黃艷燕，王 升，馮 濤，唐智慧，莫君明,4**

(1.廣西科學(xué)院，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530007；2.南寧龐博生物工程有限公司，廣西南寧 530004；3.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530006； 4.南寧穗肽生物技術(shù)有限公司，廣西南寧 530006)

0 引言

大米是全球范圍內(nèi)種植的主要糧食之一，大米中所含的蛋白質(zhì)是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)谷類(lèi)蛋白，大米蛋白氨基酸組成合理，含有人體所需多種氨基酸，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。目前大米蛋白主要被加工成高蛋白粉、蛋白胨和大米蛋白發(fā)泡粉等產(chǎn)品[2]。另外，大米蛋白是低抗原性蛋白質(zhì)，過(guò)敏性低，適用作易過(guò)敏人群和嬰幼兒的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑[3]。同時(shí)，大米蛋白的保健功能也受到很多研究者的關(guān)注，比如大米蛋白能預(yù)防糖尿病、高血壓等慢性疾病[4]。但是由于大米蛋白溶解性較差，導(dǎo)致其乳化性、膠凝性等性質(zhì)不佳，進(jìn)而影響大米蛋白在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用[5]。

為改善大米蛋白的功能性質(zhì)，目前常用物理法、化學(xué)法或酶法對(duì)大米蛋白進(jìn)行改性，主要以溶解度、乳化性和起泡性等性質(zhì)的提升為目標(biāo)[6]。物理法改性成本低、毒副作用小，但是改性效果不明顯，提取率低[7]。化學(xué)法改性應(yīng)用最為廣泛，對(duì)大米蛋白的功能性質(zhì)有較大改善，但缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)破壞蛋白質(zhì)的原有營(yíng)養(yǎng)特性，且存在化學(xué)試劑殘留的隱患[8]。酶法改性專(zhuān)一性高、反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境的污染小、適合工業(yè)化生產(chǎn)、水解產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是目前研究的熱點(diǎn)[9]，如汪洋等[10]研究中性蛋白酶制備大米蛋白抗氧化肽的酶解工藝。但是目前酶法水解大米蛋白的研究主要集中在考察蛋白質(zhì)的水解度和蛋白肽的抗氧化活性，其中大多數(shù)研究的蛋白水解度不高(<30%)[5，11-12]，且不涉及蛋白質(zhì)提取率。對(duì)工業(yè)生產(chǎn)而言，水解度和蛋白質(zhì)提取率都是生產(chǎn)中決定產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)成本的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以大米蛋白粉為原料，采用大米蛋白水解酶對(duì)大米蛋白進(jìn)行酶解，以水解度和蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)條件，為酶解制備可溶性大米蛋白肽的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

大米蛋白粉(粗蛋白質(zhì)70%)，大海糧油工業(yè)(防城港)有限公司生產(chǎn)；大米蛋白水解酶(為木瓜酶、風(fēng)味酶和堿性酶的復(fù)合物，8 000 U/g——在一定的條件下，每分鐘水解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸所需的酶量，為 1 個(gè)酶活力單位U)，南寧穗肽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；其他試劑，國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；DELTA320型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；RD-50GAT型臺(tái)式離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)；KDN-1型凱氏定氮儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 大米蛋白粉的酶法水解

稱(chēng)取大米蛋白粉10 g，加入100 mL蒸餾水，用0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)至酶的最適pH值，加入一定量的水解酶，在預(yù)定溫度的水浴鍋中恒溫酶解，達(dá)到酶解時(shí)間后，于沸水中水浴15 min使酶失活，自然冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定游離氨基氮的含量和總氮含量，并計(jì)算大米蛋白的水解度和蛋白質(zhì)提取率。

1.3.2 大米蛋白水解度和蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算

游離氨基氮的測(cè)定采用甲醛電位滴定法，總氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法。

大米蛋白水解度=氨氮/總氮×100%，蛋白質(zhì)提取率=酶解液的粗蛋白質(zhì)/原料的粗蛋白質(zhì)×100%。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

