田 甜，余 蕾，謝汝佳，韓 冰，丁凱澤，楊 勤△，楊 雪

（1貴陽市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，2貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室，3貴陽市婦幼保健院病理科，4貴陽市婦幼保健院生殖中心，貴州貴陽550004）

組蛋白賴氨酸（lysine，K）甲基化是一種表觀遺傳修飾方式，與組蛋白乙?；揎棽煌?，它并不影響組蛋白尾上賴氨酸的電荷數，但會造成空間位阻，導致賴氨酸的疏水性變化，形成新的蛋白質結合位點，從而廣泛參與基因的轉錄調控［1］。組蛋白H3賴氨酸殘基上能夠發(fā)生甲基化修飾的位點有很多，比如H3K4、H3K9、H3K27等；這些組蛋白甲基化修飾對基因表達的影響不盡相同，例如H3K4二甲基化（H3K4 dimethylation，H3K4me2）具有促進基因轉錄起始的作用，而H3K9二甲基化（H3K9 dimethylation，H3K9me2）具有抑制基因轉錄起始的作用［2］。

通過抑制肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖、活化以及調節(jié)細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成和代謝之間的平衡逆轉肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，一直是抗肝纖維化治療的研究熱點［3］。有文獻報道，靶向改變HSC中異常的組蛋白甲基化狀態(tài)，能夠抑制HSC的增殖和活化，從而抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。Yang等［4］發(fā)現組蛋白H3K27甲基轉移酶抑制劑DZNep通過降低HSC-T6細胞中Dickkopf1（DKK1）基因啟動子區(qū)H3K27的甲基化水平，導致DKK1蛋白表達上調。DKK1是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，其蛋白表達上調會阻斷Wnt/βcatenin信號通路，抑制HSC的增殖和活化。上述研究提示組蛋白H3K27甲基轉移酶抑制劑DZNep通過改變HSC中異常修飾的H3K27甲基化，表現出抗肝纖維化作用，表明利用抑制劑或siRNA靶向改變激活型HSC中異常的組蛋白甲基化狀態(tài)可以抑制HSC的增殖和活化。本課題組前期研究發(fā)現，在HSC活化過程中H3K9甲基化水平降低［5］，但是關于采用組蛋白H3K9去甲基化酶抑制劑改變激活型HSC中H3K9甲基化修飾對HSC增殖、活化以及ECM合成和代謝影響的研究，目前尚未見相關報道。

IOX1（5-羧基-8-羥基喹啉，5-carboxy-8-hydroxyquinoline）是新發(fā)現的一種以8-羥基喹啉為基礎的強效組蛋白去甲基化酶抑制劑，它能夠與組蛋白H3K9去甲基化酶活性中心的Fe（II）螯合，使去甲基化過程中單電子傳遞障礙，甲基不能發(fā)生羥基化，從而導致細胞中H3K9甲基化水平增加［6］。但目前應用IOX1防治疾病的研究，鮮有報道。有研究采用IOX1刺激血管緊張素Ⅱ預處理的血管平滑肌細胞，發(fā)現細胞周期蛋白D1基因啟動子區(qū)H3K9甲基化富集量增加，細胞周期蛋白D1的表達被抑制，由于細胞周期蛋白D1與細胞增殖有關，其表達下降可導致細胞周期停滯在G0/G1期，因此研究者認為IOX1可通過抑制細胞周期蛋白D1的表達而抑制血管平滑肌細胞增殖，具有抗動脈粥樣硬化的作用［7］。組蛋白H3K9去甲基化酶抑制劑可上調激活型HSC細胞中H3K9me2水平，但是否能夠抑制HSC的增殖和活化，減少ECM沉積呢？相關的研究目前尚未見報道。鑒于此，本研究擬通過IOX1處理轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導活化的人HSC細胞株LX2，觀察IOX1調控H3K9me2修飾對LX2細胞增殖、凋亡以及ECM相關蛋白［α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原（collagen type I，Col I）、基質金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）和金屬蛋白酶組織抑制物 1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）］表達的影響。

材料和方法

1 材料

人肝星狀細胞株LX2購自上海細胞庫。IOX1和DMSO購自Sigma；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco）；胰酶和彩虹Marker（北京索萊寶科技有限公司）；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑和BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；annexin VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司）；抗β-actin抗體、抗組蛋白H3抗體、山羊抗兔IgG+H以及兔抗H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1抗體購自Abcam。

