李艷艷，楊鳳梅，王俊斌，陳麗雄，段素琴，楊亞平，劉 雨，和占龍，馬 進，趙 遠

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118)

樹鼩(Tree shrew，Tupaia belangeri)屬于哺乳動物、攀鼩目和樹鼩科。它主要生活在東南亞，在中國樹鼩主要分布在云南省和廣西省，分為6個亞種(Tupaia belangeri chinensis，Tupaia belangeri gaoligongensis，Tupaia belangeri modesta，Tupaia belangeri tonquinia，Tupaia belangeri yunalis and Tupaia belangeri yaoshanensis)[1]，其特點是生育和生命周期短，繁殖力高(4～6個月到成年期，每胎出生2～6個后代)，中等大小(成年體重120～150 g)，并且容易喂養(yǎng)。近年來越來越多地應用于科學和生物醫(yī)學研究。樹鼩可以感染甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、輪狀病毒、腺病毒和皰疹病毒[2-6]。此外，樹鼩還被用來建立耐藥性細菌感染、敗血癥、心理壓力和抑郁、近視和代謝疾病的動物模型[7-9]。這些研究極大地促進了中國樹鼩在生物醫(yī)學研究中的應用。

哺乳動物胃腸道擁有一個巨大的微生物生態(tài)系統(tǒng)，被稱為微生物群，它們與宿主共生、共代謝和共進化，有利于宿主生物學[10]。有證據表明，不同的因素可以導致腸道菌群的變化，這些變化可以影響健康和疾病進程[11]，并與多種疾病密切相關，如消化道疾病、代謝類疾病(如II型糖尿病)、免疫性疾病(如風濕性關節(jié)炎)、甚至心腦血管疾病(動脈粥樣硬化)，通過對腸道菌群的研究為多種疾病研究和防治提出了新的方向[12-14]。由于糞便采樣方便且無創(chuàng)，目前大量的動物和人類腸道菌群的研究通常集中在以糞便菌群來代表腸道菌群[15-16]。然而，糞便菌群與腸道菌群有相關性，但并不能代表腸道菌群，研究表明糞便菌群成分與近端的結腸腔和黏膜高度相關，與遠端小腸適度相關[17]。

然而作為最接近靈長類動物的樹鼩各腸段微生物的組成至今未見報道。本研究采用16S rRNA基因測序技術，避開傳統(tǒng)活菌培養(yǎng)耗時較長、細菌生長條件特殊、培養(yǎng)技術復雜等缺點，對野生樹鼩與人工馴養(yǎng)樹鼩不同腸道段菌群的種類和分布進行了比較研究，為樹鼩不同腸段內菌群的種類、分布、功能及與宿主的關系提供參考，對理解不同部位菌群間的代表性也有參考價值。研究結果提示，在今后研究中應充分考慮糞便樣品微生物的組成是否能夠完全代表腸道微生物的組成。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

野生健康樹鼩3只，4月齡，體重120～200 g，2018年捕捉于中國云南省昆明市西山區(qū)谷律鄉(xiāng)(25° 07′N，102° 26′E，海拔2221 m)。人工飼養(yǎng)健康樹鼩3只，4月齡，體重120～200 g，來自于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所飼養(yǎng)繁殖的仔一代樹鼩(普通級)[SCXK(滇)K2018-0002]，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所普通級實驗室[SYXK(滇)K2018-0002]，飼喂全價顆粒飼料，并輔以水果。對以上兩組動物肌注氯胺酮深度麻醉后，頸動脈放血處死，全身75%酒精消毒后在無菌手術室內取各腸段內容物0.5～1 g于無菌EP管(置于冰面上)，并迅速轉移至-80℃冰箱凍存至檢測，樣品編號如表1。實驗經本單位倫理委員會審核批準(DWSP201810002)，實驗過程嚴格遵循實驗動物使用的3R原則和福利倫理原則。

1.1.2 實驗樣品

實驗所用材料詳見表1。

1.2 主要試劑與儀器

Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、高效高保真酶(New England Biolabs公司)；TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit、HiSeq2500測序平臺(Illumina公司)；QIAquick Gel(QIAGEN公司)；-80℃冰箱(Thermo Scientific公司)。

1.3 實驗方法

按參考文獻[18-22]的方法進行基因組DNA提取和PCR擴增文庫構建、測序及生物信息學分析。采用CTAB方法對樣本的基因組DNA提取后檢測DNA的純度和濃度。用無菌水稀釋基因組DNA至1 ng/μL，以其作為模板，針對16S rDNA的V3-V4片段，515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAt-3’)，使用帶Barcode的特異引物，Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣品的reads進行拼接得到原始Tags數據(Raw Tags)，經嚴格過濾處理得到高質量 的Tags數 據(Clean Tags)。參 照Qiime(V1.9.1)的Tags質量控制流程得到最終的有效數據(Effective Tags)。利用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs，對OTUs代表序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析。對OTUs進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。最后，用PICRUSt根據Marker基因進行元基因組功能預測的生物信息軟件包，根據測序數據進行基于KEGG數據庫的功能預測。

