玉米肽-香菇多糖螯合物對小鼠免疫功能的影響

劉 奇 張 智

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040)

玉米肽(Corn peptide，CP)是一種具有特定空間結(jié)構(gòu)和功能活性的短肽聚合物[1，2]。研究表明CP具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶[3，4]、降低血壓[5]、促進乙醇代謝、醒酒護肝[6]以及抗氧化[7-10]、緩解疲勞[11]、抗癌[12]等功能。張智[13]等以玉米肽為參照研究玉米肽-鋅(CP-Zn)螯合物的結(jié)構(gòu)表征和體內(nèi)抗氧化活性變化，結(jié)果表明CP-Zn的抗氧化活性優(yōu)于CP，且能顯著降低小鼠血清、肝臟中丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶的活力。香菇多糖是一種新資源功能活性物質(zhì)，研究表明香菇多糖具有抗氧化、抗腫瘤[14]提高機體免疫功能等生物活性[15-18]，若能利用香菇多糖結(jié)合玉米肽制成具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，功能活性較強的玉米肽-香菇多糖螯合物，并將其應(yīng)用于功能食品的開發(fā)中將有廣泛發(fā)展前景。

因此，本研究利用玉米肽-香菇多糖螯合物(CPG)進行動物實驗及細胞實驗。以CP及香菇多糖(G)為參照，將健康小鼠分為正常對照組；玉米肽低、中、高劑量組；玉米肽-香菇多糖低、中、高劑量組；香菇多糖低、中、高劑量組，通過小鼠生長性能(體重增長率、免疫器官指數(shù))、體液免疫能力(巨噬細胞增殖能力、巨噬細胞吞噬能力、免疫球蛋白水平)、細胞免疫能力(淋巴細胞增殖能力、淋巴細胞周期)等方面進行分析其免疫功能活性，為CPG的應(yīng)用及玉米加工副產(chǎn)物綜合利用等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

雄性SPF小鼠(20±2)g 6～8 周齡，合格證號SCXK黑2013-004：黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物評價中心；玉米肽(純度87.83%)、香菇多糖(純度89.62%)。

1.1.1 實驗試劑

WST-1 細胞培養(yǎng)液，印度墨汁(生物染色劑)，DNFB(優(yōu)級純)，Na2CO3(分析純)，PBS緩沖液，碘化丙啶，RNA 酶，多酚，胰酶，免疫球蛋白IgA、IgG試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

HF-90 CO2恒溫培養(yǎng)箱；AE31倒置顯微鏡；SW-CJ-IF型超凈工作臺；MEK-7222血細胞分析儀；MULTISKAN MK3型酶標(biāo)儀；LEICA RM2235石蠟切片機；101-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱；BD-326型臥式冷凍冰柜。

1.3 方法

1.3.1 玉米肽-香菇多糖修飾產(chǎn)物的制備

將CP(通過Sephadex G-25分級得到肽段，平均分子質(zhì)量為572 u，肽質(zhì)量分數(shù)80.01%)配制成底物濃度為4%的溶液，調(diào)節(jié)pH值至7，取50 mL玉米肽溶液，按投料比為8∶1的比例加入香菇多糖(香菇多糖平均分子質(zhì)量1 029 D，主要成分為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等)供體，再次調(diào)節(jié)pH值至7，60 ℃水浴40 min，冷卻后4 500r/min離心10 min；流水透析24 h，冷凍干燥得到最終修飾產(chǎn)物玉米肽-香菇多糖(CPG)[15,19]。經(jīng)檢測，組分中氨基酸總量為70.25%(主要成分為谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等)，玉米肽-香菇多糖螯合率為69.69%，CPG質(zhì)量分數(shù)為60.17%。

1.3.2 動物實驗分組及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，稱量小鼠體重，將小鼠按照體重指標(biāo)隨機分為10組，每組12只，采用基礎(chǔ)飼料飼喂，自由飲水，給藥劑量每只0.2 mL，具體給藥方法如下表。根據(jù)體重差異進行每組每天灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥30 d后處死，每組3次重復(fù)。給藥劑量根據(jù)《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法-2003》擬定[19]，動物飼養(yǎng)和處理遵循中國實驗動物科學(xué)協(xié)會實驗動物福利和倫理委員會(CALAS)的規(guī)定。

表1 功能實驗分組

1.3.3 小鼠生長性能的測定

停藥后隔日處死小鼠，稱取小鼠體重、脾臟、胸腺分別脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟(g)/體重(g)×100%

(1)

胸腺指數(shù)=胸腺(g)/體重(g)×100%

(2)

1.3.4 小鼠體液免疫能力的測定1.3.4.1 小鼠巨噬細胞增殖能力的測定[20]

末次給藥1 h后處死動物，75%酒精浸泡5 min，無菌環(huán)境中取出腹腔巨噬細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，取細胞沉淀，加4 mL紅細胞裂解液吹打均勻，室溫靜置5 min后，1 000 r/min離心5 min，取沉淀采用4 mL PBS洗滌3遍，重懸中含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后按5×106/孔接種于6孔板進行培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的巨噬細胞按照1×104/孔密度接種于96孔板，按照實驗分組進行培養(yǎng)12 h后，采用WST-1法檢測細胞增殖，將各組細胞加入20 μL WST-1溶液，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后，將96孔板置于搖床上搖動1 min，以充分混勻待檢測體系，以酶標(biāo)儀波長630 nm作為參考波長，在波長450 nm處測定吸光值。

