李奧運， 王宣剛， 王欣桐， 王志剛， 于海洋

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室, 山東 青島 266003)

母源性免疫(Maternal immunity)是指從母體到后代通過胎盤、初乳、乳汁或卵子傳遞的免疫能力，有利于增強后代抵抗致病性細(xì)菌的能力[1]。由于受精卵是一個封閉的微室，魚卵在發(fā)育過程中，只能依賴于母體提供的免疫物質(zhì)(包括免疫球蛋白、補體因子、溶菌酶、凝集素、蛋白酶抑制劑等)來抵抗病原體的入侵[2-3]。凝集素(Lectin)是先天免疫反應(yīng)的可溶性碳水化合物結(jié)合效應(yīng)蛋白，其與致病菌表面結(jié)構(gòu)相互作用，導(dǎo)致調(diào)理作用、吞噬作用或補體活化的作用[4]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，從細(xì)菌到脊椎動物的各個進化分支中，卵中的蛋白質(zhì)均發(fā)現(xiàn)一種碳水化合物結(jié)合蛋白，可以凝集糖類化合物，因此將其命名為魚卵凝集素[5]。目前在許多硬骨魚中鑒定出來魚卵凝集素，包括斑馬魚(Daniorerio)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、金魚(Carassiusauratus)、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)、柳葉魚(Osmeruslanceolatus)、大馬哈魚(Oncorhynchusketa)、鯰魚(Silurusasotus)和香魚(Plecoglossusaltivelis)等[5-11]。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚FEL具有母源性表達(dá)，在未受精的卵中和胚胎的早期發(fā)育過程中均有表達(dá)，因此在魚類的早期胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)EL基因可能在抵抗外來微生物的入侵中扮演重要角色，在仔稚魚生長發(fā)育過程中起到抵抗致病菌感染的作用[1, 12-13]。在對FEL組織特異性分析中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的FEL基因在卵巢中表達(dá)量最高，在精巢和肝臟中的表達(dá)次之，而在其他組織中不表達(dá)或者微量表達(dá)；而條石鯛的組織定量分析顯示，F(xiàn)EL基因主要在肝臟和頭腎中表達(dá)量比較高，在其他組織中痕量表達(dá)，因此說明FEL基因具有組織表達(dá)特異性，而且不同的物種FEL基因的表達(dá)位置具有差異性。這為本研究牙鲆中FEL基因的表達(dá)模式提供了參考。

牙鲆是中國重要的養(yǎng)殖魚種，在集約化養(yǎng)殖過程中病原菌的入侵造成了牙鲆大量死亡，對牙鲆養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[14]。利用分子生物學(xué)技術(shù)對牙鲆免疫相關(guān)基因的功能進行研究，可以為抗病藥物和免疫佐劑的開發(fā)研究提供理論依據(jù)，提高養(yǎng)殖效率和食品安全性。對于保證中國海水養(yǎng)殖業(yè)健康、穩(wěn)定、持續(xù)的發(fā)展具有極其重要的意義。本文以牙鲆為研究對象，利用體外細(xì)菌和病毒類似物刺激牙鲆卵巢細(xì)胞系，檢測牙鲆FEL1基因的時間依賴性表達(dá)模式；進行PoFEL1體外過表達(dá)實驗，研究過表達(dá)PoFEL1對免疫相關(guān)細(xì)胞因子的影響；亞細(xì)胞定位分析，探討PoFEL1在細(xì)胞中的表達(dá)位置；雙熒光報告分析，檢測PoFEL1對NF-κB信號通路的影響。這為探究PoFEL1在牙鲆抵抗病原菌入侵時發(fā)揮的免疫應(yīng)答機制提供理論基礎(chǔ)，同時初步探索了PoFEL1在牙鲆胚胎早期發(fā)育階段的母源性表達(dá)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本實驗所用的牙鲆為1.5齡魚，研究中用到的牙鲆以及胚胎樣品均取自山東黃海水產(chǎn)有限公司。取回的牙鲆先放在中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院魚房暫養(yǎng)半個月，控制水溫，每日投喂飼料3次，每24 h更換40%新鮮海水。本次實驗研究中，所用實驗材料均按照中國海洋大學(xué)動物管理與使用委員會(OUC-IACUC)相關(guān)規(guī)定進行處理使用。

