高普 崔志華 陳維國(guó)

摘要： 為探明在Mannich反應(yīng)修飾蠶絲素中芳伯胺染料修飾劑分子在蠶絲素上的吸附規(guī)律，通過(guò)分別測(cè)定pH值對(duì)蠶絲素帶電情況、染料的溶解、蠶絲素得色量三方面因素的影響，結(jié)合吸附動(dòng)力學(xué)機(jī)理研究，得到如下結(jié)論：由于芳伯胺染料和蠶絲素均具有正負(fù)兩性性質(zhì)，芳伯胺染料在蠶絲素上的吸附受pH值的影響十分顯著;當(dāng)pH值偏酸性時(shí)有利于染料對(duì)蠶絲素的吸附，當(dāng)pH值為4.0時(shí)吸附量最大、著色最深;而吸附動(dòng)力學(xué)機(jī)理研究表明，Mannich反應(yīng)修飾方法能顯著促進(jìn)芳伯胺化合物在蠶絲素上的吸附量，其吸附機(jī)理較符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型，且在30～60 ℃內(nèi)升高溫度會(huì)降低對(duì)準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的符合程度。

關(guān)鍵詞： 芳伯胺染料;蠶絲素;顯色;修飾;吸附特性

中圖分類號(hào)： TS190.2 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ? 文章編號(hào)： 1001

Abstract： In order to explore the adsorption rule of aromatic primary amine modified molecules on silk protein in Mannich reaction， this study determined the influence of pH value on three factors， namely， the electrification state of silk， the dissolution of dye and the chroma yield of silk， and combined with the adsorption kinetic mechanism， the following conclusions were obtained： the adsorption behavior of aromatic amine dyes on silk is significantly affected by the pH value of aromatic amine dyes on silk protein. When the pH value is acidic， it is beneficial to the adsorption of silk fibroin， and when the pH value is 4.0， the adsorption capacity is the largest. The adsorption kinetic mechanism study shows that the Mannich reaction modification method can significantly promote the adsorption capacity of aromatic amine compounds on silk， and its adsorption mechanism is more in line with the quasi-second-order kinetic adsorption model. Besides， the temperature rise within 30～60 ℃ will reduce the degree of conformity to the quasi-second-order kinetic.

Key words： aromatic amine dyes; silk fibroin; coloration; modification; adsorption characteristics

蠶絲素富含優(yōu)質(zhì)蛋白，素有“纖維皇后”的美譽(yù)。近些年，蠶絲素在生物醫(yī)藥材料如再生骨骼材料、人工血管、人工皮膚、神經(jīng)元修復(fù)材料、藥物載體等方面的應(yīng)用，成為科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)[1-3]。為進(jìn)一步提升蠶絲素材料的耐光、機(jī)械性能及與功能材料相容性等，眾多學(xué)者采用化學(xué)修飾方法進(jìn)行了相關(guān)研究[4-6]，有效地促進(jìn)了蠶絲素在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。

基于Mannich反應(yīng)的芳伯胺化合物對(duì)蛋白質(zhì)的修飾方法是一種有效的化學(xué)修飾方法[7]。將該方法應(yīng)用于對(duì)蠶絲素中的特定氨基酸進(jìn)行可控化定位修飾，具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)蛋白損傷小、修飾效果顯著的特點(diǎn)。應(yīng)用該方法能夠?qū)⒑蟹疾坊鶊F(tuán)的特定修飾劑引入蠶絲素中（圖1），不僅有助于改善蠶絲素的化學(xué)及機(jī)械性能，且能賦予蠶絲素特殊功能，對(duì)于提升蠶絲素在生物材料方面的應(yīng)用有重要價(jià)值[8-9]。

