸衍生物的形式存在[5]，最主要的天然葉酸形式包括[6]：5-甲酰四氫葉酸（5-formyltetrahydrofolate，5-HCO-H4PteGlun）、5-甲基四氫葉酸（5-methyltetrahydrofolate，5-CH3-H4PteGlun）、四氫葉酸（tetrahydrofolate，H4PteGlun）、葉酸（folic acid，PteGlun）（圖1）;不同葉酸衍生物又包含單谷氨酸形式和多聚谷氨酸形式的葉酸（表1），其中多聚谷氨酸通常包含2～14 個(gè)谷氨酸。天然食品中葉酸衍生物種類多，含量較低，而且不穩(wěn)定，容易在提取與測(cè)定過程中發(fā)生氧化降解或衍生物間相互轉(zhuǎn)化，在熱處理等條件下，5-HCO-H4PteGlun和5-CH3-H4PteGlun在轉(zhuǎn)化為10-甲酰四氫葉酸后（10-formyltetrahydrofolate，10-HCO-H4PteGlun），最終降解為蝶呤和對(duì)氨基苯甲酸，H4PteGlun在氧氣等作用下，直接降解為蝶呤和對(duì)氨基苯甲酸;不同食品樣品中基質(zhì)差異較大，易受到干擾物質(zhì)如有機(jī)酸、水溶性維生素和其他物質(zhì)的影響;某些食品中的葉酸常以蛋白質(zhì)或淀粉相結(jié)合的形式存在，結(jié)合態(tài)會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確性;對(duì)于人體，5-CH3-H4PteGlun的生物活性最高，易被吸收且可直接利用于甲基化循環(huán)中，其他形式葉酸需在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-CH3-H4PteGlun后才可被利用（圖2），攝入豐富5-CH3-H4PteGlun的食品中更有利于人體補(bǔ)充葉酸[1]。因此，如何準(zhǔn)確測(cè)定食品中總?cè)~酸、PteGlun及其各種衍生物的含量一直是葉酸研究領(lǐng)域的關(guān)鍵問題，同時(shí)也是葉酸研究過程中的難點(diǎn)與重點(diǎn)。本文介紹了食品中葉酸的提取步驟，總?cè)~酸、PteGlun及其衍生物含量測(cè)定的常見方法，為精準(zhǔn)測(cè)定各種食品中的葉酸種類及含量提供參考。

圖 2 葉酸在體內(nèi)代謝途徑[1]Fig. 2 Folate metabolism in the body[1]

表 1 食品中常見葉酸形式分類[7-8]Table 1 Folate forms commonly found in foods[7-8]

1 食品中葉酸的提取

食品中葉酸的分析測(cè)定包括葉酸的提取和儀器檢測(cè)兩方面。要建立穩(wěn)定可靠的葉酸測(cè)定體系，葉酸的提取十分重要，樣品中的PteGlun及其衍生物是否提取完全會(huì)直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。常用的葉酸提取與測(cè)定流程見圖3。葉酸對(duì)光較為敏感，在光照下尤其是在紫外照射的條件下會(huì)催化葉酸氧化，因此實(shí)驗(yàn)操作都應(yīng)在暗環(huán)境下進(jìn)行，提取與測(cè)定過程中的玻璃器具應(yīng)為棕色器具，盡量避免葉酸發(fā)生降解或衍生物間互相轉(zhuǎn)化。

圖 3 葉酸提取與測(cè)定的一般流程Fig. 3 General process of folate extraction and determination

1.1 樣品的浸提

樣品在粉碎過程應(yīng)始終處于低溫環(huán)境，低溫可降低葉酸氧化損失速率。樣品研磨時(shí)可在球磨儀中加入液氮。粉碎后的樣品與提取液接觸時(shí)，內(nèi)源酶活性會(huì)增強(qiáng)，可導(dǎo)致葉酸及其衍生物的降解或相互轉(zhuǎn)化，因此需立即進(jìn)行沸水浴，使內(nèi)源性酶失活。為避免提取過程中葉酸被氧化分解，提高提取與測(cè)定過程中葉酸的穩(wěn)定性，在提取液中加入質(zhì)量濃度為10 g/L的抗壞血酸和體積分?jǐn)?shù)為0.5%的β-巰基乙醇是目前常見方法[9]。Patring等[10]對(duì)樣品中的H4PteGlun進(jìn)行了提取測(cè)定，評(píng)價(jià)了β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、2,3-二巰基-1-丙醇和2-硫代巴比妥酸4 種抗氧化劑對(duì)樣品中H4PteGlun的保護(hù)效果，結(jié)果表明毒性較低的2,3-二巰基-1-丙醇對(duì)H4PteGlun的保護(hù)效果優(yōu)于毒性較高的β-巰基乙醇，低毒且效果更優(yōu)抗氧化劑的應(yīng)用前景更加廣泛;且緩沖液的選擇對(duì)葉酸的保護(hù)作用也有一定影響。前期本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)添加含硫化合物如大蒜素，也可以有效避免葉酸損失。