1.1.2 模板來源 胚胎發(fā)育時期所需要的模板是人為體外受精的牙鲆受精卵。取樣地點在山東黃海水產(chǎn)有限公司。

1.1.3 細(xì)胞系來源 用于免疫刺激的牙鲆卵巢細(xì)胞系及HEK-293T細(xì)胞系來源于中國海洋大學(xué)細(xì)胞工程技術(shù)實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1PoFEL1核心片段序列的獲得首先在本實驗室的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，通過同源比對找到牙鲆FEL基因序列，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫中的牙鲆FEL基因比較，確定FEL基因序列，隨后設(shè)計引物，對其進行克隆驗證(見表1)。

1.2.2PoFEL1序列分析 用DNAMAN程序進行氨基酸與核苷酸序列分析；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)和Signalp 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析PoFEL1的同源保守功能域和信號肽有無；使用MrBayes軟件，利用最大似然法構(gòu)建進化樹分析基因在進化過程中的物種親緣關(guān)系，實驗中所用到的基因序列見表2。

表1 本研究所用引物序列

注：限制性核酸內(nèi)切酶用下劃線標(biāo)出。The restriction enzyme sites are underlined.

表2 本實驗中所用到的FEL序列

1.2.3PoFEL1組織表達(dá)分析 取6尾牙鲆個體(3雌3雄，1.5齡)，用尾靜脈抽血法處死，解剖分別取精巢、卵巢、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、鰓、肌肉和腸10個組織，提取RNA，制備定量模板。

1.2.4PoFEL1胚胎發(fā)育模式表達(dá)分析 對不同發(fā)育時期的牙鲆胚胎進行了取樣，取樣時間點分別是：2細(xì)胞期(2 cell)、32細(xì)胞期(32 cells)、高囊胚(High blastula)、原腸晚期(Late gastrula)、神經(jīng)胚(Neurula)、尾芽期(Tail bud)、出膜期(Hatching)8個時期，液氮凍存后放到-80 ℃冰箱，備用。

1.2.5 牙鲆p-EGFP-FEL1質(zhì)粒構(gòu)建 在PoFEL1ORF的兩端，分別設(shè)計帶酶切位點XhoⅠ和SacⅡ的引物序列，構(gòu)建質(zhì)粒并測序驗證。將序列正確的質(zhì)粒及空載質(zhì)粒p-EGFP-N1用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SacⅡ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。隨后將帶有酶切位點的PoFEL1序列用T4連接酶連接到p-EGFP-N1載體上，并進行測序驗證，最終得到p-EGFP-FEL1過表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.6 體外細(xì)胞刺激實驗 將牙鲆的孵巢細(xì)胞系接種到24孔板中，在24 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞覆蓋度達(dá)到70%～90%。隨后細(xì)胞換上DMEM/F12培養(yǎng)基(含有血清和雙抗)，加入lipopolysaccharide (LPS)、peptidoglycan(PGN)、Polyinosinic: polycytidylic acid (Poly I∶C, Sigma)和遲緩愛德華氏菌菌液，其中遲緩愛德華氏菌的終濃度是6×106CFU/mL，而LPS、PGN、Poly(I∶C)的終濃度是50 μg/mL，同時加入等體積的PBS作為對照組。將處理的細(xì)胞樣品放在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，因為遲緩愛德華氏菌是一種細(xì)菌，具有傳染性，因此加入遲緩愛德華氏菌的實驗組需要單獨培養(yǎng)(培養(yǎng)條件不變)。隨后分別在0、1、2、4、12、24 h時收集細(xì)胞，加Trizol試劑并將其凍存在-80 ℃冰箱，待用。

