汪 鳳，朱 婷，關(guān)曉燕，2，李 玲，周衛(wèi)兵△

（1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科，湖南長沙410008；2中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院腫瘤科，安徽合肥230071；3中南大學(xué)湘雅醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，湖南長沙410008）

高級別膠質(zhì)瘤（high-grade gliomas，HGGs）包括WHOⅢ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤，是腦原發(fā)性腫瘤中發(fā)病率最高、最難治療的一類腫瘤，因腫瘤無完整的包膜，呈浸潤性生長，與腦組織分界不清，手術(shù)難以根除。目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案為手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放療和（或）同步替莫唑胺化療［1-2］。放療能延長患者的無疾病進(jìn)展生存期［3］，但往往因放射抵抗導(dǎo)致復(fù)發(fā)，降低生存時間。因此通過藥物、生物以及物理等手段增強高級別膠質(zhì)瘤的放療敏感性已成為近年研究重點之一。

欖香烯（elemene）是從姜科植物溫莪術(shù)（郁金）中提取出來的萜烯類化合物，主要包括β-欖香烯、γ-欖香烯和δ-欖香烯3種，其中具有明確抗癌活性的成份是β-欖香烯（1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙烯基環(huán)己烷）。1994年欖香烯乳狀注射液作為國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤新藥上市［4-5］，但乳劑存在一些缺陷，如靜脈炎發(fā)生率高、低溫耐受性差等。石藥集團(tuán)對劑型進(jìn)行改良升級，于2012年上市水針劑型的欖香烯注射液，為無色澄明粘稠液體，均相體系顯著降低了使用者靜脈炎的發(fā)生率，其β-欖香烯含量高達(dá)96%以上，雜質(zhì)含量低且產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。大量研究［6-10］證實，欖香烯能通過血腦屏障，具有廣譜、高效、低毒等特點，對包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤表現(xiàn)出抗腫瘤作用。目前欖香烯注射液聯(lián)用化療藥開展的臨床試驗涉及惡性胸腹腔積液、多種實體瘤以及腦轉(zhuǎn)移癌等，并取得了一定的療效［11-12］，具有毒副作用小（如對肝、腎功能無明顯損害，不發(fā)生骨髓抑制）、長期使用無明顯耐藥性等優(yōu)點。欖香烯亦具有放射增敏作用，但目前研究主要集中于肺癌，而對于膠質(zhì)瘤增敏作用的研究未見報道。我們前期發(fā)現(xiàn)了欖香烯對U251細(xì)胞有放射增敏作用［13］，但具體機制尚不清楚，本文將欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株的放射增敏作用機制進(jìn)行研究。

材料和方法

1 材料

人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞（中南大學(xué)細(xì)胞分子實驗室）。欖香烯注射液［石藥集團(tuán)遠(yuǎn)大（大連）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20110114，規(guī)格為每支0.2 g/10 mL］；annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；鼠抗人細(xì)胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2，Cdc2）、survivin和βactin抗體及羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP抗體（Santa Cruz）；兔抗人 p-Cdc2（Thr161）和cyclin B1抗體（Cell Signaling）。

2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（上海申力科學(xué)儀器公司）；ELx800型酶標(biāo)儀（BioTek）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD）；直線加速器（Siemens）。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱。

3.2 MTT法檢測細(xì)胞活力 接種對數(shù)生長期細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（每孔4×103個細(xì)胞），設(shè)調(diào)零組、對照組（0 mg/L）及欖香烯（10、20、40、80和160 mg/L）組，每組設(shè)6個重復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，予以不同濃度藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTT液20 μL，孵育4 h后吸棄，再加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度（A490）。細(xì)胞相對活力（%）=（欖香烯組A490-調(diào)零組A490）/（對照組A490-調(diào)零組A490）×100%。設(shè)調(diào)零組、對照組（0 mg/L+0 Gy）、欖香烯組（40 mg/L+0 Gy）、放療組（0 mg/L+2、4、6、8 Gy）及聯(lián)合組（40 mg/L+2、4、6、8 Gy），每組設(shè)6個重復(fù)孔，予以欖香烯40 mg/L處理24 h后，放療組及聯(lián)合組置于直線加速器（200 cGy/min，源皮距100 cm），按設(shè)定劑量進(jìn)行照射。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，予以MTT法檢測各組光吸收值A(chǔ)490。放射組細(xì)胞相對活力（%）=（放射組A490-調(diào)零組A490）/（對照組A490-調(diào)零組A490）×100%，去除藥物毒性作用聯(lián)合組細(xì)胞相對活力（%）=（聯(lián)合組A490-調(diào)零組A490）/（藥物組A490-調(diào)零組A490）×100%。