1.2 提取液的酶處理

酶處理是目前最常用的一種葉酸提取凈化方法，常使用α-淀粉酶、蛋白酶和葉酸軛合酶處理提取樣品。3 種酶對(duì)樣品處理時(shí)間、體系的溫度、pH值都會(huì)對(duì)提取效果產(chǎn)生很大影響[11]。根據(jù)酶的性質(zhì)，酶解溫度通常設(shè)置為37 ℃或在室溫條件下，酶處理時(shí)間范圍為30～120 min。

葉酸會(huì)與食品中的蛋白質(zhì)或淀粉結(jié)合，這種結(jié)合形態(tài)可增強(qiáng)葉酸在天然食品中的穩(wěn)定性，但不利于葉酸的分離提取。尤其對(duì)于淀粉含量較高的樣品，如玉米，在沸水浴滅酶后，樣品中淀粉會(huì)發(fā)生糊化現(xiàn)象，整個(gè)提取體系變得黏稠，無法進(jìn)行后續(xù)提取步驟。因此需利用蛋白酶和淀粉酶兩種酶聯(lián)合處理樣品，水解基質(zhì)中蛋白質(zhì)與淀粉，使葉酸與蛋白質(zhì)或淀粉分離，減少干擾物對(duì)測(cè)定準(zhǔn)確性的影響。此操作是提取過程中十分關(guān)鍵的一步。

圖1葉酸化學(xué)結(jié)構(gòu)中，谷氨酸與對(duì)氨基苯甲酸相連接，在天然食品中葉酸結(jié)構(gòu)常常是幾個(gè)谷氨酸形成的多肽短鏈與對(duì)氨基苯甲酸相連接。多尾形式的葉酸在總?cè)~酸中占有很大的比例，如三谷氨酸形式的葉酸和七谷氨酸形式的葉酸在食品中含量較高[12]。目前針對(duì)多尾形式葉酸的定量測(cè)定研究相對(duì)較少。測(cè)定食品中總?cè)~酸含量的微生物法，其所使用的鼠李糖乳桿菌只可測(cè)定出單尾形式的葉酸或含2～3 個(gè)谷氨酸尾的葉酸，對(duì)長(zhǎng)鏈的谷氨酸葉酸衍生物的響應(yīng)會(huì)低很多[13]。一般在測(cè)定總?cè)~酸含量或各葉酸衍生物含量時(shí)，通常使用葉酸軛合酶將多尾形式葉酸轉(zhuǎn)化為單尾形式的葉酸以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。常使用的葉酸軛合酶如大鼠血清、雞胰臟和豬腎臟等[10]，大鼠血清由于其方便制備、易購(gòu)買且其內(nèi)源性葉酸易被清除而被廣泛使用。