前期研究中設(shè)計(jì)了一系列有色芳伯胺化合物即芳伯胺染料，基于Mannich反應(yīng)方法對(duì)蠶絲素進(jìn)行修飾，對(duì)該方法在蠶絲素上的應(yīng)用規(guī)律等進(jìn)行了一定的研究，實(shí)現(xiàn)了利用芳伯胺化合物顯色來(lái)定量表征化學(xué)修飾的顯色性修飾方法[10]。為進(jìn)一步探索芳伯胺化合物在蠶絲素上的吸附規(guī)律，本文從修飾浴pH值、電荷變化等，對(duì)吸附性能及其吸附動(dòng)力學(xué)的影響等多方面進(jìn)行了研究。對(duì)于探明芳伯胺染料Mannich反應(yīng)法修飾蠶絲素的應(yīng)用規(guī)律，進(jìn)而推動(dòng)該方法在蛋白修飾中的應(yīng)用具有重要意義。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及儀器

為提高測(cè)試的便利性，本文選用蠶絲素織物作為研究對(duì)象。同時(shí)為賦予修飾效果以良好的可視性，本文選用芳伯胺染料作為修飾功能分子進(jìn)行研究。織物規(guī)格：11205電力紡練白胚，平方米質(zhì)量為40 g/m2（杭州喜得寶絲綢有限公司），實(shí)驗(yàn)中采用的芳伯胺修飾劑酸性棕4（C.I.14805）為工業(yè)品，分子式如圖2所示（杭州下沙恒升化工有限公司），甲醛為分析純（杭州高晶精細(xì)化工有限公司），酸度儀（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），TU-1905紫外-可見(jiàn)光分光廣度計(jì)（上海朗賦實(shí)業(yè)有限公司），ZetaPALS固體電位儀（布魯克海文儀器公司），SHIMADZUUV-2550紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 方 法

1.2.1 Zeta電位測(cè)定

使用ZetaPALS固體電位儀，測(cè)定蠶絲素在不同pH值溶液中的Zeta電位，測(cè)試壓力為3×104 Pa，Gap height調(diào)節(jié)至100 μm。由于本文儀器是基于流動(dòng)電位法測(cè)定固體表面膜的Zeta電位，不適于測(cè)定液體的Zeta電位，因此未對(duì)染料溶液的Zeta電位進(jìn)行測(cè)試。

1.2.2 Mannich反應(yīng)法蠶絲素修飾實(shí)驗(yàn)

酸性棕4質(zhì)量濃度為400 mg/L，甲醛與酸性棕4摩爾比為1 ︰ 30，調(diào)節(jié)pH值，30 ℃震蕩處理10 h。對(duì)照空白實(shí)驗(yàn)中不用甲醛，其他條件同上。

1.2.3 蠶絲素Mannich反應(yīng)法修飾效果測(cè)定

利用Datacolor測(cè)試儀測(cè)試處理完畢并烘干試樣的布面K/S值。測(cè)試條件為D65光源、10°視場(chǎng)，每個(gè)試樣重復(fù)測(cè)試4次，取平均值。

1.2.4 溶液吸光度的測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為5 g/L的酸性棕4染料溶液，冰醋酸調(diào)pH值，靜置48 h后離心，留上層清液，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)吸光度。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

基于郎伯比爾定律的殘液法測(cè)定芳伯胺染料在蠶絲素上的吸附規(guī)律，具體實(shí)驗(yàn)方法：用100 mL容量瓶配制1 g/L的芳伯胺染料，分別稀釋至一定倍數(shù)，測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖3）。

1.2.6 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

對(duì)酸性棕4進(jìn)行提純，配置含染料質(zhì)量濃度2 mg/L、甲醛質(zhì)量濃度6 mg/L的混合溶液，冰醋酸調(diào)pH值到4.0;稱取11塊質(zhì)量為0.5 g的蠶絲素織物，待溶液升溫至特定溫度，投入蠶絲素織物，特定溫度下恒溫處理一定時(shí)間，取出布樣;并用DMF在70 ℃剝色10 min，剝色液連同殘液一起轉(zhuǎn)移至容量瓶并定容，測(cè)吸光度。常規(guī)染色法的工藝同上，但是溶液中不加入甲醛，溫度為90 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳伯胺修飾劑在蠶絲素上的吸附行為

