王晨赫 周彥鋒 方弟安 張希昭 張 麗 劉劍羽 鄭 澤 尤 洋,

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室, 無錫 214081; 3. 青海省海西州可魯克湖養(yǎng)殖場, 青海 817000)

腸道微生物作為宿主的“重要器官”, 具有龐大的數(shù)量特征, 在長期進化的過程中, 宿主和腸道微生物相互影響, 腸道微生物在腸道內(nèi)形成了復雜的微生態(tài)系統(tǒng)[1], 同時在維持宿主的生理活動、幫助宿主營養(yǎng)吸收以及協(xié)助宿主的免疫調(diào)節(jié)具有重要作用[2]。在水產(chǎn)動物中, 影響腸道菌群結構的組成有4個方面, 包括宿主因素、環(huán)境因素、微生物相互作用因素以及個體之間的差異[3], 已有的研究在針對水生生物的不同遺傳背景[4,5]、不同食性[6,7]、不同生理狀態(tài)[6,8]、不同生存環(huán)境[9—11]及不同的飼料都做了深入的研究, 并且確定了部分水生動物腸道微生物的確切組成, 為后續(xù)開展研究不同生理狀態(tài)腸道菌群結構異同提供了基礎數(shù)據(jù)支撐。

河蟹, 又稱中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 作為中國特種經(jīng)濟水產(chǎn)動物, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)占據(jù)著重要地位。隨著20世紀90年代人工育苗難關的突破,極大地推動了河蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。隨著人工集約化程度的不斷提高, 養(yǎng)殖密度不斷加大, 在養(yǎng)殖池塘中存在著極大的種內(nèi)競爭, 不僅影響了河蟹的自身健康發(fā)展, 同時也嚴重制約了養(yǎng)殖效益的提高。而腸道微生物對于宿主是極其重要的, 處于正常生理狀態(tài)下的宿主擁有復雜且相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[12]。在河蟹養(yǎng)殖過程中, 由于投喂飼料的方式以及數(shù)量與河蟹的生長情況不相符, 造成河蟹出現(xiàn)上岸尋食以及自相殘食的狀況, 嚴重制約了河蟹的生長發(fā)育, 同時河蟹對于重攝食后腸道菌群的變化也缺乏對應的研究。而現(xiàn)有對于河蟹饑餓的研究還較為匱乏。因此研究河蟹在饑餓條件下以及重攝食后腸道菌群結構的變化對于幫助后續(xù)探索不同微生物在河蟹生理代謝的作用具有重要的參考價值。

關于河蟹腸道微生物還都集中在基礎研究的探索。Li等[13]通過qPCR方法得出河蟹腸道菌群數(shù)量在每克腸道108個左右, 狄盼盼等[13]和Chen等[14]分別通過分離培養(yǎng)和高通量測序分析得到河蟹腸道優(yōu)勢菌門分別為軟壁菌門(Tenericutes)、擬桿菌門(Bacteroidtes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。后續(xù)較為深入的研究包含了針對白班病毒(WSSV)與正常河蟹腸道微生物的異同[15,16]、河蟹腸道微生物、鰓微生物與水體微生物共有菌群探究[17]以及“蟹稻共生”兩種模式下河蟹腸道微生物的異同[18]。但針對正常、饑餓以及重攝食這3種狀態(tài)下腸道菌群結構的異同比較卻未見研究。

本文通過研究3種狀態(tài)下河蟹腸道微生物, 對比3種狀態(tài)下腸道微生物群落多樣性、群落結構以及3種狀態(tài)下的差異菌群, 旨在了解饑餓以及重攝食對于河蟹腸道菌群結構的影響, 為后續(xù)進一步確定腸道微生物功能以及在河蟹生理功能中的作用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗設計和材料采集