相關(guān)研究表明，蛋白酶、淀粉酶以及葉酸軛合酶的使用，可釋放與蛋白質(zhì)或淀粉結(jié)合的葉酸，轉(zhuǎn)化多尾形式葉酸為單尾形式葉酸，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確測(cè)定富含淀粉或蛋白食品中的葉酸含量[14]。許多研究已將酶解運(yùn)用到微生物法[15-16]和色譜法[17-18]測(cè)定葉酸的前處理環(huán)節(jié)。Martin等[19]在用微生物法測(cè)定食品中的葉酸含量時(shí)，同時(shí)使用蛋白酶、α-淀粉酶與軛合酶處理樣品，測(cè)得的葉酸含量顯著增加（最高達(dá)51%）;Aiso等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用三酶處理后，葉酸含量提升50%以上;Pandrangi等[20]運(yùn)用微生物法測(cè)定菠菜中的葉酸含量，優(yōu)化加酶量及pH值條件，葉酸測(cè)定量顯著提高。但三酶處理并不是對(duì)所有樣品均適用。對(duì)于蛋白或者淀粉含量低的樣品，僅僅添加葉酸軛合酶處理樣品便可;若添加蛋白酶或淀粉酶可能會(huì)導(dǎo)致樣品提取液中的葉酸含量測(cè)量值偏低，會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響[21]。Iwatani等[22]研究結(jié)果表明，三酶共同處理蔬菜類樣品后，葉酸含量測(cè)定值會(huì)有所降低。Zhang Heng等[23]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有無使用蛋白酶和淀粉酶對(duì)樣品進(jìn)行處理，其測(cè)定的葉酸含量基本一致。3 種酶是否添加及添加量需要依據(jù)樣品中干擾物質(zhì)含量進(jìn)行優(yōu)化，如淀粉含量較高的谷物類，需增大淀粉酶含量，適當(dāng)減少或不加入蛋白酶。

1.3 葉酸衍生物的形態(tài)轉(zhuǎn)化

在提取的過程中，Ndawa等[8]在測(cè)定前將食品中的PteGlun、5-HCO-H4PteGlun、H4PteGlun等葉酸衍生物簡(jiǎn)單、快速的轉(zhuǎn)化為5-CH3-H4PteGlun。這種方法可減少對(duì)各種葉酸衍生物的單獨(dú)分析過程，更快速地測(cè)定總?cè)~酸含量，為測(cè)定總?cè)~酸提供了新的思路。選擇轉(zhuǎn)化為5-CH3-H4PteGlun基于如下原因：5-CH3-H4PteGlun在酸性介質(zhì)中較為穩(wěn)定，且其具有天然熒光性，對(duì)液相色譜（liquid chromatography，LC）熒光檢測(cè)器響應(yīng)值高。此外，通過幾種化學(xué)反應(yīng)途徑能夠?qū)teGlun、5-HCOH4PteGlun和10-HCO-H4PteGlun轉(zhuǎn)化為5-CH3-H4PteGlun。對(duì)未經(jīng)解離的多谷氨酸形式葉酸此種轉(zhuǎn)換也很重要，可測(cè)得樣品中最初存在的不同尾數(shù)多谷氨酸形式葉酸含量，便于分析食品中葉酸的種類。

1.4 提取液的純化

樣品的純化是為了去除樣品中蛋白質(zhì)、淀粉水解產(chǎn)物等雜質(zhì)，防止雜質(zhì)干擾測(cè)定，同時(shí)富集樣品中的葉酸，使各種樣品葉酸提取液中葉酸含量在檢測(cè)限以上。對(duì)葉酸研究分析中常使用固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）或固定化葉酸結(jié)合蛋白親和色譜[24]對(duì)樣品進(jìn)行凈化。SPE是最常用的葉酸純化方法，通常使用強(qiáng)陰離子交換（strong anion exchange，SAX）固相萃取柱或C18固相萃取柱進(jìn)行提取液的純化[25-26]。Jastrebova等[27]運(yùn)用SAX凈化甜菜根葉酸提取液，凈化效果明顯，H4PteGlun回收率可達(dá)98.8%，5-CH3-H4PteGlun回收率可達(dá)103.6%，5-HCO-H4PteGlun回收率可達(dá)95.4%。葉酸結(jié)合蛋白親和色譜也可用于樣品提取液純化[28]，葉酸結(jié)合蛋白親和色譜特異性好，對(duì)PteGlun的結(jié)合能力強(qiáng)，回收率在78%以上[29]。但葉酸結(jié)合蛋白對(duì)5-HCO-H4PteGlun的親和力較低，這可能導(dǎo)致在純化步驟期間5-HCO-H4PteGlun的損失[30]。Zhang Guofang等[31]用簡(jiǎn)單且快速的超濾代替了固相萃取或親和柱純化葉酸的方法，在提取液進(jìn)行酶解、離心取上清液后，使用5 kDa截留膜超濾，除去植物提取物中存在的大部分聚合物。相關(guān)數(shù)據(jù)也表明葉酸不會(huì)殘留在膜上。此法與耗時(shí)的親和色譜及SPE凈化相比，更加簡(jiǎn)單、省時(shí)，但在LC前處理環(huán)節(jié)不太適用。