從圖4可以看出，由于芳伯胺修飾劑酸性棕4帶有磺酸基和氨基，因此具有兩性特征;蠶絲素是由眾多氨基酸組成，也含有氨基和羧基，同樣具有兩性特征。當(dāng)酸性棕4和蠶絲素所處環(huán)境的pH值發(fā)生變化時(shí)，各自所帶電荷量甚至帶電荷性會(huì)發(fā)生變化，這將直接影響酸性棕4在蠶絲素上的吸附總量和最終的修飾效果。因此，研究pH值對(duì)蠶絲素帶電荷性、酸性棕4的吸附特性的影響，對(duì)于探明芳伯胺染料對(duì)蠶絲素的修飾效果顯得至關(guān)重要。

圖5為蠶絲素在不同pH值時(shí)表面的Zeta電位變化規(guī)律。從圖5可以看出，pH值對(duì)于蠶絲素表面的帶電情況影響很大。當(dāng)pH值大于4.0時(shí)蠶絲素表面帶負(fù)電，當(dāng)pH值小于4.0時(shí)蠶絲素表面帶正電荷，所采用的蠶絲素等電點(diǎn)為4.0左右。圖6為pH值對(duì)酸性棕4溶液吸光度的影響，吸光度較大說(shuō)明溶液中的單分子狀態(tài)的染料分子數(shù)量較多，即染料的溶解更好，更有利于染料在蛋白上的吸附和發(fā)生修飾反應(yīng)。

對(duì)于芳伯胺染料，當(dāng)其處于等電點(diǎn)時(shí)，由于分子所帶的正負(fù)電荷相同，其溶解度最低?；诖死碚?，本文通過(guò)吸光度隨pH值變化規(guī)律來(lái)近似模擬芳伯胺染料Mannich法修飾蠶絲素的實(shí)際反應(yīng)過(guò)程中染料溶液的變化情況，對(duì)于其在修飾反應(yīng)中的吸附行為提供一定參考。從圖6可以看出，酸性棕4的溶解性受pH值的影響十分顯著，當(dāng)pH值為2.0左右時(shí)溶解性最差，說(shuō)明染料的等電點(diǎn)在pH2.0左右。當(dāng)溶液pH值大于2.0時(shí)，染料帶負(fù)電荷，溶液的吸光度隨pH值的增大而逐漸增大;當(dāng)pH值在1.0～2.0時(shí)，染料帶正電荷，溶液吸光度隨pH值的降低而逐漸增大。所以，當(dāng)pH值小于4.0時(shí)蠶絲素表面帶正電荷，當(dāng)溶液pH值大于2.0時(shí)，染料帶負(fù)電荷，染料溶解性增大。所以，pH值在2.0～4.0時(shí)，最有利于帶負(fù)電荷的染料在帶正電荷的蠶絲素上發(fā)生吸附。

圖7為pH值對(duì)酸性棕4對(duì)蠶絲素顯色修飾效果的影響，用顯色修飾后的蠶絲素織物表面的色深值來(lái)表示修飾效果。從圖7可以看出，pH值對(duì)顯色修飾效果的影響十分顯著。但是，與空白吸附試樣相比，Mannich反應(yīng)法修飾的試樣受pH值的影響更加明顯，且在不同pH值條件下的修飾試樣K/S值均較高。對(duì)于Mannich反應(yīng)法修飾的試樣，酸性條件修飾可得到更高的K/S值。且當(dāng)pH值在蠶絲素等電點(diǎn)（pH值為4.0）以上時(shí)，試樣的K/S值隨pH值增大而呈現(xiàn)下降趨勢(shì);當(dāng)pH值在蠶絲素等電點(diǎn)以下時(shí)，試樣的K/S值隨pH值降低而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在pH4.0等電點(diǎn)時(shí)修飾效果最佳。分析認(rèn)為：當(dāng)pH值為4.0時(shí)，蠶絲素處于等電點(diǎn)附近，蠶絲素表面呈電中性至正電性，而酸性棕4位于其自身等電點(diǎn)以上，帶有負(fù)電荷，染料和蠶絲素之間具有極強(qiáng)的吸附作用。因此，當(dāng)溶液pH值在等電點(diǎn)附近時(shí)能夠得到最佳的修飾效果。