實驗所用河蟹于2017年7月采集于陽澄湖池塘(N120°79′, E 31°51′), 雄蟹初始體重為(72.19±5.68) g,雌蟹的初始體重為(61.92±6.46) g, 采樣回來的螃蟹隨機分成3組, 飼養(yǎng)于中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心的南區(qū)的3個水族箱1周, 并配合天邦人工飼料(蛋白質(zhì)水平32%, 粗脂肪水平4%)進行投喂,隨后設計饑餓實驗天數(shù)分別為7d和14d, 重攝食實驗天數(shù)分別為7d和14d[19—21]。對照組、饑餓7d、饑餓14d與重攝食7d每組3個重復, 重攝食14d設置2個重復。待每組實驗結束24h后, 從水族箱中隨機抽取規(guī)格無顯著差異的個體, 先用無菌水徹底清洗表面, 隨后使用75%無水乙醇擦拭表面身體, 隨后在無菌臺中取出腸道, 封存于無菌1.5 mL Ep管中,-80℃保存以備后續(xù)實驗使用。具體分組編號與信息見表 1。

表 1 樣品分組信息表Tab. 1 Sample grouping information

1.2 腸道總DNA提取、PCR擴增以及16s rRNA測序

所有腸道樣品采用動物組織DNA快速提取試劑盒提取(OMEGA Bio-Tek, Norcross, GA, USA),采用Qubit 4 Fluorometer熒光定量儀進行DNA濃度檢測, 選取未降解, 濃度較高的樣品進行后續(xù)瓊脂糖檢測完整度, 采用1.5%瓊脂糖膠凝膠電泳檢測DNA的完整度, 電壓為150 V, 時間為25min, 選取呈掃帚狀、合格的樣品用于PCR擴增。采用細菌16S rRNA基因V4區(qū)通用引物515F(5′-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3′)和 806R (5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)[22—25], 反應條件為94℃預變性5min, 然后為30個循環(huán), 每個循環(huán)為94℃變性30s,54℃退火30s, 72℃延伸30s, 循環(huán)結束后進行72℃持續(xù)10min結束反應。產(chǎn)物從1.5%瓊脂糖凝膠中切下并通過AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(AXYGEN Inc., Union City, CA USA)純化。將純化的產(chǎn)物進行Illumina Hiseq2500的高通量測序(BGI,Shenzhen, China)。

1.3 高通量數(shù)據(jù)生物學信息分析

測序采用雙端測序法, 原始數(shù)據(jù)下機后, 經(jīng)內(nèi)部程序刪除其含有超過2個與引物錯配reads; 去除某一堿基連續(xù)超過10 bp的reads; 去除含N的reads;如果窗口平均質(zhì)量值小于20, 則讀取序列的末端從窗口截斷, 并且移除具有最終讀取長度小于原始讀取長度的75%的reads[26], 從而獲得clean data。使用序列拼接軟件FLASH[27], 將雙端測序的reads利用重疊關系拼接成一個Tags, 設置最小匹配長度為15 bp,同時允許重疊區(qū)域的錯配率為0.1。利用軟件USEARCH將OTU在相似度97%水平下進行聚類[28],獲得OTU代表序列, 通過RDP classifer(v2.2)軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(Sliva V119)進行比對與物種注釋, 置信度閾值設置為0.6[29]。使用Mothur(v1.31.2)計算每個樣本的Alpha多樣性指數(shù)[30]。使用mothur中metastats分析不同組別差異菌群, 并通過Originlab2017進行箱型圖的繪制。

2 結果

2.1 不同狀態(tài)下腸道微生物多樣性分析

實驗從28個樣品中一共獲得了2416616條高質(zhì)量reads, 拼接獲得2783個OUT。16S rRNA的原始序列上傳至GeneBank, 登錄號為PRJNA477595。稀釋曲線顯示了樣品的中所測得的OTU數(shù)量隨著樣品序列的增多而變化的情況, 從圖 1可以看出, 隨著序列的增加, OTU數(shù)量已趨于一個穩(wěn)定值。而從樣品測序覆蓋程度上看, 28個樣品中覆蓋值均大于99%, 表明樣品中細菌基本上被確定(圖 2)。