2 葉酸測(cè)定方法研究進(jìn)展

在過去幾年中，用于測(cè)定各種天然食品基質(zhì)中存在的不同形式的葉酸的分析技術(shù)取得一定進(jìn)展[6,32-36]。我國(guó)測(cè)定食品中葉酸含量的標(biāo)準(zhǔn)方法為微生物法，其適用范圍較廣，可測(cè)定樣品中總?cè)~酸含量，但無法單獨(dú)測(cè)定不同葉酸衍生物含量。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)，可應(yīng)用于測(cè)定食品中的PteGlun、5-HCO-H4PteGlun、5-CH3-H4PteGlun等葉酸衍生物的含量。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定食品中的葉酸近幾年也開始快速發(fā)展，其優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)快速測(cè)定出數(shù)種葉酸形式及不同尾數(shù)谷氨酸形式葉酸含量。熒光和電化學(xué)技術(shù)測(cè)定葉酸的發(fā)展也十分快速。

2.1 微生物法

微生物法測(cè)定結(jié)果代表食品中總?cè)~酸含量。通常所用的微生物有鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）及糞鏈球菌Streptococcus faecalis（ATCC 8043）。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中選用的微生物為鼠李糖乳桿菌。其原理為：葉酸是鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)必需物質(zhì)，培養(yǎng)基中如果缺乏葉酸則鼠李糖乳桿菌不能生長(zhǎng)。在此法中，鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)程度與培養(yǎng)基中所含有的葉酸量成正比關(guān)系，通過對(duì)培養(yǎng)基透光率的測(cè)定，根據(jù)葉酸含量與透光率的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中總?cè)~酸的含量[37]。此方法可適用于各類食品中葉酸的測(cè)定，并且靈敏度高，當(dāng)樣品中被測(cè)物量極少時(shí)，亦能測(cè)出;當(dāng)測(cè)定樣品為果蔬時(shí)，檢出限與定量限最低，檢出限為0.2 g/100 g，定量限為0.4 g/100 g。此法原理明確，操作較為簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜設(shè)備及儀器，因而被廣泛應(yīng)用。在最新的第17版Association of Official Analytical Chemists（AOAC）分析方法中，食品中葉酸的第一分析方法為微生物法;許多發(fā)達(dá)國(guó)家在分析食品營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，也采用微生物法測(cè)定葉酸含量。微生物法具有較高的靈敏度，但也存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，結(jié)果重復(fù)性差等局限性;而且此法測(cè)定的葉酸含量為單尾形式葉酸、二尾形式葉酸和三尾形式葉酸的總和，不能分別測(cè)定不同形態(tài)葉酸的含量。同時(shí)，生物體對(duì)不同葉酸形態(tài)的響應(yīng)并不總是相同的，如糞鏈球菌只能利用PteGlun、二氫葉酸（dihydrofolate，H2PteGlu）、H4PteGlun，測(cè)定時(shí)會(huì)導(dǎo)致一定的誤差。這也是微生物法正逐漸被其他簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法替代的主要原因[11]。

2.2 高效液相色譜法

HPLC法可準(zhǔn)確測(cè)定食品中PteGlun及其各種衍生物的含量。Englehardt等[38]率先開展液相色譜測(cè)定葉酸的研究，此后，液相色譜技術(shù)分析測(cè)定食品中的葉酸得到了迅速發(fā)展[39-40]。近年來，液相色譜法定性定量分析樣品中葉酸已變得十分普遍?；诓煌螒B(tài)葉酸與色譜柱親和能力的差異，利用流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行梯度洗脫，可將樣品中H4PteGlu、5-CH3-H4PteGlu、5-HCO-H4PteGlu、10-CHO-H4PteGlu、H2PteGlu、PteGlu等分離。