1.3.4.2 小鼠吞噬能力的測定[20]

按每10 g體重0.1 mL的劑量向小鼠尾靜脈注射印度墨汁(10 mg/kg)，注射開始時計時，分別在2 min和10 min時取眼血20 μL于3 mL0.1%的Na2CO3溶液中，在600 nm處測定吸光值(OD)，以0.1%的Na2CO3溶液作為空白對照。將小鼠脫臼處死，取肝臟及脾臟并分別稱重，按公式計算吞噬指數(shù)a。

(3)

式中：a為吞噬指數(shù)；m0為小鼠體重/g；m1為小鼠肝重/g；m2為小鼠脾重/g；OD1為2 min時吸光值；OD2為10 min時吸光值。

1.3.4.3 小鼠免疫球蛋白水平的測定

免疫球蛋白測定參照IgA、IgG試劑盒說明。

1.3.5 小鼠細胞免疫能力的測定

1.3.5.1 小鼠淋巴細胞增殖能力的測定

同1.3.4.1操作。

1.3.5.2 小鼠淋巴細胞周期的測定[21]

染色液配制：用0.01 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液溶解1.00 mg 碘化丙啶(PI)和1.00 mg RNA 酶，配制成含100 μg/mL PI和100 μg/mL Rnase A的染色液，在-20 ℃下避光保存。

細胞周期檢測：無菌條件下取出小鼠脾臟按照細胞常規(guī)培養(yǎng)方法，用不同濃度的多酚處理后，用0.25%胰酶消化并將脾臟充分吹打成單個細胞懸液，將細胞收集于1.5 mL無菌離心管中，4 ℃ 以2 000 r/min離心5 min，用PBS緩沖液將細胞洗滌2次，離心5 min后，棄去PBS溶液，加入預(yù)冷的75%乙醇2 mL，重懸細胞，放入4 ℃冰箱內(nèi)固定24 h。

上機前將固定細胞以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去固定液，加入pH 7.2的PBS緩沖溶液重懸細胞，離心5 min，棄PBS緩沖液，加入含100μg/mL PI和100 μg/mL Rnase A的染色液，4 ℃避光染色30 min后，使細胞分散后于74 μm篩網(wǎng)過濾，上流式細胞儀檢測。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Excel軟件進行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPG對小鼠生長性能的影響

2.1.1 CPG對體重指數(shù)的影響

CP、CPG、G對小鼠體重的影響見圖1。與正常組相比，CP-H和CPG-M、CPG-H均能顯著提高小鼠體重水平。這表明CPG和CP均能提高小鼠的體重增長率，但CP需要在高劑量的水平下才能達到顯著效果。

注：不同字母表示差異顯著P<0.05，下同。圖1 CP、CPG、G對小鼠體重的影響

2.1.2 CPG對免疫器官指數(shù)的影響

胸腺是重要的中樞免疫器官，其主要功能是產(chǎn)生T淋巴細胞和分泌胸腺素，參與細胞免疫；脾臟是外周免疫器官，具有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，但B淋巴細胞比例較大，與體液免疫關(guān)系更為密切，因此胸腺、脾臟是機體重要的免疫器官，而其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱。由圖2可知，與空白組相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-M、G-H組均能顯著(P<0.05)提高免疫器官指數(shù)，且CPG較CP組的效果更加明顯。CP、CPG、G均能顯著提高小鼠的生長性能指數(shù)，且CPG較CP組效果更加顯著。

圖2 CP、CPG、G對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.2 CPG對小鼠體液免疫的影響

2.2.1 CPG對小鼠巨噬細胞增殖能力的影響

CP、CPG、G對小鼠巨噬細胞增殖能力的影響見圖3。細胞增殖指細胞經(jīng)過DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等反應(yīng)而進行的分裂過程，是生命體的重要特征。RAW264.7 細胞作為巨噬細胞的一種，當(dāng)病原體入侵或自身組織出現(xiàn)病理性改變時，它能激活機體的免疫系統(tǒng)，通過細胞內(nèi)殺傷作用消滅抗原[20]。由圖3可知，與正常組相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H，G-M、G-H均能顯著(P<0.05)提高小鼠巨噬細胞的增殖能力，且CPG的效果要優(yōu)于CP和G。

