吳建兵 張理想 唐麒麟

摘要： 為解決當(dāng)前慢性疾病治療過程中給藥頻繁、藥物生物利用度差、毒副作用大等問題，開發(fā)性能穩(wěn)定、釋放可控、療效好、生物安全性高的藥物控釋體系尤為重要。文章對(duì)藥物控釋體系研究熱點(diǎn)之一的納微米球的材料選擇，絲素蛋白納微米球的成球機(jī)理、制備方法及在藥物控釋體系中的應(yīng)用等進(jìn)行綜述，重點(diǎn)闡述并比較了絲素蛋白納微米球制備方法的優(yōu)缺點(diǎn)與在藥物遞送中的最新研究進(jìn)展。結(jié)果表明：絲素蛋白納微米球的研究應(yīng)著重圍繞制備方法、載藥性能、釋藥性能及臨床疾病治療研究等方面充分發(fā)揮絲素蛋白納微米球在藥物控釋體系中的優(yōu)勢(shì)，從而用于慢性疾病的高效治療。

關(guān)鍵詞： 藥物控釋體系;納微米球;絲素蛋白;載體;雙元藥物

中圖分類號(hào)： TS102.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ? 文章編號(hào)： 1001

Abstract： In order to solve the problems of frequent drug administration， poor drug bioavailability， high drug toxicity in the process of chronic disease treatment， it is significant to develop a drug-controlled release system with stable property， controlled release， good curative effect and high biosecurity. This paper summarizes nano-microsphere material selection which is one of research hotspots of drug-controlled release system， formation mechanism and preparation method of silk fibroin nano-microsphere as well as its application in drug-controlled release system. The advantages and disadvantages of silk fibroin nano-microsphere preparation method are expounded and compared. Meanwhile， the latest research progress of silk fibroin nano-microsphere in drug delivery is elaborated. The results indicate that， the research of silk fibroin nano-microsphere should focus on the preparation method， drug loading performance， drug release properties and clinical disease treatment. The strengths of silk fibroin nano-microsphere in drug-controlled release system should be fully utilized to efficiently treat chronic diseases.

Key words： drug-controlled release system; nano-microsphere; silk fibroin; carrier; dual-drug

社會(huì)科技進(jìn)步和生活水平的提升盡管延長(zhǎng)了人均壽命，但是依然無法回避人口老齡化所引發(fā)的慢性疾病頻發(fā)的問題。例如糖尿病、高血壓、關(guān)節(jié)炎、眼底黃斑病、牙周疾病等，加劇病人痛苦的同時(shí)也增加社會(huì)治療成本，且很多慢性疾病需終身服藥。然而，服藥過程中存在藥物穩(wěn)定性差、療效低、毒副作用大等突出問題。藥物控釋體系是將藥物包埋在載體基質(zhì)上以設(shè)定的速率釋放，在提高療效、減少給藥次數(shù)、降低治療成本等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[1]。將藥物裝載在納微米級(jí)的球狀顆粒中是藥物控釋體系的研究熱點(diǎn)。主要原因有：首先，可通過納微米球的粒徑、密度、孔隙等理化性能調(diào)控藥物的釋放速率;其次，可避免部分藥物失活、掩味減少藥物刺激、降低藥物毒性;除此之外，可被人體器官中的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞或融合，以擴(kuò)散或降解的方式釋放藥物;最后，可根據(jù)臨床治療特點(diǎn)靈活選擇給藥方式，包括但不限于全身給藥和局部給藥[2]。

為了充分利用納微米球在藥物控釋體系中的優(yōu)勢(shì)，解決慢性疾病治療過程中給藥頻繁、毒副作用大的問題，本文著重圍繞納微米球的材料選擇、絲素蛋白納微米球的成球機(jī)理、制備方法及在藥物控釋體系中的應(yīng)用四方面進(jìn)行綜述，并總結(jié)目前絲素蛋白納微米球研究存在的不足及未來努力的方向。

