漢麻籽多肽的氨基酸營養(yǎng)組成與體外結(jié)合膽酸鹽能力的研究

魏連會 宋淑敏 董 艷 潘 靜

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院1，大慶 163319)

(黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院2，哈爾濱 150028)

漢麻 (CannabissativaL., Hemp)也稱火麻、大麻、線麻、黃麻等，是大麻科大麻屬一年生草本植物，在我國各地廣泛種植，具有悠久的歷史[1-2]。中國種植的大麻多為四氫大麻酚(Δ-9-tetrahydrocannabinol, THC)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3%的工業(yè)大麻，為無毒品種[3-4]。

漢麻籽作為油料食品，在我國云南、甘肅等地一直被食用。漢麻籽具有很好的營養(yǎng)價(jià)值，含有脂肪酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、纖維素、維生素、和礦物質(zhì)[5-6]。其中漢麻籽油中不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上，ω-6和ω-3的比例接近人體生理代謝的最佳比例。漢麻籽含有20%以上的蛋白質(zhì)，不含有酶蛋白抑制因子和致敏物。特別是精氨酸含量高于一般的植物蛋白，含有豐富的人體必需氨基酸，是一種完整的植物營養(yǎng)來源[7]，漢麻籽中還含有特殊酚類、甾醇、萜類物質(zhì)賦予其藥學(xué)功效[8]。漢麻籽被列入2000版的《中華人民共和國藥典》，2001年漢麻籽被列入“藥食同源”名單[9]。

漢麻籽在油脂、蛋白方面營養(yǎng)獨(dú)特，在歐、美、日、韓等發(fā)達(dá)國家已被開發(fā)成功能性食品或保健品，而我國尚處于初加工階段，有待進(jìn)行高附加值產(chǎn)品的開發(fā)。郭慶啟等[10]研究了毛榛榛仁肽的氨基酸營養(yǎng)組成與總還原能力，發(fā)現(xiàn)制備出的2種多肽組分，其限制性氨基酸分別為賴氨酸和亮氨酸，通過總還原力評價(jià)，證明2種多肽組分均具有抗氧化活性。張文敏等[11]進(jìn)行了工業(yè)亞麻籽粕制備小分子抗氧化肽的研究，通過對亞麻籽粕蛋白的組分分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氨基酸組成齊全，含有所需的8種必須氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，所制備的活性肽具有抗氧化活性。目前國內(nèi)鮮有對漢麻籽多肽氨基酸營養(yǎng)組成評價(jià)及其體外結(jié)合膽酸鹽能力研究的相關(guān)報(bào)道。

筆者研究團(tuán)隊(duì)前期對漢麻籽多肽的制備工藝進(jìn)行了研究，確定了漢麻籽多肽的最佳制備工藝條件[12]。而本研究通過超濾膜過濾系統(tǒng)對酶解后的水解液進(jìn)行分離純化，對得到的漢麻多肽組分，依據(jù)氨基酸比值系數(shù)和FAO/WHO氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)[13]，進(jìn)行了相關(guān)的營養(yǎng)評價(jià)并考察其體外結(jié)合膽酸鹽能力[14]，以期進(jìn)一步弄清氨基酸組成和分子質(zhì)量大小與漢麻籽多肽降血脂活性之間的聯(lián)系，為漢麻籽高值化加工利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 原料和試劑

漢麻籽多肽：黑龍江省科學(xué)院大慶分院自制；木瓜蛋白酶(酶活力為 8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力為 1.3×105U/g)；其他化學(xué)試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VFD-6000型真空冷凍干燥機(jī)；HA221-50-06型超臨界CO2萃取設(shè)備；BIOQ-MU1000型切向膜過濾系統(tǒng)；L-8900型氨基酸分析儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂漢麻籽粕的制備

用粉碎機(jī)將脫殼漢麻籽粉碎后，采用超臨界CO2進(jìn)行脫脂，超臨界CO2萃取脫脂的條件為：萃取溫度45 ℃、壓力30 MPa、萃取時(shí)間6.5 h、泵頻率18 Hz，將脫脂漢麻籽仁粕在45 ℃條件下烘干，過100目篩后置于封口袋中低溫保存。