3.3 細(xì)胞分組及處理 將3×105個細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶，設(shè)對照組（0 mg/L+0 Gy）、放療組（0 mg/L+3 Gy）、欖香烯組（40 mg/L+0 Gy）及聯(lián)合組（40 mg/L+3 Gy），每組設(shè)6個平行瓶。

3.4 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的檢測 收集細(xì)胞，予以冰的70%乙醇固定，再加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料4℃避光染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。另收集細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，4℃、300×g離心1 min，細(xì)胞用緩沖液（binding buffer）重懸細(xì)胞。然后加入annexin V/PI雙染色，再加入binding buffer制樣，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡。

3.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)的水平 收集各組細(xì)胞，加入含10%cocktail蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑細(xì)胞裂解液冰上裂解40 min，4℃、14 000×g離心15 min，收集上清，測定蛋白濃度。SDS-PAGE膠分離蛋白，再將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，I抗 4℃孵育 24～48 h，II抗室溫下孵育 1 h。ECL試劑發(fā)光壓片顯影。應(yīng)用ImageJ軟件檢測條帶灰度，計算各蛋白相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組比較采用方差分析+兩兩比較HSD-q檢驗，多時點觀測資料采用兩因素重復(fù)測量方差分析+組間兩兩比較HSD-q檢驗+時間兩兩比較差值t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 欖香烯對U251細(xì)胞活力的影響

欖香烯處理U251細(xì)胞24 h后，各濃度欖香烯處理組的細(xì)胞活力均低于對照（0 mg/L）組（P＜0.05）；U251細(xì)胞活力隨欖香烯濃度增高而降低，欖香烯對U251細(xì)胞活力的抑制作用具有劑量依賴性，半數(shù)抑制濃度（IC50）為72.0 mg/L，見圖1。

Figure 1.Inhibitory effect of elemene on the viability of U251 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 0 mg/L group.圖1 欖香烯對U251細(xì)胞活力的抑制作用

2 欖香烯（40 mg/L）對U251細(xì)胞放射敏感性的影響

欖香烯濃度為40 mg/L的聯(lián)合組中，接受不同劑量放療的細(xì)胞活力均低于欖香烯濃度為0 mg/L的單獨放射組（P＜0.05），表明40 mg/L欖香烯具有放射增敏作用。鑒于單獨放射組細(xì)胞活力在3 Gy劑量時出現(xiàn)下降（P＜0.05），故選用40 mg/L欖香烯聯(lián)合3 Gy放療進(jìn)行后續(xù)研究。見圖2。

3 欖香烯對細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的作用

欖香烯與放療在U251細(xì)胞的早期凋亡率（P=0.047）、繼發(fā)性壞死率（P=0.008）、總死亡率（P=0.004）及G2/M期阻滯（P=0.032）方面存在交互作用。放射組細(xì)胞早期凋亡率、繼發(fā)性壞死率和總死亡率相對于對照組有增高趨勢，而G2/M期細(xì)胞比例降低；欖香烯與放射聯(lián)合作用進(jìn)一步提高細(xì)胞早期凋亡率、繼發(fā)性壞死率及總死亡率（P＜0.05），G2/M期細(xì)胞比例亦顯著升高（P＜0.05）；欖香烯組細(xì)胞早期凋亡率、總死亡率及G2/M期細(xì)胞比例相對于空白組均顯著增高（P＜0.05），提示欖香烯通過誘導(dǎo)U251細(xì)胞G2/M期阻滯和早期凋亡、提高細(xì)胞總死亡率而發(fā)揮其放射增敏作用。見圖3。

Figure 2.Radiosensitizing effect of elemene on the U251 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 0 mg/L elemene group.圖2 欖香烯對U251細(xì)胞的放射增敏效應(yīng)

4 欖香烯對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)作用

Western blot結(jié)果顯示，欖香烯藥物治療與放療對cyclin B1蛋白存在交互作用（P=0.007）。單獨放射組cyclin B1蛋白表達(dá)與對照組相比顯著提高（P＜0.05）；與單獨放射組相比，聯(lián)合組cyclin B1表達(dá)顯著降低，提示欖香烯能夠拮抗放療誘導(dǎo)的cyclin B1表達(dá)增高，降低cyclin B1表達(dá)。此外，欖香烯可顯著降低Cdc2、p-Cdc2（Thr161）和survivin蛋白水平（P＜0.05）。見圖4。