1.2.7PoFEL1過表達(dá)實驗 將生長狀態(tài)良好的牙鲆卵巢細(xì)胞系接種到3個12孔板中，將其在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。將12孔板中的培養(yǎng)基棄掉，用處理過的PBS清洗數(shù)次，加入DMEM/F12培養(yǎng)基(無血清和雙抗)根據(jù)LipofectamineTM3000進行p-EGFP-FEL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，同時轉(zhuǎn)染p-EGFP-N1質(zhì)粒作用對照，隨后采用溫度梯度過度的方法：30 ℃，2 h；27 ℃，2 h；24 ℃，至實驗結(jié)束。轉(zhuǎn)染48 h以后，其中1個12孔板，收集細(xì)胞，提RNA，制備模板。一個12孔板，將其用LPS刺激，每孔加入50 μg/mL的LPS，24 h后，收集細(xì)胞，提RNA，制備模板。剩余一個12孔板轉(zhuǎn)染48 h之后，用處理過的PBS清洗數(shù)次；加入4%PFA室溫放置10 min，隨后用處理過的PBS清洗數(shù)次。然后在每一個孔中滴入DAPI染液，使其完全覆蓋細(xì)胞，室溫放置10 min，隨后用處理過的PBS清洗數(shù)次，每孔中加入少量的PBS，在共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

1.2.8 pRL-TK質(zhì)粒、NF-κB熒光素酶質(zhì)粒與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

(1) 轉(zhuǎn)染方法：瞬時轉(zhuǎn)染根據(jù)LipofectamineTM3000實驗操作說明書進行。293T細(xì)胞按常規(guī)方法貼壁培養(yǎng)并將其傳代于24孔板中，過夜培養(yǎng)12 h。將24孔板中的培養(yǎng)基棄掉，PBS洗滌數(shù)次，每孔加入500 μL無抗生素、無血清的培養(yǎng)基，分為實驗組和對照組每孔加入1 μL質(zhì)粒，加入p-EGFP-N1質(zhì)粒、p-EGFP-FEL1、質(zhì)粒pRL-TK(海腎質(zhì)粒)，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基(含雙抗、血清)。轉(zhuǎn)染24～48 h后熒光顯微鏡下觀察以判斷轉(zhuǎn)染效率。48 h后進行Luciferse檢測，每組設(shè)置6個平行，重復(fù)至少3次實驗。

(2)在HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-EGFP-FEL1質(zhì)粒；48 h后，用移液器吸走24孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗數(shù)次，將其在超凈工作臺中靜置30 s。每孔加入100 μL 1×PLB，室溫下緩慢搖動20～30 min，收集到EP管中；將其在超速離心機中，5 000 r/min 離心2 min，吸取20 μL上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中；向其中加入100 μL ARII，吹吸混勻，在機器中檢測螢火蟲熒光素酶活性，其結(jié)果記作a；隨后向其中加入100 μL Stop&Glo試劑，吹吸混勻，在機器中檢測海腎熒光素酶活性，其結(jié)果記作b；統(tǒng)計結(jié)果a/b。

1.2.9 實時熒光定量(qRT-PCR) 使用primer 5 軟件設(shè)計用于定量的各基因引物序列，其中β-actin作為內(nèi)參序列。反應(yīng)體系：熒光染料，10 μL；定量引物(正向/反向)，0.4/0.4 μL；模板，1 μL；ddH2O，8.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，15 min；95 ℃，10 s，60 ℃，20 s，72 ℃，60 s，共40個循環(huán)。每個待測樣品設(shè)置3個重復(fù)實驗，用來降低實驗操作誤差。(本實驗樣本Ct值均小于35，符合qPCR實驗要求)

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 利用Graphpad Primier 5繪制柱狀圖，基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCT的算法分析計算，使用SPSS20.0(IBM，New York，US)統(tǒng)計軟件對不同組實驗結(jié)果之間進行單因素相關(guān)性分析ANOVA來證明不同組的實驗結(jié)果之間的顯著性差異。其中P<0.05認(rèn)為差異顯著則用星號*表示，P<0.01認(rèn)為差異極顯著則用星號**表示。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。每組實驗都會進行3次重復(fù)。