設(shè)定初始水解條件：酶添加量2.0%(W∶W)，pH值為8，溫度60℃，酶解時(shí)間9 h。在此基礎(chǔ)上分別改變酶添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)，pH值(6，7，8，9，10)，溫度(40，50，60，70，80℃)，酶解時(shí)間(3，6，9，12，15 h)，測(cè)定大米蛋白的水解度和蛋白質(zhì)提取率。

1.3.4 響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以大米蛋白水解度和蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，選取酶添加量、溫度、pH值、酶解時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定大米蛋白水解的最優(yōu)條件。實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表

Table 1 Coding table of factors and levels used in Box-Behnken test design

水平Level因素Factors溫度Temperature(℃)酶添加量Enzyme addition (%)pH值pH value時(shí)間Time (h)-1501.5760602.0891702.5912

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶添加量對(duì)大米蛋白水解度和提取率的影響

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，大米蛋白的水解度和蛋白質(zhì)提取率均有提高，當(dāng)酶添加量達(dá)到2.0%之后，水解度和提取率增幅較小。這是由于酶作為一種催化劑，濃度的提高可以加快反應(yīng)速度，但是在酶添加量達(dá)到一定限度時(shí)，酶在底物表面的作用已達(dá)到飽和，而底物上可供酶切割的位點(diǎn)有限，多出的酶不能在底物上起作用[13]，因此水解度趨于平衡。從成本的角度考慮，初步確定酶添加量為2.0%較為合適。

圖1 酶添加量對(duì)水解度和提取率的影響

Fig.1 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

2.1.2 溫度對(duì)大米蛋白水解度和提取率的影響

從圖2可知，大米蛋白水解度和蛋白質(zhì)提取率在60℃時(shí)最高，溫度太低或太高時(shí)水解度和蛋白質(zhì)提取率均會(huì)下降。這是由于酶對(duì)溫度較為敏感，在其最適溫度范圍內(nèi)活性最高。溫度較低時(shí)，酶活力也較低，水解速度慢，而當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)酶蛋白質(zhì)會(huì)因變性而失活，造成水解度和提取率的下降[14]。因此初步選擇反應(yīng)溫度為60℃。

圖2 溫度對(duì)水解度和提取率的影響

Fig.2 Effect of temperature on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

2.1.3 pH值對(duì)大米蛋白水解度和提取率的影響

由圖3可見(jiàn)，在pH值為8時(shí)水解度和蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大，pH值低于或高于8時(shí)，水解度和蛋白質(zhì)提取率均有所降低。這是由于pH值會(huì)影響酶分子和底物分子上羧基、氨基等基團(tuán)的解離狀態(tài)，這些基團(tuán)的解離狀態(tài)會(huì)影響酶與底物的結(jié)合催化[15]。因此初步確定pH值為8。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)大米蛋白水解度和提取率的影響

從圖4可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度和提取率都會(huì)逐漸提高。但由于底物濃度不斷降低，酶解9 h之后水解度和提取率的增長(zhǎng)趨于平緩。因此，從節(jié)約成本角度考慮，初步將酶解時(shí)間定為9 h。

圖3 pH值對(duì)水解度和提取率的影響

Fig.3 Effect of pH value on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度和提取率的影響

Fig.4 Effect of time on the degree of hydrolysis and protein extraction rate

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時(shí)間為自變量(D)，水解度(DH)和蛋白質(zhì)提取率(E)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果

Table 2 Experiment design and result

實(shí)驗(yàn)號(hào)No.溫度Temperature酶添加量Enzyme additionpH值pH value酶解時(shí)間Time水解度Hydrolysis degree (%)提取率Protein extraction rate (%)1-1-10029.178.821-10033.184.73-110034.184.94110037.788.5500-1-125.174.16001-128.677.8700-1128.279.98001136.883.99-100-128.979.4