圖3 CP、CPG、G對小鼠巨噬細胞增殖能力的影響

2.2.2 CPG對小鼠吞噬能力的影響

CP、CPG、G對小鼠吞噬能力的影響見圖4。吞噬能力指巨噬細胞通過吞噬侵入的病原體及體內(nèi)衰老、畸變的細胞而提高機體的免疫能力。在小鼠碳廓清實驗中，體內(nèi)碳顆粒被清除的速率與血碳濃度呈指數(shù)關(guān)系，且動物的脾臟、肝影響機體的吞噬速率，其吞噬能力的大小可以間接反映機體巨噬細胞的吞噬能力，可以在一定程度上體現(xiàn)出機體的非特異性體液免疫水平[22]。由圖4可知，與正常組相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-H劑量組均能顯著(P<0.05)提高小鼠的吞噬能力，且CPG的效果要優(yōu)于CP和G-H。這表明CP、CPG、G均能顯著提高小鼠巨噬細胞的增殖能力和吞噬能力，且和劑量呈現(xiàn)正相關(guān)，從而發(fā)揮提高機體體液免疫的生物學(xué)功能。

圖4 CP、CPG、G對小鼠吞噬指數(shù)的影響

2.2.3 CPG對小鼠免疫球蛋白水平的影響

CP、CPG、G對小鼠免疫球蛋白水平的影響見圖5。免疫球蛋白是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白，一般存在于血液及某些細胞的表面上，血清免疫球蛋白的測定是檢查體液免疫功能最常用的方法。IgG是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75%，其主要在機體免疫中起保護作用[23]。IgA分血清型和分泌型兩種，血清型IgA可介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC作用；分泌型IgA(SIgA)是機體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分，它能抑制微生物在呼吸道上皮附著，減緩病毒繁殖，是防止病原體入侵機體的第一道防線。由圖5可知，與正常組相比，CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H顯著(P<0.05)提高機體免疫球蛋白IgA水平；CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-H均能顯著(P<0.05)提高機體免疫球蛋白IgG。

圖5 CP、CPG、G對小鼠體液免疫功能的影響

2.3 CPG對小鼠細胞免疫的影響

2.3.1 CPG對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

CP、CPG、G對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響見圖6。T淋巴細胞在機體細胞免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，當(dāng)外界應(yīng)激源和腫瘤細胞抗原接觸T細胞時，會刺激T細胞增殖、分化成效應(yīng)T細胞，產(chǎn)生細胞免疫和抗腫瘤反應(yīng)[24]，因此，淋巴細胞增殖實驗是反映機體免疫狀態(tài)的一種實驗。由圖6可知，與正常組相比，CP-H和CPG-M、CPG-H、G-H能顯著(P<0.05)提高小鼠巨噬細胞的增殖能力。這表明CP、CPG、G都能促進機體的淋巴細胞增殖能力進而達到提高機體細胞免疫水平。

圖6 CP、CPG、G對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

2.3.2 CPG對小鼠淋巴細胞周期的影響

CP、CPG、G對小鼠淋巴細胞周期的影響見圖7。淋巴細胞增殖是機體發(fā)揮細胞免疫的重要途徑，當(dāng)淋巴細胞與抗原或有絲分裂因子(簡稱為絲裂原)在體外共同培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，并且分裂增殖生成更多的淋巴細胞進行發(fā)揮細胞免疫[25]。結(jié)合前期實驗發(fā)現(xiàn)，CP-H和CPG-H、G-H高劑量組具有最佳的生物活性能，因此，此處主要采用流式細胞儀檢測空白對照組、CP-H高劑量組與CPG-H和G-H的脾淋巴細胞分布情況。識別DNA損傷的關(guān)鍵是G1、S期和G2/M等周期檢查點。由圖7可知，空白對照組、CP-H劑量組與CPG-H、G-H劑量組的G0/G1期比例分別為92.42%、88.47%、87.88%、89.56%；S期比例分別為2.77%、4.13%、4.41%、3.31%；G2/M比例分別為3.18%、7.99%、9.70%、4.98%。CP-H劑量組、CPG-H、G-H劑量組與空白對照組相比G1分別減少了3.95%、4.54%、2.48%；S期分別增加了1.36%、1.64%、1.15%，這說明CPG較CP、G更能促進細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，有利于DNA的合成，提高小鼠脾淋巴細胞增殖分化能力。

圖7 流式細胞術(shù)檢測脾淋巴細胞周期分布

3 結(jié)論

利用玉米肽-香菇多糖螯合物(CPG)進行小鼠體內(nèi)及細胞實驗，結(jié)果表明：CP、CPG、G能顯著提高小鼠生長性能，且CPG組較CP和G組能顯著提高免疫器官指數(shù)，對免疫器官發(fā)育的促進作用要優(yōu)于CP；CP高劑量組、CPG低中高劑量組、G高劑量組均能顯著(P<0.05)提高小鼠體液免疫能力，增強小鼠巨噬細胞的增殖能力、吞噬能力，提高免疫球蛋白IgA和IgG水平，這表明CPG對機體體液免疫能力的提升作用要優(yōu)于CP和G；小鼠細胞免疫能力方面，CP和CPG均能促進小鼠淋巴細胞增殖能力，且CPG較CP更能促進有絲分裂，不影響阻滯細胞，促進細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，有利于DNA的合成，提高小鼠脾淋巴細胞增殖分化能力。研究表明CPG對機體的免疫增強效果要優(yōu)于CP，其可以通過促進小鼠機體生長性能、體液免疫能力水平、細胞免疫能力水平發(fā)揮其免疫生物學(xué)活性。