1.3.2 漢麻籽多肽的制備

稱取一定質(zhì)量的漢麻籽粕，按照1∶5的比例加入蒸餾水溶解，加入3.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時(shí)間為3 h，水浴滅酶，離心分離得漢麻多肽混合液。

1.3.3 漢麻籽多肽的分離純化

將酶解得到的漢麻多肽混合溶液，通過切向流膜過濾系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，采用的過濾膜截留分子質(zhì)量為(1、3、5 ku)將漢麻籽多肽分成4段不同分子質(zhì)量的肽段，用真空冷凍干燥機(jī)凍干備用。

1.3.4 氨基酸的測定

采用L-8900型氨基酸分析儀檢測。參照GB/T 5009.124—2016的方法測定氨基酸，平行測定3次，以平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 漢麻籽多肽氨基酸組成的營養(yǎng)評價(jià)

漢麻籽多肽的營養(yǎng)評價(jià)方法按照1973年世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)提出的氨基酸模式[15]，其主要采用以下指數(shù)和公式進(jìn)行計(jì)算[16]：

必需氨基酸比值(REAA)=待評蛋白質(zhì)中某種必需氨基酸含量(mg/g)/(WHO/FAO)模式中相應(yīng)必需氨基酸的含量(mg/g蛋白)

氨基酸比值系數(shù)(RC)=必需氨基酸比值/必需氨基酸比值的均值

氨基酸比值系數(shù)分值(SRC)=100-CV×100

式中：CV為RC的變異系數(shù)，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值。

1.3.6 漢麻籽多肽各組分結(jié)合膽酸鹽能力評價(jià)

1.3.6.1 膽酸鹽的測定[17]

膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別準(zhǔn)確稱取膽酸鹽 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg 各置于100 mL 容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容。移取不同質(zhì)量濃度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液1 mL于15 mL具塞試管中，加入6 mL 45% 硫酸，混勻，加入 1 mL 0.3% 糠醛，混勻，于65 ℃ 恒溫水浴中反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后，于620 nm 波長處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.2 漢麻籽多肽對膽酸鹽吸附作用的測定

分別配制 6 mg/mL 膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c溶液，加入4 mg/mL的漢麻籽多肽溶液，于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h 后，6 000 r/min 離心分離 20 min。準(zhǔn)確移取 1 mL上清液，按照膽酸鹽的測定中糠醛顯色法測定 620 nm 波長處吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其膽酸鹽的質(zhì)量濃度。再根據(jù)反應(yīng)前后溶液中膽酸鹽的濃度差計(jì)算漢麻籽多肽對膽酸鹽的吸附量。

2 結(jié)果和討論

2.1 漢麻籽多肽的分離純化

采用切向流過濾系統(tǒng)，對酶解漢麻籽多肽的混合液進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)采用超濾膜(截留分子質(zhì)量為1、3、5 ku)對混合物進(jìn)行分離，得到4個(gè)不同分子質(zhì)量的多肽組分，各個(gè)組分和分子質(zhì)量范圍如表1所示。

表1 漢麻籽多肽各個(gè)組分分子質(zhì)量分布

2.2 漢麻籽多肽組分的氨基酸組成分析和營養(yǎng)學(xué)評價(jià)

經(jīng)氨基酸自動分析儀測定的漢麻籽多肽組分的必需氨基酸組成如表2所示，非必需氨基酸如表3所示，漢麻籽多肽的氨基酸評分如表4所示。

表2 漢麻籽多肽組分的必需氨基酸組成及含量/mg/g

表3 漢麻籽多肽組分的非必需氨基酸組成及含量/mg/g

注:非必需氨基酸含量為每克待測漢麻籽多肽中含有多少毫克的非必需氨基酸。

由表2、表3可知，漢麻籽多肽組分中，谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為22.32%、21.95%、22.44%、21.69%。精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之，分別占14.66%、14.04%、16.59%、13.69%。精氨酸對兒童的生長發(fā)育具有重要的作用，因此組分c適合兒童食用，以補(bǔ)充精氨酸。其中各個(gè)組分中必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.83%、24.46%、22.83%、25.19%，其中組分d中的必需氨基酸含量最高，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為0.3367，但低于FAO/WHO規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)40%和0.6比例。