續(xù)表2

Continued table 2

實(shí)驗(yàn)號(hào)No.溫度Temperature酶添加量Enzyme additionpH值pH value酶解時(shí)間Time水解度Hydrolysis degree (%)提取率Protein extraction rate (%)10100-131.680.611-100133.983.212100136.989.0130-1-1024.975.51401-1031.980.2150-11032.280.116011036.385.217-10-1023.471.91810-1025.775.919-101028.676.320101032.480.2210-10-130.482.222010-136.689.6230-10137.590.324010140.893.225000040.590.326000040.091.527000039.191.928000039.490.729000039.691.1

用Design Expert 8.06軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到水解度(DH)與溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時(shí)間(D)的二次多項(xiàng)式回歸方程：

DH=39.72+1.62A+2.52B+2.98C+

2.74D-0.10AB+0.37AC+0.075AD-0.73BC-

0.73BD+1.27CD-4.80A2-1.15B2-7.46C2-

2.31D2。

由表3可知，模型P值<0.000 1，失擬項(xiàng)為0.704 2>0.05，表明該模型擬合程度較好；決定系數(shù)

R2=0.995 7，說(shuō)明水解度實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間有較好擬合度。由表3中的F值大小順序可知，各因素對(duì)水解度的影響順序?yàn)镃>D>B>A，即pH值>酶解時(shí)間>酶添加量>溫度。溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時(shí)間(D)的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平；交互項(xiàng)BC、BD、CD對(duì)水解度的影響也達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)AB、AC和AD對(duì)水解度的影響不顯著。綜上分析可知該模型與實(shí)際情況擬合較好，可用于大米蛋白水解度的優(yōu)化。

表3 方差分析(水解度)

Table 3 Analysis of variance for the quadratic model (degree of hydrolysis)

來(lái)源Source平方和Sum of squares自由度Freedom均方Mean squaresF值F valueP值P value模型Model759.231454.23231.79<0.000 1A31.36131.36134.05<0.000 1B76.00176.00324.85<0.000 1C106.211106.21453.95<0.000 1D90.20190.20385.53<0.000 1AB0.04010.0400.170.685 5AC0.5610.562.400.143 3AD0.02310.0230.0960.761 0BC2.1012.108.990.009 6BD2.1012.108.990.009 6

續(xù)表3

Continued table 3

來(lái)源Source平方和Sum of squares自由度Freedom均方Mean squaresF值F valueP值P valueCD6.5016.5027.790.000 1A2149.291149.29638.10<0.000 1B28.5418.5436.51<0.000 1C2360.981360.981 542.90<0.000 1D234.61134.61147.94<0.000 1失擬項(xiàng)Lack of fit2.09100.210.700.704 2純誤差Pure error1.1940.30總和 Sum762.5028

同樣可得到提取率(E)與溫度(A)、酶添加量(B)、pH值(C)、酶解時(shí)間(D)的二次多項(xiàng)式回歸方程：

E=91.10+2.03A+2.50B+2.17C+2.98D-0.58AB-0.025AC+1.15AD+0.10BC-1.12BD+0.075CD-5.77A2-0.79B2-9.82C2-2.04D2。

由表4可知，模型P值<0.000 1，失擬項(xiàng)為0.440 7>0.05，表明該模型擬合程度較好；決定系數(shù)R2=0.993 7，說(shuō)明提取率實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間有較好擬合度。由表4中的F值大小順序可知，各因素對(duì)提取率的影響順序?yàn)镈>B>C>A，即酶解時(shí)間>酶添加量>pH值>溫度。一次項(xiàng)A、B、C、D對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響達(dá)到極其顯著水平；交互項(xiàng)AD、BD對(duì)提取率的影響極顯著，其余交互項(xiàng)均不顯著。綜上分析可知該模型與實(shí)際情況擬合較好，可用于優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取率。

