二價(jià)鈷離子對(duì)序批式反應(yīng)器性能、微生物活性及其微生物群落的影響?

趙長(zhǎng)坤, 于娜玲, 馬丙瑞, 李?yuàn)檴? 信帥帥, 武原原, 潘云浩, 吳淑妍, 高孟春??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100)

二價(jià)鈷離子(Co(II))是一種常見的重金屬離子，廣泛地存在于采礦、冶金、電鍍和電子制造等過程產(chǎn)生的工業(yè)廢水，其最終將進(jìn)入污水處理廠[1-2]。Co(II)是微生物合成維生素B12和其它鈷胺的必需微量元素，低濃度的Co(II)可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖。但是，高濃度的Co(II)可導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA損傷，引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)破壞和酶活性抑制，干擾細(xì)胞的新陳代謝，造成微生物生長(zhǎng)停滯甚至凋亡[3]。在廢水生物處理系統(tǒng)中有機(jī)物和氮化合物的去除主要依靠微生物來完成的，高濃度Co(II)的存在可能抑制微生物活性，引起微生物群落的變化，從而影響廢水處理系統(tǒng)的污染物去除性能。鑒于Co(II)的生物毒性效應(yīng)，Co(II)對(duì)廢水生物處理系統(tǒng)性能和微生物群落的影響已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。Gikas[4]研究發(fā)現(xiàn)Co(II)濃度在低于19 mg/L時(shí)能刺激活性污泥中微生物生長(zhǎng)，而其濃度超過40 mg/L時(shí)微生物生長(zhǎng)受到抑制。Bestawy等[5]通過逐漸增加序批式反應(yīng)器(SBR)中Co(II)濃度，發(fā)現(xiàn)0～20 mg/L Co(II)未對(duì)SBR性能產(chǎn)生影響，而40 mg/L Co(II)明顯抑制了SBR對(duì)COD的去除。Barnett等[6]報(bào)道當(dāng)進(jìn)水Co(II)濃度為0.06 mg/L時(shí)，活性污泥對(duì)COD的去除率與進(jìn)水中未添加Co(II)時(shí)相比提高了9%。Hernandez-Martinez等[7]研究了重金屬對(duì)活性污泥的抑制效果，結(jié)果表明與Co(II)濃度為0 mg/L時(shí)相比，Co(II)濃度為40 mg/L時(shí)活性污泥耗氧速率降低了40%。Cecen等[8]等通過批量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)15 mg/L的Co(II)能抑制活性污泥硝化性能，且其抑制效果與銅、鋅、鎳等相比較弱。Zou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，86.6 mg/L的Co(II)未對(duì)流化床反應(yīng)器的反硝化性能產(chǎn)生明顯抑制作用。然而，目前關(guān)于Co(II)濃度變化對(duì)脫氮速率、微生物酶活性和微生物群落影響的研究較少。因此，本文考察了不同進(jìn)水Co(II)濃度對(duì)SBR性能、活性污泥耗氧速率、硝化速率、反硝化速率、微生物酶活性以及微生物群落的影響，并評(píng)價(jià)了Co(II)對(duì)活性污泥的生物毒性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行條件

本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)玻璃管制成的SBR作為生物反應(yīng)裝置，其有效高度為50 cm，內(nèi)徑為14 cm，有效容積為7.7 L。SBR進(jìn)水由蠕動(dòng)泵控制，出水由反應(yīng)器中部的電磁閥控制，容積交換率為50%。SBR由時(shí)間繼電器自動(dòng)控制，每日運(yùn)行3個(gè)周期，每個(gè)周期8 h，具體運(yùn)行參數(shù)如下：進(jìn)水階段4 min，缺氧階段54 min，好氧階段290 min，缺氧階段105 min，沉淀階段20 min和排水階段7 min。在好氧階段，空氣通過曝氣泵從反應(yīng)器底部的砂芯微孔曝氣頭通入，并使用氣體轉(zhuǎn)子流量計(jì)調(diào)節(jié)曝氣量，維持溶解氧在2 mg/L以上。磁力攪拌器在缺氧階段運(yùn)行，確?；钚晕勰嗪退浞只旌希磻?yīng)器中溶解氧濃度小于0.5 mg/L。反應(yīng)器定期排出一定量的污泥以使污泥齡保持在20 天左右。

1.2 接種污泥及水質(zhì)

1.3 分析方法

2 結(jié)果與討論

2.1 Co(II)濃度變化對(duì)SBR性能的影響

2.2 Co(II)濃度變化對(duì)活性污泥SOUR和脫氮速率的影響

2.3 Co(II)濃度變化對(duì)微生物酶活性的影響

((a)SOUR；(b)SAOR和SNOR；(c)SNRR和SNIRR，“*”表示與未投加Co(II)的對(duì)照組SOUR和脫氮速率具有顯著性差異(p<0.05)，誤差線代表三次實(shí)驗(yàn)測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差。 (a) SOUR, (b) SAOR and SNOR, (c) SNIRR and SNRR. Asterisks indicate the statistical difference (p< 0.05) from the SOUR and nitrogen removal rate at 0 mg/L Co(II). Error bars represent standard deviations determined from measurements performed in triplicate.)