表1 分組及樣品編號Table 1 Grouping and sample number

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 樣品細菌豐富度和多樣性評估

在檢查了測序的質量后，從42個不同胃腸道樣本中獲得了2305843個有效序列。通過不同樣品在97%一致性閾值下的α多樣性指數(shannon、simpson、chao1、ACE、goods_coverage)分別對樣本序列進行豐富度和多樣性分析。結果顯示覆蓋范圍從99.1%到99.7%，表明本實驗每個樣品的豐富度及多樣性足以完整描述該樣品菌群的組成；Shannon指數及Chao 1指數結果顯示，野生組樹鼩空腸和胃低于人工繁育組，其余腸段均高于人工繁育組，說明以上野生樹鼩大部分腸段內菌群多樣性高于人工繁育樹鼩，且Shannon指數顯示，野生組胃內菌群多樣性與人工繁育組差異極顯著(P＜0.01)，而盲腸內菌群多樣性野生組明顯高于人工繁育組(P＜0.05)(見表2)。同時，從表2可以看出野生樹鼩各腸段OTUs數從高到低依次是:十二指腸、結腸、回腸、直腸、空腸、盲腸、胃；而人工繁育組依次是:空腸、胃、直腸、回腸、結腸、盲腸、十二指腸。

2.2 消化道不同部位菌群組成

細菌群落的相對豐度結果顯示，在門水平，野生組樹鼩直腸、結腸和盲腸主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成；而人工繁育樹鼩直腸、結腸主要由變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)和梭桿菌門(Fusobacteria)組成，盲腸主要由變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成。野生樹鼩回腸中主要由厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)組成，人工繁育樹鼩回腸中主要由厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和柔膜菌門(Tenericutes)組成；野生樹鼩空腸中主要由厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和柔膜菌門(Tenericutes)組成，而人工繁育樹鼩空腸中厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)組成；野生樹鼩十二指腸中主要由厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和Cyanobacteria菌門組成，而人工繁育樹鼩十二指腸中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和螺旋體門(Spirochaetes)組成；野生樹鼩胃中主要由厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)組成，而人工繁育樹鼩胃中主要厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、Cyanobacteria和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成(見圖1A)。

表2 野生和圈養(yǎng)繁殖群不同腸段微生物α多樣性指數的比較Table 2 Comparison of Alpha diversity index of gut microbiota from the wild and captive bred groups

屬水平結果顯示，野生樹鼩直腸和結腸內以Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)為主，而人工繁育樹鼩則以Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和Spirochaetes菌門的短螺菌屬(Brachyspira)為主；盲腸內，野生樹鼩主要以Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和Firmicutes菌門的魏氏菌屬(Weissella)為主，而人工繁育樹鼩則以Spirochaetes菌門的短螺菌屬(Brachyspira)和Bacteroidete菌門的普雷沃菌屬(Prevotella)為主；回腸內，野生樹鼩主要以Firmicutes菌門的魏氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)為主，而人工繁育樹鼩則以Firmicutes菌門的鏈球菌屬(Streptococcus)、Tenericutes菌門的Ureaplasma屬、Firmicutes的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)為主；空腸內，野生樹鼩主要以Firmicutes菌門的魏氏菌屬(Weissella)、Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)和Tenericutes菌門的Ureaplasma屬為主，而人工繁育樹鼩則以Firmicutes門的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)為主；十二指腸內，野生樹鼩主要以Firmicutes菌門的魏氏菌屬(Weissella)和Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)為主，而人工繁育樹鼩則以Spirochaetes菌門的短螺菌屬(Brachyspira)、Firmicutes門的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、Tenericutes菌門的Ureaplasma屬和Proteobacteria菌門的螺桿菌屬(Helicobacter)為主；胃內，野生樹鼩主要以Firmicutes菌門的魏氏菌屬(Weissella)為主，而人工繁育樹鼩則以Bacteroidete菌門的普雷沃菌屬(Prevotella)和Firmicutes門的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為主(見圖1B)。

2.3 消化道不同部位菌群比較

韋恩圖被用來確認野生和人工繁育的樹鼩各腸段的核心腸道微生物群。結果顯示，野生和人工繁育的樹鼩直腸、結腸、盲腸、回腸、空腸、十二指腸及胃中共有的OTUs數量分別為:648、663、459、620、692、401和453個，見圖2。

LEfSe分析的意義是在組間尋找具有統(tǒng)計學差異的生物標記物，并強調其統(tǒng)計學意義與生物物種的相關性，用來識別組間不同物種豐度的特征及其關聯(lián)的類別。