2 實驗結(jié)果

2.1 PoFEL1序列分析

2.1.1PoFEL1的ORF序列擴增 以牙鲆卵巢組織為模板，擴增得到PoFEL1基因的ORF序列，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫中的牙鲆FEL序列比對，結(jié)果完全一致。其中PoFEL1的開放閱讀框(ORF)長675 bp，編碼224個氨基酸，蛋白分子量預(yù)測為24.8 kDa，理論等電點為9.88，在線軟件預(yù)測未發(fā)現(xiàn)信號肽序列。通過5’RACE和3’RACE測序得到牙鲆FEL1基因的5’UTR 316 bp，3’UTR 175 bp(見圖1)。通過SMART軟件預(yù)測顯示，PoFEL1具有5個保守的TECPR結(jié)構(gòu)域(見圖2)。

圖 1 PoFEL1基因的核苷酸序列與氨基酸序列對應(yīng)圖

圖2 FEL1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.1.2PoFEL1的系統(tǒng)進化分析 為了探究PoFEL1在動物進化過程中的地位，利用Bayes法構(gòu)建了從哺乳動物、爬行動物和硬骨魚類的FEL組成的系統(tǒng)進化樹(見圖3)。研究發(fā)現(xiàn)魚卵凝集素可以聚為2類，其中哺乳動物和爬行動物與斑馬魚聚為一支，而牙鲆與大西洋鮭魚、虹鱒魚、大黃魚、尼羅羅非魚、孔雀魚和非洲青鳉聚為一支，因此他們之間的同源性較高。有意思的是，在牙鲆中研究發(fā)現(xiàn)了兩種FEL基因，分別是PoFEL1和PoFEL2。本文主要研究PoFEL1的母源性表達(dá)以及在牙鲆的先天性免疫中發(fā)揮的作用。

2.2 PoFEL1的組織表達(dá)分析

為了研究PoFEL1基因在牙鲆不同組織的表達(dá)模式，選用牙鲆的10個組織(心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、鰓，、肌肉、小腸、精巢、卵巢)，用β-actin作為內(nèi)參引物，通過qRT-PCR檢測PoFEL1基因在各組織中的表達(dá)水平。定量結(jié)果顯示，PoFEL1基因在各個組織中都有不同程度的表達(dá)，但是表達(dá)具有差異，從圖4可以看出來PoFEL1基因具有顯著的組織特異性，在卵巢中表達(dá)量最高，是表達(dá)量最低的組織(脾臟)的300倍，在腸和肝臟中表達(dá)量次之，其余組織中呈現(xiàn)痕量表達(dá)的現(xiàn)象。因此，PoFEL1基因在各組織中的表達(dá)具有明顯的組織特異性。

2.3 PoFEL1的發(fā)育表達(dá)模式分析

為了研究PoFEL1基因在早期胚胎發(fā)育過程中表達(dá)模式，對不同發(fā)育時期的PoFEL1基因進行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示(見圖4B)，PoFEL1在牙鲆胚胎發(fā)育的8個時期：4細(xì)胞時期(4 cell)、16細(xì)胞時期(16 cells)、32細(xì)胞時期(32 cells )、高囊胚(high blastula)、原腸早期(Early gastrula)、原腸晚期(Late gastrula)、神經(jīng)胚(neurula)、出膜期(hatching)均有表達(dá)(見圖4B)，在胚胎發(fā)育的早期表達(dá)量比較高，隨著胚胎發(fā)育的發(fā)生，表達(dá)量逐漸降低，提示其可能具有母源性表達(dá)的特點。

圖3 基于牙鲆與其他硬骨魚類和哺乳動物類FEL氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

(A：牙鲆組織中PoFEL1基因的相對表達(dá)水平。β-actin作為內(nèi)參基因。B：不同胚胎發(fā)育階段中FEL1的相對表達(dá)水平。內(nèi)參基因同上。A：Relative expression levels ofPoFEL1in various tissues. β-actin was used as internal control. B：Relative expression levels ofPoFEL1in different embryonic and larval stages. β-actin was used as internal control.)