Alpha多樣性(Alpha diversity)指數(shù)包含了Observed species指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)等。前面4個指數(shù)越大,最后一個指數(shù)越小, 說明樣品中的物種越豐富。各分組的Alpha多樣性指數(shù)見圖 3。其中雄蟹饑餓7d與對照組、饑餓14d、重攝食7d以及14d在Ob-served species指數(shù)與Chao指數(shù)具有顯著差異(P＜0.05), 而在饑餓7d與重攝食14d在Ace指數(shù)具有顯著差異(P＜0.05), 與其他組別無顯著差異(P＞0.05)?？傮w看來, 雌雄個體在饑餓7d腸道微生物群落顯示多樣性指數(shù)最高, 而后隨著饑餓時間的增加以及重攝食后, 腸道微生物多樣性指數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢; 值得注意的是, 雌雄蟹在重攝食7d時, 雄蟹腸道微生物多樣性顯示短暫的上升, 但雌蟹腸道微生物多樣性依然呈現(xiàn)下降趨勢。且在腸道微生物群落均勻度指數(shù)上, 雌蟹在重攝食7d時腸道微生物均勻度指數(shù)依然呈現(xiàn)增加趨勢, 菌群群落更加單一, 而在雄蟹中, 重攝食7d, 均勻度指數(shù)呈現(xiàn)短暫的下降趨勢, 菌群群落更加多樣。結果表明, 短暫的饑餓會致使河蟹腸道微生物多樣性的增加, 但在持續(xù)的饑餓下,腸道微生物多樣性呈現(xiàn)下降趨勢, 但在重攝食后,雌雄蟹出現(xiàn)差異, 雄蟹較雌蟹表現(xiàn)出更強的適應能力。

2.2 不同狀態(tài)下腸道微生物菌群組成分析

圖 1 樣品稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction analysis of the sample

圖 2 測序深度覆蓋曲線圖Fig. 2 Sequencing depth coverage curve

從28個樣品測得的序列利用軟件USEARCH將OTU在相似度97%水平下進行聚類, 獲得OTU代表序列, 通過與數(shù)據(jù)庫(Sliva V119)進行比對與物種注釋, 共將所有菌群分為25個菌門(圖 4)。其中在5個組別中, 有4個優(yōu)勢菌門, 分別為變形菌門(Proteobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes), 這4個菌門的相對豐度在總菌門的總占比為97.21%—98.85%。分析比較饑餓以及重攝食對菌門所占比例, 發(fā)現(xiàn)在雌蟹個體中, 變形菌門在對照組、饑餓7d、饑餓14d、重攝食7d以及重攝食14d所占據(jù)的比例分別為42.09%、43.25%、57.74%、14.58%和30.33%,而軟壁菌門在5個組別中所占據(jù)的比例分別為36.9%、33.2%、12.55%、66.88%和54.01%。在雄蟹的個體中, 變形菌門在5個組別中所占的比例分別為43.55%、13.56%、25.79%、33.49%和47.94%,軟壁菌門所占據(jù)的比例為26.01%、53.49%、51.22%、20.95%和36.7%。總體來看, 饑餓會致使雌蟹腸道微生物中的變形菌門所占比例升高, 而軟壁菌門占比會呈現(xiàn)下降趨勢, 重攝食后, 變形菌門會恢復至對照組水平, 軟壁菌門卻會出現(xiàn)大幅度上升并在腸道微生物中保持較高的占比。但是饑餓會致使雄蟹腸道微生物的變形菌門所占比例下降, 而軟壁菌門占比出現(xiàn)上升趨勢, 在重攝食后, 變形菌門恢復至對照組水平, 但軟壁菌門同樣會出現(xiàn)較大幅度上升趨勢。值得一提的是, 不管是雌蟹還是雄蟹, 擬桿菌門在饑餓發(fā)生后較對照組占比會有所上升, 但在重攝食后, 會恢復至對照組水平。蟹腸道微生物的變形菌門所占比例下降, 而軟壁菌門占比出現(xiàn)上升趨勢, 在重攝食后, 變形菌門恢復至對照組水平, 但軟壁菌門同樣會出現(xiàn)較大幅度上升趨勢。值得一提的是, 不管是雌蟹還是雄蟹, 擬桿菌門在饑餓發(fā)生后較對照組占比會有所上升, 但在重攝食后, 會恢復至對照組水平。

圖 3 基于Alpha指數(shù)分析比較樣品中細菌群落多樣性Fig. 3 Comparison and analysis of bacterial communities in samples based on Alpha index