圖2 Co(II)濃度變化對(duì)活性污泥比耗氧速率和脫氮速率的影響
Fig.2 Effects of Co(II) on SOUR and nitrogen removal rate

2.4 Co(II)濃度變化對(duì)活性污泥生物毒性的影響

ROS產(chǎn)生量是評(píng)價(jià)重金屬細(xì)胞毒性的重要依據(jù)，而LDH釋放量是反映細(xì)胞膜完整性的客觀指標(biāo)[15-16]。如圖4所示，與進(jìn)水中未添加Co(II)時(shí)相比，當(dāng)進(jìn)水Co(II)濃度為2、5、10和20 mg/L時(shí)，活性污泥ROS產(chǎn)生量分別增加了4.56%、9.38%、25.06%和49.12%。水中Co(II)會(huì)被活性污泥吸附，進(jìn)而滲透進(jìn)微生物細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生物毒性作用，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致更多的ROS生成，從而打破了氧化劑和抗氧劑之間的平衡。較高的ROS水平能夠?qū)ξ⑸锛?xì)胞造成氧化性損傷，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]，從而影響活性污泥的有機(jī)物去除和脫氮性能。隨進(jìn)水Co(II)濃度的升高，活性污泥中ROS產(chǎn)生量呈上升趨勢(shì)，表明細(xì)胞受到的毒性效應(yīng)隨Co(II)濃度升高而逐漸增強(qiáng)。與進(jìn)水中未添加Co(II)時(shí)相比，活性污泥LDH釋放量在進(jìn)水Co(II)濃度為2、5、10和20 mg/L時(shí)分別提高了4.94%、10.63%、30.94%和56.79%，表明Co(II)的存在能夠造成活性污泥微生物細(xì)胞膜損傷，從而影響微生物形態(tài)。隨著進(jìn)水中Co(II)濃度逐漸增加，細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，活性污泥LDH釋放量與ROS產(chǎn)生量有相似的變化趨勢(shì)，因此Co(II)誘導(dǎo)的ROS積累可能是導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性破壞及LDH釋放量增加的重要觸發(fā)因素。

((a)DHA；(b)AMO和NOR；(c)NR和NIR， “*”表示與未投加Co(II)的微生物酶活性具有顯著性差異(p<0.05)，誤差線代表三次實(shí)驗(yàn)測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差。 (a) DHA, (b) AMO and NOR, (c) NR and NIR. Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial enzymatic activities at 0 mg/L Co(II). Error bars represent standard deviations determined from measurements performed in triplicate.)

圖3 Co(II)濃度變化對(duì)微生物酶活性的影響
Fig.3 Effects of Co(II) on microbial enzymatic activities

(“*”表示該樣品與進(jìn)水Co(II)濃度為0 mg/L的樣品差異性顯著(p<0.05)，誤差線代表三次實(shí)驗(yàn)測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差。Asterisks indicate statistical differences (p<0.05) from the ROS production and LDH release at 0 mg/L Co(II). Error bars represent standard deviations determined from measurements performed in triplicate.)

圖4 Co(II)濃度變化對(duì)活性污泥ROS相對(duì)產(chǎn)生量和LDH相對(duì)釋放量的影響
Fig.4 Effect of Co(II) on the relative ROS production and LDH release of activated sludge

2.5 Co(II)濃度變化對(duì)微生物群落的影響

表1為不同進(jìn)水Co(II)濃度下微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)變化情況。對(duì)進(jìn)水Co(II)濃度為0、2、5、10和20 mg/L時(shí)的活性污泥樣品在97%序列一致性閾值下進(jìn)行聚類統(tǒng)計(jì)，分別得到806、693、628、488和381個(gè)操作分類單元(OTUs)。所有污泥樣品Good’s coverage指數(shù)均在0.998以上，說明各樣品測(cè)序深度充足，能夠準(zhǔn)確地反映微生物群落豐富度和多樣性。Chao1和ACE指數(shù)能夠反映微生物群落的豐富度，而Shannon和Simpson指數(shù)能夠表征微生物群落的多樣性[18-19]。隨著進(jìn)水Co(II)濃度從0 mg/L逐漸增加至20 mg/L，Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別從797.6、804.3、6.89和0.997逐漸降低到404.8、415.2、3.79和0.853。較高Co(II)濃度明顯地降低活性污泥中微生物的多樣性和豐富度。