檢測(cè)器方面可使用紫外[41]、熒光檢測(cè)器[42-43]和二極管陣列檢測(cè)器[44]等。目前測(cè)定PteGlu、5-HCO-H4PteGlu常用紫外檢測(cè)器，其選擇性好、靈敏度高;測(cè)定5-CH3-H4PteGlun時(shí)，因其具備天然熒光性，常使用熒光檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器具備更低的檢測(cè)限，特別對(duì)復(fù)雜組分樣品中葉酸檢測(cè)方面更顯示其優(yōu)越性。郭麗瓊等[45]利用高效液相熒光檢測(cè)法測(cè)定柑橘中5-CH3-H4PteGlu的含量，檢測(cè)限為0.01 ng/mL。張毅[46]運(yùn)用HPLC二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定葉菜中PteGlu和5-CH3-H4PteGlu含量，PteGlu檢測(cè)限可低至2.3 ng/mL，定量限為10.0 ng/mL;5-CH3-H4PteGlu檢測(cè)限為0.1 ng/mL，定量限為0.3 ng/mL。

液相色譜法可對(duì)樣品提取液中的各類葉酸及其衍生物進(jìn)行分析，并且測(cè)定效果好，操作簡(jiǎn)便，近年來得到了廣泛的認(rèn)可[47]。但不足是LC法通常缺乏LC串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測(cè)定所具備的特異性、更高的靈敏度以及穩(wěn)定性，對(duì)提取液凈化程度要求較高。

2.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

LC-MS/MS法能夠測(cè)定食品中不同尾數(shù)的多聚谷氨酸形式的葉酸和不同形式的葉酸衍生物。已報(bào)道許多使用LC-MS/MS測(cè)定不同產(chǎn)品中葉酸的方法[48-50]。劉進(jìn)璽等[51]使用LC-MS/MS測(cè)定樣品中葉酸，在正離子選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行，以乙腈-0.1%甲酸溶液（5∶95，V/V）為流動(dòng)相，流速為0.25 mL/min，色譜柱溫度40 ℃，進(jìn)樣量2 μL;結(jié)果表明：回收率80.7%～89.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.90%～3.85%，檢出限1 ng/mL，線性范圍0.001～1.000 μg/mL。戴金鳳等[52]用HPLC-MS/MS測(cè)定了四棱豆中不同尾數(shù)的多聚谷氨酸形式的葉酸的含量，各種葉酸衍生物的檢測(cè)限范圍為40～1 133 fmol，定量限范圍為120～3 400 fmol，且發(fā)現(xiàn)四棱豆中多聚谷氨酸形式的葉酸的主要形式是五谷氨酸尾葉酸，占葉酸總量的65%;其次是單谷氨酸葉酸占30%。Tyagi等[30]用HPLC-MS/MS測(cè)定了番茄中不同葉酸衍生物的含量，PteGlu的檢測(cè)限為0.15 ng/mL，H4PteGlu檢測(cè)限為0.25 ng/mL，5-CH3-H4PteGlu檢測(cè)限為0.17 ng/mL，5-HCO-H4PteGlu檢測(cè)限為0.37 ng/mL;PteGlu的定量限為0.47 ng/mL，H4PteGlu的定量限為0.77 ng/mL，5-CH3-H4PteGlu的定量限為0.53 ng/mL，5-HCO-H4PteGlu的定量限為1.12 ng/mL。HPLC-MS技術(shù)的靈敏度較高，檢測(cè)周期短，可測(cè)定不同的多聚谷氨酸葉酸形式及含量[53]，并且樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，但是質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于定性，在定量準(zhǔn)確性方面低于LC，同時(shí)設(shè)備較貴。

2.4 熒光法

熒光法可測(cè)定食品或復(fù)合維生素制劑中PteGlu的含量。PteGlu具有特殊的吸收光譜特性，紫外光可將其轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒饣衔?。并且PteGlu的熒光強(qiáng)度與其含量成正比關(guān)系，此方法可用作PteGlu的定量。

邵麗華等[54]用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04%的高錳酸鉀對(duì)樣品進(jìn)行氧化，在370 nm激發(fā)波長(zhǎng)，443 nm發(fā)射波長(zhǎng)處用使用間接熒光法對(duì)小米中PteGlu含量進(jìn)行了測(cè)定，該法操作簡(jiǎn)單，且靈敏度高，重復(fù)性好。秦立俊[55]利用熒光法和間接原子吸收光譜法測(cè)定PteGlu，其線性范圍為0～1.6 μg/mL，檢出限為0.051 μg/mL，平均加標(biāo)回收率為97.1%。郭健等[56]利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定食品中的PteGlu，檢出限為0.05 μg/mL。熒光法目前無法同時(shí)分別測(cè)定樣品中葉酸及其衍生物的含量。