表4 方差分析(蛋白質(zhì)提取率)

Table 4 Analysis of variance for the quadratic model (protein extraction rate)

來(lái)源Source平方和Sum of squares自由度Freedom均方Mean squaresF值F valueP值P value模型Model1 047.341474.81156.71<0.000 1A49.61149.61103.93<0.000 1B75.00175.00157.11<0.000 1C56.33156.33118.00<0.000 1D106.801106.80223.73<0.000 1AB1.3211.322.770.118 2AC0.002 510.002 50.005 20.943 3AD5.2915.2911.080.005 0BC0.04010.0400.0840.776 5BD5.0615.0610.600.005 7CD0.02210.0220.0470.831 3A2215.701215.70451.85<0.000 1B24.0714.078.520.011 2C2625.081625.081 309.40<0.000 1D227.04127.0456.64<0.000 1失擬項(xiàng)Lack of fit5.08100.511.270.440 7純誤差Pure errol1.6040.40總和 Sum1 054.0328

2.2.2 水解度的因素交互效應(yīng)分析

響應(yīng)面圖的等高線(xiàn)形狀反映交互作用的強(qiáng)弱程度，圓形表示兩個(gè)因素的交互作用不明顯，而橢圓形則表示交互作用明顯[16]。從圖5可以看出，水解度隨著酶解時(shí)間和酶添加量的增加而升高；水解度隨著pH值和溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。橢圓形的等高線(xiàn)說(shuō)明交互作用對(duì)水解度影響顯著；pH值與溫度、酶添加量、酶解時(shí)間的交互作用顯著，表明pH值對(duì)水解度的影響比其他因素要大，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互效應(yīng)的響應(yīng)面曲線(xiàn)(水解度)

2.2.3 蛋白質(zhì)提取率的因素交互效應(yīng)分析

從圖6a可以看出，溫度一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加提取率緩慢升高；酶解時(shí)間固定時(shí)，隨著溫度升高，提取率是先增加再降低。從圖6b可知，酶添加量固定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加提取率緩慢升高；當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，隨著酶添加量的增加，提取率逐漸上升。圖6a等高線(xiàn)為橢圓形，說(shuō)明時(shí)間-溫度交互作用顯著；而時(shí)間-酶添加量之間的交互作用亦較明顯(圖6b)，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 酶解實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化與驗(yàn)證

軟件優(yōu)化后的最佳水解條件：溫度61.72℃，酶添加量2.5%，pH值8.16，時(shí)間10.48 h，此時(shí)預(yù)測(cè)水解度為41.93%，預(yù)測(cè)提取率為93.52%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的方便，水解條件調(diào)整為溫度62℃，酶添加量2.5%，pH值8.2，時(shí)間10.5 h，預(yù)測(cè)水解度為41.93%，提取率為93.47%。按照優(yōu)化條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際水解度為41.5%，提取率93.1%，兩者誤差小于1%，說(shuō)明方程擬合較好，響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶解工藝參數(shù)準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶解條件相比現(xiàn)有的水解工藝在水解度(<30%)方面有較大提高，具有實(shí)用價(jià)值。

圖6 各因素交互效應(yīng)的響應(yīng)面曲線(xiàn)(蛋白質(zhì)提取率)

Fig.6 Response surface map of cross effect of each factors (protein extraction rate)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了大米蛋白的酶解工藝。通過(guò)響應(yīng)面法分析發(fā)現(xiàn)，酶解的溫度、酶添加量、酶解時(shí)間、pH值均對(duì)水解度和提取率有顯著影響。最后通過(guò)軟件得到優(yōu)化的酶解工藝條件：溫度62℃，酶添加量2.5%，pH值8.2，時(shí)間10.5 h，此時(shí)大米蛋白的水解度可達(dá)到41.5%，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)93.1%。本研究成果可為水解大米蛋白的實(shí)際生產(chǎn)提供參考。