圖4 牙鲆FEL1基因在各個組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

Fig.4 Expression pattern ofFEL1gene in various tissues and different developmental stages

2.4 免疫刺激牙鲆卵巢細(xì)胞系后PoFEL1的mRNA表達(dá)水平分析

因為PoFEL1在卵巢中的表達(dá)量比較高，為了進一步探討PoFEL1在牙鲆免疫方面發(fā)揮的作用，本研究設(shè)計牙鲆體外刺激實驗。分別用LPS，PGN，poly(I∶C)，以及E.tarda(遲緩愛德華氏菌)刺激牙鲆卵巢細(xì)胞系，然后分別在0、1、2、4、12、24 h取樣，提RNA，制備定量模板，對PoFEL1基因進行RT-PCR分析，其中PBS為對照組。結(jié)果如圖5所示，不同刺激物刺激牙鲆卵巢細(xì)胞系均能使PoFEL1的表達(dá)上調(diào)。

LPS刺激時，PoFEL1的表達(dá)量呈現(xiàn)波動性變化模式，整體呈現(xiàn)出先上升又下降再上升的變化趨勢，其中在2 h達(dá)到峰值，是0 h的7.6倍(見圖5A)。在24 h同樣達(dá)到峰值，表達(dá)量是0 h的6.5倍。PGN刺激時，F(xiàn)EL1表達(dá)同樣呈現(xiàn)波動性的變化，在2 h時，達(dá)到一個峰值，是0 h時的7.1倍，隨后下降，并在24 h時，再次達(dá)到峰值，是0 h的7.2倍(見圖5B)。在Poly(I∶C)刺激時，1～4 h，呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，在4～24 h，呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢，其中4 h時，無顯著性差異，24 h時達(dá)到峰值，此時是0 h的10.7倍(見圖5C)。遲緩愛德華氏菌刺激時，F(xiàn)EL1基因的表達(dá)出現(xiàn)一個波動性的變化，其中在0～1 h，表達(dá)量迅速上升，在1～12 h時，表達(dá)量有一個緩慢下降的過程，12～24 h時，表達(dá)量急劇增加，并在24 h處達(dá)到峰值，是0 h的9.9倍(見圖5D)。綜上PoFEL1的表達(dá)整體呈現(xiàn)出先上升又下降再上升的趨勢。

圖5PoFEL1在免疫刺激牙鲆卵巢細(xì)胞中的表達(dá)模式

Fig.5 Time-dependent mRNA expression profiles ofPoFEL1in Ovarian cell line after stimulation

2.5 過表達(dá)PoFEL1對p38，IL-6，TNF-α等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

為了探索PoFEL1在牙鲆機體免疫途徑中的功能，將p-EGFP-FEL1重組載體和p-EGFP-N1空載體分別轉(zhuǎn)染牙鲆卵巢細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染成功后，對卵巢細(xì)胞系中的p38，IL-6，TNF-α等細(xì)胞因子進行RT-PCR分析。如圖6所示，過表達(dá)PoFEL1，各個細(xì)胞因子的表達(dá)量均有升高。RT-PCR分析顯示，過表達(dá)PoFEL1后，其表達(dá)量相對對照組顯著提高(見圖6A)，表達(dá)量提高了427倍。細(xì)胞因子的表達(dá)量呈顯著上調(diào)趨勢(見圖6B)，其中P38相對于空白對照組上調(diào)了8.9倍，相比N1組上調(diào)2.3倍。過表達(dá)FEL1以后，IL-6的表達(dá)量相對于空白對照組和N1組均上調(diào)16倍左右。TNF-α也被激活，其表達(dá)量相對于空白對照組上調(diào)16.3倍，相對于N1組上調(diào)5倍左右。