LEfSe(LDA effect size)分析為我們提供了野生組和人工繁育組類群之間有顯著差異的分類群(圖3)。結果顯示，在野生組和人工繁育組直腸內共發(fā)現(xiàn)17個和8個相對豐度差異的分類群，在結腸內為5個和8個，在盲腸內為12個和10個，回腸內為11個和13個，空腸內為7個和9個，胃內為10個和5個。

從圖3中，我們發(fā)現(xiàn)，在門水平上，野生組直腸、結腸、盲腸及胃四個部位中厚壁菌門(Firmicutes)的平均占比明顯高于人工繁育組(P＜0.05)；人工繁育樹鼩直腸、結腸、盲腸及回腸內螺旋體門(Spirochaetes)的平均占比明顯高于野生樹鼩(P＜0.05)；野生組直腸內擬桿菌門(Bacteroidetes)的平均占比明顯高于人工繁育組(P＜0.05)，而該菌門在野生組回腸內的平均占比則明顯低于人工繁育組(P＜0.05)。屬水平上，各腸段野生組明顯高于人工繁育組的主要菌屬為:回腸、空腸和胃內的魏氏菌屬(Weissella)，直腸內的擬桿菌屬(Bacteroides)以及回腸段內的乳球菌屬(Lactococcus)；而人工繁育組明顯高于野生組的主要菌屬為:直腸、結腸、盲腸及回腸內的短螺菌屬(Brachyspira)，盲腸和胃內的普雷沃菌屬(Prevotella_9)，盲腸和空腸內的鏈球菌屬(Streptococcus)以及回腸中的乳酸菌屬(Lactobacillus)。

2.4 PICRUSt功能預測

KEGG功能預測結果顯示，在1級水平中，人類疾病和組織系統(tǒng)不同腸段野生組與人工繁育組表現(xiàn)出基本相似的基因功能，其他基因功能在同組不同腸段或同腸段不同組間有一定程度的差異(圖4)。通過進一步在2級水平上的比較，我們發(fā)現(xiàn)，野生組與人工繁育組共有5個解剖部位17個基因類別之間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，它們分別是:野生組直腸段的復制與修復和細胞生理過程及信號傳導明顯高于人工繁育組；結腸段的氨基酸代謝、細胞生理過程及信號傳導野生組明顯低于人工繁育組；野生組盲腸段外源物質的生物降解與代謝、能量代謝和轉錄明顯高于人工繁育組，而其他次生代謝物的生物合成、感染性疾病和信號分子與相互作用野生組明顯低于人工繁育組；回腸段的消化系統(tǒng)野生組明顯高于人工繁育組；胃內的轉錄和脂代謝野生組明顯高于人工繁育組，而酶家族、輔助因子和維生素代謝、遺傳信息處理和免疫系統(tǒng)野生組明顯低于人工繁育組(見圖5)。

圖1 野生和人工繁育的樹鼩的不同腸段門水平(A)和屬水平(B)微生物組成Figure 1 Phylum levels(A)and genus levels(B)of different intestinal segments of wild and captive tree shrews

圖2 野生組和人工繁育組同一腸段所共有的OTUs的數量Figure 2 The number of OTUs in the same intestinal segment Shared by the wild group and the captive group

3 討論

樹鼩是一種新興的實驗動物，近年來，在生物學和醫(yī)學研究中都產生了大量的疾病樹鼩模型[23]。然而，樹鼩消化道中微生物群落的特征和分布尚不清楚，尤其是樹鼩各個腸段微生物的組成情況，至今仍未見報道。本研究首次采用16S rRNA Illumina MiSeq高通量測序技術，比較了人工繁育樹鼩和野生樹鼩的不同胃腸段微生物的組成及差異。研究數據表明，飲食是影響哺乳動物腸道微生物群的主要因素[24]。在本研究中，人工繁育樹鼩的食物主要由含有高蛋白和多糖的飼料和新鮮水果組成，野生樹鼩主要食用野生高纖維植物葉片。因此，人工繁育和野生樹鼩之間的微生物群的差異可能與飲食差異密切相關。

圖3 組間菌群差異線性分析(LEfSe)Figure 3 Linear analysis of inter-group flora differences(LEfSe)

圖4 不同腸段功能的相對豐度熱圖Figure 4 Relative abundance heat map of different intestinal segment functions

圖5 2級水平不同腸段間差異功能基因的相對豐度變化(P＜0.05)Figure 5 Significant differences in gene categories at level 2(P＜0.05)between the different GI