2.5 電化學(xué)法

近年來，在PteGlu的測(cè)定上，電化學(xué)法優(yōu)勢(shì)更加凸顯，與傳統(tǒng)方法相比，此方法的分析時(shí)間相對(duì)較短，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，成本低，檢測(cè)限低，非常適用于制藥、食品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用[57-58]。

趙玲[59]研究了PteGlu在鉑納米顆粒/多壁碳納米管修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為。采用差分脈沖法，測(cè)得還原峰電流與PteGlu濃度在2.0×10-7～1.0×10-4mol/L呈線性，線性相關(guān)系數(shù)r=0.997，檢出限為5.01×10-8mol/L，并且將此法成功運(yùn)用到葉酸片、菠菜、牛奶中的PteGlu定量測(cè)定。杜學(xué)萍[60]運(yùn)用基于聚中性紅/多壁碳納米管修飾玻碳電極測(cè)定PteGlu含量，電化學(xué)傳感器上的電流與樣品中PteGlu含量與在6.25×10-7～5.00×10-5mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為1.37×10-7mol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6。實(shí)驗(yàn)回收率在99.3%～103.2%。此方法中電極制備操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性高，具有一定的推廣性。

電化學(xué)法在測(cè)定中不需要分離提純，可以直接測(cè)定，受到很多分析工作者的追捧。電化學(xué)傳感器對(duì)PteGlu的測(cè)定十分靈敏，并且近年來研究人員發(fā)現(xiàn)修飾電極具有更高的電化學(xué)性能、更高的靈敏度和選擇性。調(diào)整修飾電極的尺寸和形態(tài)使得電化學(xué)裝置小型化，加速了電化學(xué)法在PteGlu測(cè)定領(lǐng)域的應(yīng)用與推廣[61-62]。但是目前多數(shù)測(cè)定方法針對(duì)目標(biāo)僅為PteGlu，對(duì)其他形式的葉酸測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道較少。

通過表2對(duì)比各檢測(cè)方法，微生物法測(cè)定葉酸操作簡(jiǎn)單，成本低，測(cè)定結(jié)果較為靈敏，但不足為實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，測(cè)定結(jié)果只能代表樣品中的總?cè)~酸含量，無法分別測(cè)定PteGlun及其衍生物含量;目前常用的HPLC法測(cè)定結(jié)果靈敏度高，也可分別定量樣品中葉酸及其衍生物，熒光檢測(cè)器對(duì)5-CH3-H4PteGlun測(cè)定優(yōu)勢(shì)明顯;LC-MS/MS可簡(jiǎn)便快速地定性樣品中葉酸及其衍生物，但相對(duì)液相色譜其準(zhǔn)確定量要差些，而且檢測(cè)成本較高;熒光和電化學(xué)檢測(cè)方法針對(duì)的葉酸形式較為單一，其并不能用于所有葉酸衍生物。

3 結(jié) 語(yǔ)

葉酸缺乏癥在全世界被公認(rèn)為一個(gè)保健問題，越來越多的人重視葉酸的攝入量;為保障葉酸的有效攝入量，有必要測(cè)定食品中不同形態(tài)葉酸衍生物的含量。本文概述了食品樣品中葉酸含量測(cè)定的常見前處理步驟及方法，對(duì)比了各種葉酸測(cè)定方法的優(yōu)劣。在提取環(huán)節(jié)，由于食品基質(zhì)復(fù)雜，尤其是谷物基質(zhì)和復(fù)配食物，提取液的純化難度較大，加之葉酸天然的不穩(wěn)定性，樣品中葉酸的無損提取一直是葉酸分析測(cè)定的難點(diǎn);在測(cè)定環(huán)節(jié)中，由于葉酸形態(tài)多樣，微生物法、HPLC、LC-MS/MS、熒光和電化學(xué)檢測(cè)法對(duì)葉酸的測(cè)定各有利弊，因此需要根據(jù)不同測(cè)定目的和測(cè)定目標(biāo)，選用適宜檢測(cè)方法。隨著分離提純以及檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信食品中葉酸的精準(zhǔn)測(cè)定方法會(huì)得到了更多的關(guān)注。

表 2 各種葉酸測(cè)定方法對(duì)比Table 2 Comparison of folate detection methods