2.6 PoFEL1的亞細(xì)胞定位

FEL1蛋白是一種凝集素類蛋白，且氨基酸序列分析顯示PoFEL1編碼的蛋白沒有信號肽，為了探究PoFEL1的表達(dá)位置，在牙鲆卵巢細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了p-EGFP-N1和p-EGFP-FEL1兩種質(zhì)粒。如圖7所示，牙鲆FEL1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

圖6PoFEL1過表達(dá)對LPS刺激的牙鲆卵巢細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)變化

Fig.6 The mRNA expression profiles of pro-inflammatory cytokines in LPS-stimulated Ovarian cell line after over-expressedFEL1

(用p-EGFP-N1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作陰性對照。Cells transfected with p-EGFP-N1 were used as negative controls.)

2.7 過表達(dá)PoFEL1對NF-κB的影響

為了探索PoFEL1是否可以激活NF-κB信號通路，使用HEK293T細(xì)胞在實驗組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pRL-TK質(zhì)粒、NF-κB熒光素酶質(zhì)粒和p-EGFP-FEL1重組質(zhì)粒；同時對照組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pRL-TK質(zhì)粒、NF-κB熒光素酶質(zhì)粒和p-EGFP-N1質(zhì)粒。隨后進行qRT-PCR分析。數(shù)據(jù)處理之后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-EGFP-FEL1重組質(zhì)粒的熒光強度與對照組相比極顯著升高(見圖8)。

圖8 在HEK-293T細(xì)胞中可以通過FEL1激活NF-κB途徑

Fig.8 The NF-κB pathway can be activated byFEL1in HEK 293T cells

3 討論

近年來，越來越多的魚卵凝集素從魚的卵細(xì)胞中被分離得到，蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，魚卵凝集素(FEL)是一種凝集素蛋白，屬于凝集素超家族[5]。本研究中，通過PCR以及5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得牙鲆FEL1基因全長序列。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，F(xiàn)EL1基因編碼的蛋白含有5個TECPR結(jié)構(gòu)域。將牙鲆的FEL1氨基酸序列與大西洋鮭魚、條石鯛的FEL氨基酸序列對比后發(fā)現(xiàn)，它們均含有6個高度保守的半胱氨酸殘基(Cys)，在蛋白加工過程中，6個半胱氨酸殘基兩兩配對形成二硫鍵，從而保證了FEL1蛋白功能的正常發(fā)揮。研究表明，二硫鍵在蛋白質(zhì)的重折疊、建立以及維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起到關(guān)鍵性的作用[15]。進化分析顯示，牙鲆與大西洋鮭魚、虹鱒魚、大黃魚、尼羅羅非魚、孔雀魚和非洲青鳉氨基酸序列的同源性較高，而與哺乳動物、爬行動物以及斑馬魚的氨基酸序列同源性較低。

已有的研究表明，魚卵凝集素主要在免疫器官以及性腺組織中具有高表達(dá)。同時在斑馬魚(Daniorerio)的研究中，F(xiàn)EL基因在卵巢和精巢中表達(dá)量最高，在胚胎發(fā)育階段早期表達(dá)量也較高，這與本研究在牙鲆中的發(fā)現(xiàn)類似，該現(xiàn)象暗示牙鲆與斑馬魚的FEL基因可能都具有母源性表達(dá)的特點，在功能上存在共性。在條石鯛 (Oplegnathusfasciatus)中[5]，F(xiàn)EL基因在肝臟和頭腎中表達(dá)量最高，而PoFEL1同樣具有在肝臟中表達(dá)量高的特點，這一現(xiàn)象表明在這兩種硬骨魚中FEL基因可能具有免疫作用。上述現(xiàn)象說明，PoFEL1在牙鲆中具有母源性表達(dá)的特點，同時在其先天免疫中發(fā)揮作用，因此本研究推測其在牙鲆胚胎發(fā)育過程中可能起到抵抗病原感染的作用。