1 藥物控釋用納微米球的材料選擇

天然、合成及半合成高分子是當(dāng)前制備納微米球的主要材料來源。合成高分子制備的聚乳酸（Polylactic acid，PLA）及聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Polylactic acid-glycolic acid，PLGA）納微米球在當(dāng)前上市制劑中仍是主流，原因在于材料本身具有良好的生物相容性、可控的生物降解性，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為藥物控釋載體[3]。然而，PLA和PLGA等納微米球仍存在不足。首先，有機(jī)溶劑添加、超聲功率輸出均會(huì)對(duì)包埋藥物的活性和穩(wěn)定性有影響，且有機(jī)溶劑殘留存在潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。其次，不利于親水性藥物的裝載。主要原因有兩點(diǎn)：一是聚合物分子疏水作用強(qiáng)，與親水性藥物分子間作用力小，藥物裝載效率低;二是藥物難以均勻裝載在納微球載體基質(zhì)中，更多只能通過物理吸附方式分布在微球表層，直接引起突釋，甚至暴釋，釋放速率難以控制[5]。最后，降解后的酸性物質(zhì)會(huì)引起體內(nèi)炎癥反應(yīng)[6]。目前，科研學(xué)者正嘗試?yán)锰烊桓叻肿犹娲?，例如明膠[7]、殼聚糖[8]和海藻酸鈉[9]等。盡管上述天然高分子在納微米球的開發(fā)和藥物控釋領(lǐng)域的應(yīng)用研究中取得進(jìn)展，但是依然存在許多不足。明膠的提純工藝復(fù)雜;殼聚糖結(jié)晶度低，分子排列松散、體內(nèi)降解過快;海藻酸鈉需在制備過程中添加表面活性劑和交聯(lián)劑才能提高成球性能，生物安全性難以保證。因此，尋找來源廣泛、生物相容性好、可塑性優(yōu)異、降解產(chǎn)物無免疫原性的天然高分子材料，并通過綠色環(huán)保、簡(jiǎn)單高效的方法制備載藥率高、釋放速率靈活的新型納微米球，是藥物控釋體系的重點(diǎn)研究方向。

蠶絲來源簡(jiǎn)單，享有“人體第二皮膚”的美譽(yù)。蠶絲主要由絲素和絲膠兩種蛋白構(gòu)成。絲素蛋白由18種氨基酸組成，能夠有效保證材料的生物安全性。絲素蛋白分子主要由重（H）鏈、輕（L）鏈和P25糖蛋白構(gòu)成。其中，交替穿插于結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)的H鏈?zhǔn)墙z素的主要構(gòu)成部分。不同于H鏈、L鏈由各自C-末端的二硫鍵相互連接，P25糖蛋白通過疏水作用方式連接到絲素蛋白大分子上[10]。無規(guī)卷曲、α螺旋和β折疊是絲素蛋白主要的3種二級(jí)結(jié)構(gòu)。無規(guī)卷曲最不穩(wěn)定，一般存在于水溶液中，容易在外界條件刺激下發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這也正是絲素蛋白在水溶液中可塑性優(yōu)異的原因。β折疊結(jié)構(gòu)的分子鏈段間排列最為規(guī)整，能量最低，因而最為穩(wěn)定。這些獨(dú)特的分子及二級(jí)結(jié)構(gòu)可直接決定絲素蛋白納微米球的載藥、釋藥及降解性能，從而為藥物控釋體系的功能性和多樣性設(shè)計(jì)創(chuàng)造有利的條件[11]。