2.2 芳伯胺染料對(duì)蠶絲素顯色修飾的吸附動(dòng)力學(xué)機(jī)理

為了進(jìn)一步揭示芳伯胺修飾劑在蠶絲素上的吸附規(guī)律，從吸附動(dòng)力學(xué)角度對(duì)其修飾行為進(jìn)行了探討。

圖8是在pH4.0時(shí)，不同溫度下C.I.酸性棕4修飾蠶絲素的時(shí)間t和吸附到蠶絲素上的染料質(zhì)量qt的關(guān)系曲線，其中90 ℃為常規(guī)酸性染料染色對(duì)比樣，即不加醛、按照一般酸性染料染色方法時(shí)的吸附曲線。結(jié)合圖7可以看出，應(yīng)用Mannich法修飾蠶絲素蛋白過(guò)程中，酸性棕4分子在蠶絲素上的平衡吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)酸性染料染色法。說(shuō)明在Mannich法中修飾中，甲醛的參與顯著促進(jìn)了修飾劑分子在蠶絲素上的吸附。應(yīng)用Mannich法修飾時(shí)，平衡吸附量隨著溫度升高而出現(xiàn)明顯下降，說(shuō)明該方法適合在較低的溫度下進(jìn)行，溫度升高，不利于芳伯胺化合物對(duì)蠶絲素的吸附，進(jìn)而影響其化學(xué)修飾，也證實(shí)了Mannich法修飾是一種反應(yīng)條件溫和的修飾反應(yīng)。

2.3 芳伯胺修飾蠶絲素的吸附動(dòng)力學(xué)模型

為探討Mannich反應(yīng)修飾中芳伯胺修飾劑在蠶絲素上的吸附機(jī)制，分別采用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)吸附規(guī)律進(jìn)行了研究。

在同樣溫度下準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的擬合度在0.95～0.98，擬合度較高。且理論計(jì)算出的最大吸附量qe與實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)相差較小，說(shuō)明準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能較好地描述芳伯胺染料Mannich法修飾蠶絲素中的吸附機(jī)理。并且對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)溫度越低實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)模型的符合程度越高。說(shuō)明Mannich修飾反應(yīng)較適宜在較低的溫度進(jìn)行，溫度升高會(huì)使得副反應(yīng)概率增大，對(duì)修飾反應(yīng)造成一定的負(fù)面影響而降低修飾效果。

3 結(jié) 論

通過(guò)分別測(cè)定pH值對(duì)蠶絲素帶電情況、染料的溶解、蠶絲素得色量三方面因素的影響，結(jié)合吸附動(dòng)力學(xué)機(jī)理分析，研究了芳伯胺染料在蠶絲素蛋白上的吸附行為，得到如下結(jié)論。

1）由于芳伯胺染料和蠶絲素在水中均具有正負(fù)兩性性質(zhì)，芳伯胺染料在蠶絲素上吸附時(shí)受pH值的影響十分顯著。pH值在2.0～4.0時(shí)，最有利于染料在蠶絲素上的吸附。當(dāng)pH值為4.0時(shí)吸附量最大。

2）應(yīng)用芳伯胺化合物酸性棕4染料對(duì)蠶絲素進(jìn)行Mannich反應(yīng)法修飾，借助芳伯胺染料的顯色性能表達(dá)出顯著的修飾效果。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，芳伯胺染料在蠶絲素織物上顯示的顏色最深。

3）芳伯胺化合物Mannich法修飾蠶絲素更加符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，在30～60 ℃內(nèi)升高溫度會(huì)降低對(duì)準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的符合程度。

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