長期以來研究認為，哺乳動物消化道內細菌多樣性是從胃到糞便的增加，因為胃和小腸內環(huán)境過于嚴酷(由于pH值低)以至于很難保證微生物的生長和保持更大的多樣性[25]。我們對野生樹鼩的研究結果也支持這一傳統(tǒng)觀念，Alpha多樣性指數顯示野生組樹鼩盲腸段物種豐富度最高，結腸次之(見表2)。同時，傳統(tǒng)研究認為哺乳動物盲腸和結腸中，微生物負責分解在通過小腸運輸過程中未被代謝的多糖，盲腸和結腸成為身體內擁有菌落密度最大、多樣性最豐富的場所[26-27]。然而，人工繁育組樹鼩消化道細菌多樣性卻不支持這一觀念，在空腸、回腸和盲腸樣本以及胃樣本中都發(fā)現(xiàn)了更大的多樣性，在十二指腸和大腸末端樣品中留下了最少的多樣性(見表2)。這一結果可能與樹鼩腸段結構有關，空腸和回腸是樹鼩腸段中最長的兩段，為微生物的生長提供了更好的環(huán)境，這可能造成人工飼養(yǎng)樹鼩空腸段和回腸段細菌多樣性較其他腸段高的原因，然而，還需要進一步的研究來解釋這些現(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)野生樹鼩胃腸道各解剖部位內門水平菌群組成上有很大差異，例如:在野生組直腸、結腸內以Proteobacteria菌門豐富度最高，盲腸、回腸、空腸、十二指腸及胃內都以Firmicutes菌門豐富度最高(圖1A)。張飛燕等[28]對野生樹鼩糞便菌群組成的研究認為門水平以Firmicutes和Bacteroidetes為主，屬水平以乳球菌屬、鏈球菌屬、普雷沃菌屬、擬桿菌屬、魏斯氏菌屬等為主，這一結果與本研究胃腸道各腸段微生物組成有所不同，由此可見，糞便菌群與腸道菌群有相關性，但并不能代表腸道內菌群。同時，我們還發(fā)現(xiàn)人工繁育組樹鼩各腸段與野生組也有很大差別，人工繁育組直腸、結腸和盲腸中以Spirochaetes菌門豐富度最高(37.14%、42.29%、30.33%)，且明顯高于野生組(P＜0.05)；樹鼩直腸、結腸和盲腸內的Firmicutes明顯高于人工繁育組(P＜0.05)；回腸、空腸、十二指腸及胃內都以Firmicutes菌門豐富度最高(73.30%、47.23%、44.03%、85.52%)(圖1A)。這一結果與人工飼養(yǎng)的SPF C57BL/6小鼠及我們之前對非人靈長類恒河猴的研究結果均不一致[29-30]。在我們中心人工繁育的樹鼩與人工繁育恒河猴飼喂的飼料，其成分基本一致，然而對不同腸段菌群的研究結果的不一致是否說明腸段菌群的組成在很大程度上與物種有關。

從功能基因預測結果的分析，我們發(fā)現(xiàn)，野生樹鼩與人工飼養(yǎng)樹鼩之間的差異功能基因主要集中在直腸、結腸、盲腸和胃幾個解剖部位，尤其以盲腸和胃之間的差異基因較多。已有的研究認為大腸和小腸之間在功能上有明顯不同[31]。野生樹鼩與人工飼養(yǎng)樹鼩各腸段的功能差異主要集中在大腸各段，主要在細胞修復、信號傳導、復制、消化、異源物質降解和代謝、能量代謝、轉錄等功能高于人工繁育組，說明野生樹鼩大腸段承擔了更多了能量代謝和外源物清除相關工作，這也與大腸段優(yōu)勢菌群組成相關。小腸段作為動物消化系統(tǒng)主要的吸收器官，兩組動物功能基因并沒有顯著差異。而在胃內人工飼養(yǎng)組樹鼩承擔了比野生組更多的酶家族、輔酶、維生素代謝以及遺傳與免疫功能。這些功能上的差異也提示不同食物來源可能造成了野生樹鼩與人工繁育樹鼩不同腸段微生物組成的差異從而導致功能上的差異。

由于標本取材的特殊性，目前國內外研究均以糞便中微生物代替腸道微生物，尚無健康野生樹鼩不同腸段微生物組成的報道。本研究采用宏基因組測序技術，避開傳統(tǒng)活菌培養(yǎng)耗時較長、細菌生長條件特殊、培養(yǎng)技術復雜等缺點，對樹鼩不同腸段菌群組成進行分析研究。從研究中發(fā)現(xiàn)，野生樹鼩與人工飼養(yǎng)樹鼩在不同腸段菌群組成無論在門水平還是屬水平均有差異，通過微生物功能預測發(fā)現(xiàn)，各腸段差異較大，對于了解該物種腸道微生物群的組成具有重要意義，也為樹鼩作為新型實驗動物提供基礎數據。本研究基于成年樹鼩不同胃腸道段樣本，不能完全揭示整個生長周期胃腸道菌群的情況，將開展進一步的研究以進行完善。