2 絲素蛋白納微米球的成球機(jī)理

為了提高絲素蛋白材料的穩(wěn)定性，需在制備過程中加入乙醇、鹽離子等變性劑，增強(qiáng)絲素蛋白分子間的疏水作用，從而誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變（無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變到β折疊）[12]。Cao等[13]將絲素蛋白溶液通過緩慢攪拌方式滴加到乙醇溶液中，絲素蛋白首先形成亞穩(wěn)定的微晶相（此時(shí)無沉淀析出），再經(jīng)緩慢低溫冷凍（水溶液冷凍后產(chǎn)生剪切力）完全地誘導(dǎo)絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變得到穩(wěn)定的絲素蛋白納微米球。并猜測(cè)絲素蛋白成球存在的兩種可能性：一種是絲素蛋白分子首先形成有核的晶相，然后再形成有殼的非晶相，最終形成納微米球;另一種是非晶相被截留并附著結(jié)晶相以形成納微米球。Lammel等[14]研究不同pH值絲素蛋白溶液經(jīng)磷酸鉀溶液鹽析后的成球機(jī)理。絲素蛋白分子中的H鏈末端是由N和C基團(tuán)組成的親水性區(qū)域。其中，N末端的等電點(diǎn)為4.6，以負(fù)電荷為主，而C末端的等電點(diǎn)為10.5，表現(xiàn)為正電荷。絲素蛋白的等電點(diǎn)直接影響氨基酸側(cè)鏈的電荷分布，進(jìn)而調(diào)控分子間的間距和自組裝行為。基于此機(jī)理，當(dāng)pH9.0時(shí)，絲素蛋白除C末端外，帶電的氨基酸側(cè)鏈都顯負(fù)電而存在靜電排斥，導(dǎo)致分子構(gòu)象伸長(zhǎng)。隨著pH值降低，靜電排斥作用減弱，分子構(gòu)象伸長(zhǎng)程度減弱并使得分子間的距離趨于緊密。當(dāng)pH4.0時(shí)，靜電排斥被抑制，而緊密的分子間的疏水、氫鍵作用加強(qiáng)，能夠形成穩(wěn)定的絲素蛋白納微米球。另外，筆者選擇了常用的親水性藥物助劑聚乙二醇（PEG）和絲素蛋白共混制備納微米球，其成球機(jī)理分析認(rèn)為是分散相的絲素蛋白溶液先在連續(xù)相的PEG溶液中形成均勻的液滴。親水性的PEG分子分布在絲素蛋白分子的周圍，并能不斷吸收與絲素蛋白表面結(jié)合的水分子，使絲素蛋白分子的溶解度降低并暴露疏水結(jié)晶區(qū)形成微晶相，在氫鍵及疏水作用力下微晶相又不斷聚集形成穩(wěn)定的絲素蛋白納微米球而沉淀析出[15]。

3 絲素蛋白納微米球的制備方法

目前制備絲素蛋白納微米球的方法比較成熟，主要制備方法見表1。

由表1可見，制備方法所選擇的工藝參數(shù)條件直接決定了絲素蛋白納微米球的尺寸大小。例如噴霧干燥法、電壓驅(qū)動(dòng)成球法及微流控法制備得到的絲素蛋白納微米球的粒徑主要與噴嘴的孔徑有關(guān)，脂質(zhì)體模板法、鹽析法、溶劑-非溶劑法及液中干燥法制備得到的絲素蛋白納微米球的粒徑主要與絲素蛋白的濃度有關(guān)，乳化溶劑揮發(fā)法及化學(xué)交聯(lián)法制備的絲素蛋白納微米球的粒徑主要與乳化劑及攪拌的速率有關(guān)。另外，制備方法直接決定絲素蛋白納微球的成球性能和載藥性能。其中噴霧干燥法、脂質(zhì)體模板法、電壓驅(qū)動(dòng)成球法、微流控法都需要經(jīng)過后處理來提高絲素蛋白納微米球的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)而延緩藥物的釋放，尤其噴霧干燥法不利于活性受溫度影響的藥物。鹽析法、溶劑-非溶劑法，以及液中干燥法的成球易粘連，分散性差，藥物含量也會(huì)影響成球性能。乳化溶劑揮發(fā)法制備的絲素蛋白納微米球需通過甲醇等有機(jī)溶劑處理提高穩(wěn)定性。除此之外，制備流程繁瑣、影響因素和工藝條件難以控制，只能停留在實(shí)驗(yàn)室小批量生產(chǎn)。雙相乳化交聯(lián)法主要利用絲素蛋白中的羥基、羧基及氨基等反應(yīng)性基團(tuán)與小分子交聯(lián)劑或合成大分子反應(yīng)，如添加京尼平、戊二醛等交聯(lián)劑等形成絲素蛋白納微米球，盡管可直接提高絲素蛋白納微米球中的β折疊含量，但是添加的交聯(lián)劑可能存在安全隱患。