圖 4 樣品中在門水平中菌群豐度組成與變化趨勢Fig. 4 Composition and trends of bacteria in the sample of Phylum-level

2.3 不同狀態(tài)下腸道微生物差異菌群比較

將28個樣品分為5組, 應用Metastats差異分析進行組間比較, 共得到了8個具有在豐度上顯著差異菌群, 其中科水平有差異的菌群有2個, 屬水平有差異的菌群為6個。其中8個菌群有5個屬于變形菌門, 2個屬于擬桿菌門, 1個屬于軟壁菌門, 且在對比這8個菌群在不同狀態(tài)下我們發(fā)現(xiàn)(表 2和圖 5), 變形菌門中希瓦氏菌屬(Shewanella)、Defluviicoccus菌屬以及氣單細胞菌屬(Aeromonas)隨著饑餓時間的增加, 豐度呈現(xiàn)增加趨勢, 但在重攝食后, 豐度均有所下降, 擬桿菌門中的子單胞菌科(Porphyromonadaceae)趨勢也與之相似; 但在擬桿菌門中,擬桿菌屬(Bacteroides)卻是隨著饑餓時間的增加,豐度有所上升, 在重攝食7d后, 菌群豐度達到最大值, 在重攝食14d后, 菌群豐度恢復至正常水平; 軟壁菌門雖然只有一個Candidatus Bacilloplasma菌屬在組別中具有顯著差異(P＜0.05), 但在腸道菌群所占據(jù)的比例中, 卻是在這8個菌群中占據(jù)比例最高的, 在腸道菌群中占據(jù)著重要的地位。其豐度隨著饑餓時間的增加, 豐度有所下降, 在重攝食7d后, 會有所上升, 在重攝食14d后, 豐度下降且低于對照組豐度。紅環(huán)菌科(Rhodobacteraceae)在饑餓腸道中豐度呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢, 但在重攝食14d后, 菌群豐度下降至對照組水平; 而不動菌屬(Acinetobacter)饑餓組以及重攝食組豐度均低于對照組豐度,且對照組與除饑餓14d的其他三組均具有顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

3.1 不同狀態(tài)下河蟹腸道菌群多樣性分析

饑餓, 作為一種非正常生理狀態(tài), 不僅是動物本身, 腸道其作為營養(yǎng)吸收與維持生理的重要場所,也面臨著巨大的挑戰(zhàn)[31]。在本研究中, 河蟹在饑餓脅迫7d和14d后, 雌雄蟹腸道菌群多樣性均呈現(xiàn)下降趨勢。有研究表明, 在面對饑餓時, 機體與腸道微生物同時面對能源危機, 機體會傾向于縮小腸道“尺寸”[32—34]。而與此同時, 腸道微生物面對“空間危機”會相應的發(fā)生菌群多樣性和相對豐度的改變。例如斑馬魚[35]等在饑餓脅迫下, 腸道微生物多樣性呈現(xiàn)下降趨勢, 這與本研究中河蟹在饑餓脅迫下腸道微生物多樣性呈現(xiàn)下降趨勢結果一致。

腸道微生物的群落多樣性與宿主的健康有著密切的關系[36—38]。有研究表明, 人類腸道梭菌屬引起的相關腹瀉、肥胖均與腸道微生物群落多樣性有關, 且在增加腸道微生物多樣性會提高人體的健康程度[39,40]。而在水生動物中, 魚類的紅鰓病會致使腸道微生物多樣性低于健康的個體[41]。Hou等[42]在研究患白便綜合征的蝦相較于健康蝦來說腸道微生物多樣性較低。在本研究中, 饑餓作為一種非正常、不健康的生理狀態(tài), 通過饑餓以及重攝食對于河蟹腸道微生物多樣性的影響。結果表明, 在饑餓第7天, 雌雄個體腸道微生物多樣性會出現(xiàn)短暫的上升, 但在饑餓14d、重攝食7d與14d后, 雌雄個體腸道微生物均呈現(xiàn)下降趨勢。這與tran等[43]在對草魚(Ctenopharyngodon idellus)進行饑餓實驗中腸道微生物多樣性變化趨勢相似。