由表4可知，在漢麻籽多肽的4種組分中，蛋氨酸和胱氨酸評分超過了國際推薦標(biāo)準(zhǔn)，但其他幾種必需氨基酸的評分略低，其中組分a、b中纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸分別為第一、第二、第三限制性氨基酸；組分c、d中纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸分別為第一、第二、第三限制性氨基酸。

表4 漢麻籽多肽組分的氨基酸評分

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)理論認(rèn)為，氨基酸不足和過剩都會影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值。因此依據(jù)氨基酸平衡理論可以對蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評估。氨基酸比值系數(shù)分值SRC越接近100，說明氨基酸在生理功能方面提供的作用越大，其營養(yǎng)價(jià)值越高。如果待分析蛋白質(zhì)中氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸一致，則各種氨基酸的比值系數(shù)RC為1，大于1或小于1，為氨基酸過剩和不足的體現(xiàn)，均為偏離氨基酸模式。對于漢麻籽多肽組分，根據(jù)氨基酸的種類和含量，計(jì)算出的必需氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)和比值系數(shù)分如表5所示。

由表5可知，漢麻籽多肽的4種組分中，根據(jù)SRC值的大小排列順序?yàn)椋航M分c>組分a >組分d>組分b。4個(gè)多肽組分的第一限制性氨基酸為纈氨酸，組分c的SRC值為48.83，可作為一種較優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源。

大部分研究發(fā)現(xiàn)多肽的氨基酸組成、連接順序、構(gòu)型決定特定的多肽功能。4種漢麻籽仁多肽組分中不同組成、不同類別、不同性質(zhì)的氨基酸組成和含量如表6所示。

表6 漢麻籽多肽組分中不同種類氨基酸的組成分析/mg/g

注：a為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸；b為絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、酪氨酸；c為賴氨酸、精氨酸、組氨酸；d為天門冬氨酸、谷氨酸；e為蛋氨酸；f為苯丙氨酸、酪氨酸。

表5 漢麻籽多肽組分的必需氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)及氨基酸比值系數(shù)分

2.3 漢麻籽多肽各個(gè)組分結(jié)合膽酸鹽測定

實(shí)驗(yàn)選取具有代表性的膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛黃膽酸鈉，作為研究對象考察不同分子質(zhì)量的漢麻籽多肽對膽酸鹽的結(jié)合能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表7 漢麻籽多肽組分對膽酸鹽的吸附能力

由表7可知，漢麻籽多肽組分對3類代表性膽酸鹽具有吸附作用，其中組分d的吸附能力大于其他3個(gè)組分，對膽酸鈉吸附率接近90%，對較難被吸附的?；悄懰徕c的吸附率也高于20%。因此可初步確定組分d 中具有較強(qiáng)降血脂作用的功能因子。實(shí)驗(yàn)以膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和?；悄懰徕c作為吸附對象，揭示了漢麻籽多肽通過吸附膽酸鹽，抑制其在腸道的吸收并將其排出體外，從而促進(jìn)膽固醇在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化成膽汁酸的降血脂機(jī)理，證實(shí)了漢麻籽多肽組分的降血脂作用。

漢麻籽多肽組分d，分子質(zhì)量小于其他組分，從分子大小角度分析來看，推斷水解度對產(chǎn)物的降血脂能力具有一定的影響，即水解度越大，產(chǎn)物的降血脂能力越強(qiáng)，因此為了制備出降血脂能力更強(qiáng)一些的漢麻籽多肽，可以調(diào)控反應(yīng)的水解度，并且選擇更適合的酶。

3 結(jié)論

通過對酶法制備的漢麻籽多肽組分的氨基酸組成和含量進(jìn)行分析，漢麻籽仁多肽4個(gè)組分的第一限制性氨基酸為纈氨酸，計(jì)算出氨基酸的比值系數(shù)分別為44.08、39.67、48.83、42.16，表明多肽組分的營養(yǎng)價(jià)值一般，但通過結(jié)合膽酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4種多肽組分都具有潛在降血脂作用，多肽組分d的潛在降血脂作用最強(qiáng)。