4 絲素蛋白納微米球作為藥物控釋載體的研究進(jìn)展

4.1 單一小分子藥物

小分子藥物通常存在毒副作用大、穩(wěn)定性差、生物利用度差、療效低等突出問題。利用絲素蛋白具有親水無定型區(qū)和疏水結(jié)晶區(qū)等獨(dú)特的特性，可為小分子藥物的有效負(fù)載和穩(wěn)定性的提高創(chuàng)造有利條件。Pritchard等[22]將抗生素藥物包埋在絲素蛋白納微米球中，研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白納微米球在保持抗生素穩(wěn)定性的同時(shí)，延緩了抗生素的作用時(shí)間。另外，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白納微米球的存在有助于鼠感染傷口的愈合，療效提高的同時(shí)也減少了用藥頻率。Xiao等[23]接著通過優(yōu)化溶劑體系精準(zhǔn)調(diào)控絲素蛋白的純化過程，直接制備得到100～200 nm的絲素蛋白納微米球，如圖1所示;以鹽酸阿霉素抗癌藥物為模型，并成功地負(fù)載在絲素蛋白納微米球中，并改變釋放液的pH值來調(diào)控藥物的釋放速率（4.5>6.0>7.0），從而滿足腫瘤組織酸性條件下釋放速率更快的要求。另外，高分散的負(fù)載有鹽酸阿霉素的絲素蛋白納微米球?qū)Π┘?xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，有望后期用于癌癥的臨床治療。Li等[24]利用自組裝法制備得到包封率為7.7%、載藥率為1.54%的埃洛替尼-絲素蛋白納微米球。與游離藥物相比，絲素蛋白納微米球的存在能有效延緩藥物的釋放速率并對(duì)細(xì)胞發(fā)揮更持久的毒性，有望用于乳腺癌的高效治療。筆者利用液中干燥法制備了姜黃素-絲素蛋白納微米球，如圖2所示。通過體外釋放數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，不同粒徑大小的絲素蛋白納微米球可實(shí)現(xiàn)對(duì)姜黃素藥物精準(zhǔn)釋放調(diào)控。對(duì)大鼠進(jìn)行口服給藥后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)絲素蛋白納微米球包埋的姜黃素相比于純姜黃素顆粒更有助于體內(nèi)吸收（圖2）。該研究證實(shí)了絲素蛋白納微米球能提高疏水性藥物的溶出度，進(jìn)而提高了姜黃素在大鼠體內(nèi)的生物利用度[25]。盡管絲素蛋白納微米球在單一小分子藥物的負(fù)載和釋放等方面取得一定進(jìn)展，但是依然存在藥物的裝載效率低、親水性藥物突釋甚至暴釋、疏水性藥物滯釋等問題。