2 主要方法

2.1 LX2細胞活化 本實驗所用LX2細胞均經過5 μg/L TGF-β誘導而活化，在此基礎上加入不同濃度的IOX1處理。

2.2 細胞增殖實驗 采用實時無標記細胞分析技術（real-time cellular analysis，RTCA）檢測不同濃度IOX1對LX2細胞增殖的影響。RTCA系統(tǒng)通過EPlate底部的電極檢測貼壁細胞的電阻抗，可反映細胞的數量、活力、形態(tài)以及貼壁情況，以細胞指數（cell index，CI）作為檢測指標。取對數生長期的細胞制成細胞懸液并進行細胞計數，以每孔5×103個的密度接種于EPlate，10 h后分別加入終濃度為50、100、200和400 μmol/L的IOX1處理細胞，對照組不予處理，每個濃度設置3個復孔。連續(xù)動態(tài)監(jiān)測72 h，觀察不同濃度IOX1對LX2細胞增殖的影響，每15 min記錄1次。經過RTCA軟件分析得出CI值。根據RTCA實驗結果確定后續(xù)實驗中IOX1的給藥濃度。

2.3 倒置顯微鏡觀察LX2細胞形態(tài)學的變化 取對數生長期的活化LX2細胞，細胞融合度達80%左右時，將細胞隨機分為對照組（control組，不予IOX1處理）、50 μmol/L IOX1組、100 μmol/L IOX1組及300 μmol/L IOX1組（IOX1給藥濃度由RTCA實驗結果確定）。觀察不同濃度IOX1處理IOX1細胞24 h后的細胞形態(tài)學變化。

2.4 流式細胞術檢測LX2細胞凋亡情況 取對數生長期的活化LX2細胞，制成細胞懸液并進行細胞計數，在每個無包被的塑料皿（10 cm）中鋪1×106個細胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為對照組（不予IOX1處理）、50 μmol/L IOX1組、100 μmol/L IOX1組及 300 μmol/L IOX1組。給藥24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，制備密度為1×108/L的細胞懸液，取1 mL離心，除去上清液，加入annexin V-FITC結合液195 μL重懸，再先后加入annexin V-FITC 5 μL和PI染色液10 μL，在室溫下避光孵育20 min后置于冰浴中，流式細胞儀檢測。

2.5 Western blot檢測LX2細胞中組蛋白H3K9me2水平以及 α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平 收集各組細胞，分別加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集細胞懸液，超聲破碎，12 000 r/min、4℃離心20 min，棄沉淀，收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，取40 μg總蛋白上樣，行SDSPAGE，電泳結束后轉移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min，分別加入1∶1 500稀釋的兔抗α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1抗體，以及1∶5 000稀釋的兔抗H3K9me2抗體，4℃搖床孵育過夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（1∶4 000），室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，分別以β-actin和組蛋白H3為內參照。用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶灰度值進行定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞增殖結果

任意接種密度下的LX2細胞在接種5 h內，CI會快速達到最大值，到10 h時CI又降低，隨后細胞進入對數生長期，因此后續(xù)實驗選擇在細胞接種10 h后再加入不同濃度IOX1處理。細胞接種密度在每孔2×104和1×104個細胞時，CI分別在20和40 h時就已達到最大，并在此之后逐漸下降；而在每孔5×103個細胞接種密度下，CI在60 h時仍處于生長旺盛期，見圖1A。因此，我們確定以每孔5×103個細胞的接種密度進行后續(xù)的細胞增殖實驗。

接種LX2細胞10 h后，分別加入不同濃度的IOX1，持續(xù)檢測72 h。RTCA結果顯示，和對照組相比，不同濃度IOX1對LX2細胞增殖的影響表現為先促進后抑制，且IOX1濃度越大，抑制細胞增殖的作用越明顯，見圖1B。

根據LX2細胞的增殖曲線，我們得到IOX1處理LX2細胞24 h所對應的IC50曲線（圖1C），算得IOX1處理24 h的IC50為150 μmol/L。因此我們選取50、100和300 μmol/L IOX1進行后續(xù)實驗。

2 倒置顯微鏡觀察不同濃度IOX1處理的LX2細胞的形態(tài)學變化

和對照組相比，50 μmol/L IOX1處理LX2細胞24 h后細胞形態(tài)沒有明顯變化；在100 μmol/L IOX1組和300 μmol/L IOX1組中可見細胞開始皺縮，胞膜不完整，部分細胞甚至出現壞死現象，見圖2。

3 不同濃度IOX1處理的LX2細胞的凋亡情況

流式細胞術檢測不同濃度IOX1處理24 h后LX2細胞的凋亡情況，結果顯示，與對照組相比，50和100 μmol/L IOX1對LX2細胞凋亡無明顯影響（P＞0.05），而300 μmol/L組細胞凋亡率較對照組明顯增加（P＜0.05），見圖3。