表 2 不同狀態(tài)具有顯著差異菌群匯總Tab. 2 Significant different bacteria groups under different states

圖 5 不同狀態(tài)下具有顯著差異菌群(P＜0.05)相對豐度比較Fig. 5 The of relative abundances of significantly different flora in different states (P＜0.05)

3.2 不同狀態(tài)下菌群組成差異分析

腸道微生物作為腸道的“內(nèi)穩(wěn)態(tài)”, 在維持宿主生理免疫、營養(yǎng)吸收等方面具有重要作用[2]。每個宿主體內(nèi)都有一些穩(wěn)定且長期存在的群落結構, 我們通常稱之為“優(yōu)勢菌群”, 在Chen等[14]和Zhang等[17]研究中, 河蟹腸道微生物的優(yōu)勢菌門為軟壁菌門、變形菌門、擬桿菌門以及厚壁菌門, 而其中軟壁菌門占比最好, 變形菌門次之。而在本研究中, 對照組中河蟹腸道微生物占比最高為軟壁菌門, 變形菌門次之, 而隨著饑餓時間的增加, 河蟹腸道微生物中軟壁菌門占比逐漸降低, 而變形菌門占比逐漸升高, 并在優(yōu)勢菌門中占比最高; 這一結果與草魚[43]、尼羅羅非魚[44]以及斑馬魚[35]等水生動物在饑餓狀態(tài)下腸道菌門變化趨勢一致。但在重攝食后, 河蟹腸道微生物中軟壁菌門占比迅速增加, 在優(yōu)勢菌門中占比最高, 變形菌門占比迅速降低, 恢復至正常水平。有研究表明, 變形菌門在能力不平衡以及不穩(wěn)定腸道菌群中占比較高[45—47], 這與本研究結果一致。但在另外2個優(yōu)勢菌門, 擬桿菌門與厚壁菌門隨著饑餓的脅迫, 菌門占比不斷上升, 在重攝食后,菌門占比呈現(xiàn)下降趨勢, 這與Tran等[43]在草魚的饑餓研究以及Zhang等[48]在人類的研究結果不符, 但在菌門占比上, 需要結合絕對定量進行確認和探索。在菌群功能上, Zhang等[48]發(fā)現(xiàn)擬桿菌門以及厚壁菌門是未消化食物殘余物代謝的主要細菌, 但在本研究中, 在饑餓的脅迫下, 厚壁菌門和擬桿菌門, 特別是擬桿菌門的占比不斷升高, 且在重攝食后, 菌門占比恢復至對照組水平, 這一結果表明在河蟹腸道微生物菌群中, 厚壁菌門以及擬桿菌門的生理功能有待進一步探索。

在對比不同狀態(tài)的菌群進行差異分析, 我們統(tǒng)計了8個具有顯著差異的菌群, 隸屬于3個菌門。而在這8個菌群中, 只有1個Candidatus bacilloplasma菌屬隸屬于軟壁菌門, 且具有較大豐度, 而Candidatus bacilloplasma菌屬廣泛存在于海洋動物中,如蝦[49,50]、河蟹[14]、龍蝦[51]以及比目魚[52]等動物中。且前人的研究表明[53], 該菌屬附著于甲殼類胃腸道并與之共生的, 這一結論同樣在Chen等[14]對于河蟹“土著”菌群研究中得到證實。因此Candidatus bacilloplasma菌屬在河蟹腸道微生物菌群中占據(jù)著重要地位[14,53], 但該菌屬的功能還未清楚。進一步探索其功能, 為揭示其豐度變化對于河蟹腸道微生物以及宿主生理功能影響機制具有重要意義。

本研究結果表明, 河蟹腸道微生物在饑餓脅迫以及在重攝食后, 菌群的多樣性以及群落結構等方面會產(chǎn)生相應的變化, 同時, 篩選了8個在組別中具有顯著差異的菌群(P＜0.05)。本研究首次研究了饑餓以及重攝食對于河蟹腸道菌群結構的影響, 為河蟹饑餓以及重攝食的研究提供了較為全面的基礎數(shù)據(jù), 同時為進一步探究菌群的特定功能奠定了基礎。