討 論

放療是膠質(zhì)瘤的重要輔助治療方式之一，但腫瘤周圍存在重要組織器官、腫瘤細(xì)胞內(nèi)在放療敏感性差、術(shù)后腫瘤供血供氧不足而產(chǎn)生放療抵抗或耐放射性等，常導(dǎo)致療效下降。所以，通過放療和放射增敏劑聯(lián)合使用的方法或可提高療效。研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯可抑制多種腫瘤，具有毒副作用小、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥等特點，欖香烯具備臨床放射增敏劑的潛能。欖香烯在其它實驗［14-16］證明對膠質(zhì)瘤 U87、C6和U251細(xì)胞系體外具有增殖抑制作用。本研究結(jié)果顯示，欖香烯作用24 h對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的IC50為72.04 mg/L，表明欖香烯對U251細(xì)胞體外亦具有增殖抑制作用，與前期實驗［13］實驗結(jié)果相近。

Figure 3.Flow cytometry was used to analyze the apoptosis and the cell cycle distribution.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs radiation group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的變化

欖香烯可能通過參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)、信號通路活性等途徑發(fā)揮放射增敏作用。本實驗發(fā)現(xiàn)欖香烯通過誘導(dǎo)U251細(xì)胞G2/M期阻滯和早期凋亡、提高細(xì)胞總死亡率而發(fā)揮其放射增敏作用。細(xì)胞增殖依賴于有絲分裂，并主要由3個檢查點（G1/S檢查點、G2/M檢查點和紡錘體組裝檢查點）調(diào)控細(xì)胞有絲分裂周期的不可逆運行［17］。目前，有關(guān)G2檢查點的應(yīng)答通路尚未完全闡明，但有研究證實Cdc2活性在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18］，而且cyclin B-Cdc2復(fù)合物形成及Cdc2激活推動細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換。本研究結(jié)果表明，欖香烯能夠降低Cdc2蛋白表達(dá)，同時拮抗放療誘導(dǎo)的cyclin B1表達(dá)增高，抑制cyclin B1表達(dá)，初步證實欖香烯聯(lián)合放療可抑制cyclin B-Cdc2復(fù)合物形成，導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯。Cdc2蛋白活性通過大量磷酸化反應(yīng)調(diào)控，Cdc2蛋白存在一個正性調(diào)節(jié)位點（Thr161）及2個負(fù)性調(diào)節(jié)位點（Thr14及Tyr15）。磷酸化Cdc2第161位蘇氨酸可激活Cdc2，促進(jìn)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換。相反，磷酸化Cdc2兩個負(fù)性調(diào)節(jié)位點則抑制Cdc2活性，導(dǎo)致細(xì)胞G2/M阻滯。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)欖香烯能夠抑制Cdc2第161位蘇氨酸磷酸化，導(dǎo)致p-Cdc2（Thr161）蛋白水平降低，抑制Cdc2活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞于G2/M期阻滯。大量研究證實，G2期及M期細(xì)胞對放療最敏感，S期細(xì)胞對放療耐受性最強，且G2/M期細(xì)胞放射敏感性比S期細(xì)胞高近3倍［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。另外，陳琦等［6］報道β-欖香烯亦可通過降低cyclin B1和p-Cdc2（Thr161）蛋白水平誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。這些研究進(jìn)一步證實欖香烯可在不同類型的腫瘤中引起G2/M期阻滯，從而達(dá)到放射增敏的作用。

Figure 4.The expression of G2/M check point-related proteins and protein level of survivin.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs radiation group.圖4 G2/M檢測點相關(guān)蛋白及survivin蛋白表達(dá)的變化

既往研究表明，survivin高表達(dá)的膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出放射抵抗［20-22］。也有人認(rèn)為survivin可抑制caspase-3、caspase-7［23-25］和caspase-9［26］的活化而抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；survivin還能與Smac（second mitochondria-derived activator of caspase）/DIABLO（direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI）結(jié)合，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡功能［27］。本實驗運用Western blot檢測survivin蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)欖香烯能顯著降低其在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中表達(dá)，提示欖香烯能夠降低U251細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而增強放療作用。但誘導(dǎo)凋亡的具體途徑有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，欖香烯可抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞活力，增強其放射敏感性；欖香烯可降低Cdc2和cyclin B1蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制cyclin B-Cdc2復(fù)合物形成；欖香烯可能抑制Cdc2蛋白磷酸化，降低Cdc2活性，導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯，增強細(xì)胞放射敏感性；欖香烯還可能通過下調(diào)survivin表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。