表1 不同Co(II)濃度下微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)Table 1 Richness and diversity indices of microbial community at different Co(II) concentrations

((a)門水平；(b)屬水平。 (a) Phyla level; (b) Genus level.)圖5 不同Co(II)濃度下微生物群落在門和屬水平上的分類Fig.5 Microbial community analysis of activated sludge at different Co(II) concentrations

不同進(jìn)水Co(II)濃度對(duì)微生物群落在門和屬水平上的影響如圖5所示。在門水平上(見圖5(a))，隨著進(jìn)水Co(II)濃度從0 mg/L升至5 mg/L，Proteobacteria的相對(duì)豐度從51.69%降至35.28%，而當(dāng)進(jìn)水Co(II)濃度升至20 mg/L時(shí)，Proteobacteria的相對(duì)豐度增加到71.02%。這可能是由于低濃度的Co(II)促進(jìn)了某些微生物菌群的生長(zhǎng)繁殖，使Proteobacteria所占比例降低，而Proteobacteria則對(duì)高濃度Co(II)具有較強(qiáng)的耐受能力。Bacteroidetes的相對(duì)豐度從進(jìn)水0 mg/L Co(II)時(shí)的20.06%升至5 mg/L Co(II)時(shí)的56.19%，而在進(jìn)水Co(II)濃度為20 mg/L時(shí)降至24.46%。結(jié)果表明低于5 mg/L的Co(II)對(duì)Bacteroidetes的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，而高濃度的Co(II)抑制其生長(zhǎng)繁殖。Ignavibacteriae、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Acidobacteria和Chlorobi等的相對(duì)豐度均隨進(jìn)水Co(II)濃度的升高呈下降趨勢(shì)，表明Co(II)的存在對(duì)這些微生物菌群的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，從而影響SBR去除有機(jī)物和氮的性能。在屬水平上(見圖5(b))，隨著進(jìn)水Co(II)濃度從0 mg/L升至5 mg/L，Nitrosomonas和Nitrospira的相對(duì)豐度從0.75%和0.52%增加到1.56%和0.81%，而在進(jìn)水Co(II)濃度為20 mg/L時(shí)下降到0.39%和0.01%。Nitrosomonas是一種常見的氨氧化菌屬，能夠?qū)睉B(tài)氮氧化為亞硝態(tài)氮[20]；而Nitrospira是主要的亞硝酸鹽氧化菌屬，能夠?qū)喯鯌B(tài)氮氧化為硝態(tài)氮[21]。Luteimonas[22]、Flavobacterium[23]、Comamonas[24]等反硝化菌屬的相對(duì)豐度隨進(jìn)水Co(II)濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。隨著進(jìn)水Co(II)濃度從0 mg/L增加到20 mg/L，反硝化菌屬Thauera[25]的相對(duì)豐度從1.16%下降至0.55%，而反硝化菌屬Zoogloea[26]的相對(duì)豐度從0.03%上升至3.53%，表明Zoogloea菌屬對(duì)Co(II)毒性具有較強(qiáng)的抵抗能力。上述結(jié)果表明，Co(II)濃度變化對(duì)硝化菌屬及反硝化菌屬的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致與硝化及反硝化過程有關(guān)的微生物群落的相對(duì)豐度發(fā)生變化，進(jìn)而影響SBR的脫氮效果。此外，隨著進(jìn)水Co(II)濃度的升高，Adhaeribacter、Ohtaekwangia、Terrimonas、Defluviicoccus、Nannocystis和Ferruginibacter等菌屬的相對(duì)豐度呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，而Steroidobacter、Ignavibacterium、Haliscomenobacter、Empedobacter、Gemmatimonas和CandidatusCompetibacter等菌屬的相對(duì)豐度逐漸降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同進(jìn)水Co(II)濃度下，活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生了明顯變化，進(jìn)而對(duì)SBR性能產(chǎn)生一定影響。

3 結(jié)論

(2) 低濃度的Co(II)可以促進(jìn)活性污泥的SOUR、脫氮速率和微生物酶活性，但高濃度Co(II)抑制了SOUR、脫氮速率和微生物酶活性。

(3) 活性污泥ROS產(chǎn)生量和LDH釋放量隨進(jìn)水Co(II)濃度升高而增加。

(4) 微生物群落的豐富度和多樣性隨著進(jìn)水Co(II)濃度的增加而降低。活性污泥中硝化菌屬(Nitrosomonas、Nitrospira)和反硝化菌屬(Luteimonas、Flavobacterium、Comamonas、Thauera和Zoogloea)的相對(duì)豐度變化影響了SBR的脫氮性能。