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組成成分，能刺激動物使之產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[16]；肽聚糖(PGN)存在于大部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中[17]，可引起動物機體免疫反應(yīng)，因此LPS與PGN常作為一種細(xì)菌類似物應(yīng)用于免疫學(xué)研究。聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid，Poly(I∶C))，是由肌苷酸和胞苷酸聚合的雙鏈RNA，能夠誘導(dǎo)動物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，并通過干擾素活化來行使免疫細(xì)胞的功能，將其作為病毒類似物應(yīng)用于免疫學(xué)研究[18]。在條石鯛的研究中，作者用遲緩愛德華氏菌、海豚鏈球菌和真鯛虹彩病毒感染條石鯛，結(jié)果顯示FEL基因的表達(dá)量顯著增加，說明FEL基因在條石鯛抵抗病原微生物的入侵和真菌病毒的入侵方面發(fā)揮免疫應(yīng)答功能[5]。PoFEL1在卵巢細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平能夠被LPS、PGN、Poly(I∶C)以及遲緩愛德華氏菌影響，其mRNA的表達(dá)水平在免疫刺激后均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，這說明牙鲆FEL1基因在卵巢細(xì)胞免疫刺激過程中具有應(yīng)激效應(yīng)，同時在牙鲆卵巢細(xì)胞的抗菌免疫過程中起到一定作用。本研究通過牙鲆卵巢細(xì)胞系進行體外刺激實驗，證明LPS、PGN、Poly(I∶C)以及遲緩愛德華氏菌均能引起牙鲆FEL1基因的表達(dá)上調(diào)，且它們的變化趨勢一致，均呈現(xiàn)先升高后下降再升高的變化?？傊?，細(xì)菌、病毒類似物等均能上調(diào)PoFEL1的表達(dá)，進一步說明了牙鲆FEL1基因在細(xì)胞抵抗細(xì)菌入侵時發(fā)揮一定的作用。

P38能被促炎因子或細(xì)菌病原體磷酸化激活，由細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核內(nèi)，活化轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)[19]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞炎癥因子，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮顯著的作用[20]。通過研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PoFEL1能導(dǎo)致卵巢細(xì)胞中TNF-α、p38以及IL-6基因的表達(dá)上調(diào)，說明過表達(dá)PoFEL1能夠促進TNF-α、p38以及IL-6的表達(dá)，進而激活細(xì)胞內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能。在草魚的甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)研究中，研究者利用雙熒光素酶報告載體探究MBL是否可以激活NF-κB信號通路，實驗結(jié)果表明過表達(dá)MBL能激活NF-κB信號通路[21]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PoFEL1可以顯著增強NF-κB信號，進而激活NF-κB信號通路，從而對細(xì)菌入侵產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，這一過程可能需要多條途徑共同參與完成。另外，實驗結(jié)果證明過表達(dá)PoFEL1能導(dǎo)致卵巢細(xì)胞中TNF-α、p38以及IL-6基因的表達(dá)上調(diào)，而TNF-α可以促進T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而激活NF-κB信號通路。因此，推測在牙鲆的免疫系統(tǒng)中可能存在一些途徑，可以使PoFEL1能間接激活NF-κB信號通路對病原菌入侵產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

本研究克隆了牙鲆PoFEL1基因的全長序列，并分析組織表達(dá)模式以及胚胎發(fā)育時期表達(dá)模式，結(jié)果說明PoFEL1具有母源性表達(dá)，然而其具體作用機理有待進一步研究。體外細(xì)胞刺激實驗及過表達(dá)實驗表明PoFEL1在細(xì)胞中發(fā)揮抗菌免疫作用，雙熒光報告載體實驗表明過表達(dá)PoFEL1能促進TNF-α的表達(dá)，進而激活NF-κB信號通路，對細(xì)菌的入侵起到免疫應(yīng)答的作用。綜上所述，PoFEL1在牙鲆的先天免疫中起到重要的作用，本研究為牙鲆母源性免疫的研究奠定一定的基礎(chǔ)，為牙鲆的抗病育種提供參考依據(jù)。