4 IOX1處理LX2細胞后H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平

與對照組相比，50、100和300 μmol/L IOX1組中H3K9me2水平明顯提高，表現出濃度依賴性（P＜0.05）；與對照組相比，50和100 μmol/L IOX1組中α-SMA和TIMP-1的表達沒有明顯差異（P＞0.05），但在300 μmol/L IOX1組α-SMA和TIMP-1蛋白表達量較對照組明顯降低（P＜0.05）；與對照組和50 μmol/L IOX1組相比，Col I蛋白在100和300 μmol/L IOX1組中表達明顯降低（P＜0.05）；與對照組相比，50、100和300 μmol/L IOX1組中MMP-1蛋白表達明顯增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性特點，見圖4。

討 論

HSC位于肝細胞和肝竇內皮細胞之間的Disse腔隙中，其在生理狀態(tài)下的主要功能是儲存和代謝維生素A，因而又稱儲脂細胞。病理狀態(tài)下，HSC的形態(tài)和功能均發(fā)生改變，HSC失去脂質表型并開始合成ECM，ECM的合成增多而降解又相對不足，造成ECM的大量沉積，這一過程被稱為HSC的活化，因此，HSC的活化被認為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)［8］。TGF-β是目前已知最強的促肝纖維化發(fā)生的細胞因子，它通過TGF-β/Smad信號通路激活HSC，使HSC中ECM合成增加并改變ECM代謝，從而促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［9］。在本研究中，我們采用活化的人HSC細胞株LX2作為研究對象，為保證LX2活化的均衡性，我們用TGF-β刺激LX2細胞活化，在此基礎上采用IOX1干預TGF-β預處理活化的LX2細胞，觀察IOX1對LX2細胞H3K9甲基化修飾的改變及對細胞活化和ECM代謝的影響。

Figure 3.Apoptosis of LX2 cells treated with IOX1 at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；&P＜0.05 vs 50 μmol/L IOX1 group；#P＜0.05 vs 100 μmol/L IOX1 group.圖3 不同濃度IOX1處理的LX2細胞的凋亡情況

Figure 4.The protein levels of H3K9me2，α-SMA，Col I，MMP-1 and TIMP-1 in the LX2 cells exposed to IOX1 at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；&P＜0.05 vs 50 μmol/L IOX1 group；#P＜0.05 vs 100 μmol/L IOX1 group.圖4 IOX1處理的LX2細胞中H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平的變化

RTCA和流式細胞術結果顯示，IOX1一方面能夠抑制LX2細胞增殖，另一方面明顯促進LX2細胞凋亡。已有大量研究證實，減少活化的HSC，或者促進活化的HSC細胞發(fā)生凋亡能夠有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。越來越多研究發(fā)現，促HSC凋亡的藥物具有抗肝纖維化作用。因此，我們推測IOX1可能通過抑制HSC增殖、促進HSC凋亡而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

IOX1作為一種組蛋白去甲基化酶抑制劑，能夠上調細胞中H3K9甲基化水平。本研究發(fā)現IOX1可顯著提高TGF-β誘導的LX2細胞中H3K9me2水平，且呈劑量依賴性。α-SMA的表達被看作HSC活化的標志物，且活化的HSC表達大量以Col I為主的ECM［10-11］，故抑制HSC活化和減少ECM合成被認為是治療肝纖維化的有效策略。本研究中Western blot結果顯示，IOX1可抑制α-SMA和Col I蛋白表達。通常，H3K9me2水平提高會抑制基因的表達。因此，我們推測IOX1可能通過上調編碼α-SMA和Col I蛋白的基因啟動子區(qū)H3K9me2水平而抑制α-SMA和Col I蛋白表達。此外，HSC活化過程中ECM合成增加并不是ECM沉積的全部因素，ECM降解減少在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起了更為關鍵的作用。MMP-1能夠降解以膠原為主的ECM，其活性又受到TIMP-1的抑制［12-13］。本研究中Western blot結果顯示，IOX1能夠促進細胞中MMP-1蛋白表達，抑制TIMP-1蛋白表達。這表明IOX1可糾正MMP-1和TIMP-1之間的失衡，促進ECM的降解，有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是IOX1是否通過H3K9me2調控MMP-1和TIMP-1的表達，還需進一步研究。

綜上所述，組蛋白去甲基化酶抑制劑IOX1能夠抑制HSC增殖，促進HSC凋亡，減少ECM合成，促進ECM降解。IOX1可能通過H3K9me2調控α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1的表達，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。