4.2 單一大分子藥物

生物活性多肽及蛋白質(zhì)大分子藥物具有給藥后的毒副作用小、見效快、療效好等優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)前藥物控釋體系的研究熱點(diǎn)，但是依然存在生物半衰期短、不易透過生物膜、易在體內(nèi)酶解等問題，從而無法有效發(fā)揮藥物的最佳療效。絲素蛋白納微米球是大分子藥物的優(yōu)異載體，在藥物控釋體系的應(yīng)用研究中取得了一系列進(jìn)展。例如，Zhang等[26]首次報(bào)道了利用自組裝方法將將寡脫氧核苷酸（Oligodeoxynucleotides，ODNs）包埋在絲素蛋白納微米球上（Silk Fibroin-ODNs Nanospheres，SF-ODNs NPs），解決了ODNs無法有效轉(zhuǎn)染到免疫細(xì)胞中的難題，有望用于免疫疾病的治療。Germershaus等[27]分別將聚賴氨酸和魚精蛋白裝載在絲素蛋白納微米球中，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白分子與蛋白藥物分子之間的靜電作用力受溶液的離子強(qiáng)度調(diào)控，明確相互作用機(jī)制的同時(shí)也為蛋白藥物的選擇提供了理論支撐。Schultz等[28]將胰島素生長(zhǎng)因子I（Insulin Growth Factor，IGF-I）包埋在絲素納微米球中，并對(duì)IGF-I的空氣動(dòng)力學(xué)和釋放性能進(jìn)行表征，經(jīng)體外人肺葉模型研究表明，IGF-I可有效穿過肺上皮屏障，這為肌肉萎縮癥的治療提供了一種全新的給藥方式。筆者利用液中干燥法將奧曲肽裝載在絲素蛋白納微米球中，經(jīng)體外釋放研究發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙醇處理的奧曲肽-絲素蛋白納微米球的高β折疊含量能顯著降低了突釋，并實(shí)現(xiàn)了奧曲肽的零級(jí)長(zhǎng)效釋放（102天）。經(jīng)大鼠肌肉注射高劑量乙醇處理的奧曲肽-絲素蛋白納微米球后，28天內(nèi)體內(nèi)的血藥濃度一直高于50 pg/mL，且在56天后血藥濃度升高到280 pg/mL，分析認(rèn)為與絲素蛋白納微米球在體內(nèi)降解有關(guān)。該研究證實(shí)了絲素蛋白納微米球具有實(shí)現(xiàn)奧曲肽的長(zhǎng)效緩釋的潛力，為后期開發(fā)新型長(zhǎng)效緩釋奧曲肽制劑提供了研究基礎(chǔ)[6]。另外，經(jīng)絲素蛋白納微米球負(fù)載的蛋白藥物的穩(wěn)定性和藥物活性相比于游離態(tài)明顯提高[12]。

4.3 雙元藥物協(xié)同組合

除了負(fù)載單一的藥物之外，多種藥物同時(shí)負(fù)載在絲素蛋白納微米球載體基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)協(xié)同高效治療是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Li等[29]利用自組裝法將姜黃素和5-氟尿嘧啶兩種抗癌藥物裝載到絲素蛋白納微米球中（217 nm±0.4 nm），兩種藥物的負(fù)載效率分別為15%和45%，并實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)效緩慢釋放。另外，這雙藥遞送系統(tǒng)能顯著增加活性氧的水平，有助于抑制腫瘤生長(zhǎng)，證實(shí)了雙元藥物基絲素蛋白納微米球能高效治療乳腺癌。Numtata[30]等首先利用溶劑-反溶劑法將FITC負(fù)載在絲素蛋白納米微球中，然后將含有異硫氰基熒光素（Fluoresceine Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）的絲素蛋白納微米球的絲素-乙醇溶液經(jīng)渦旋形成凝膠，最后將其浸泡在羅丹明B（Rhodamine B，RhB）的水溶液中制備含雙藥的絲素蛋白納微米球-凝膠復(fù)合載體系統(tǒng)。體外釋放實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，相比于純絲素蛋白納微米球，絲素蛋白納微米球-凝膠復(fù)合載體系統(tǒng)的空間阻礙能進(jìn)一步延緩FITC、RhB的釋放速率。因此，利用雙藥釋放系統(tǒng)可針對(duì)不同類型的生物活性分子的釋放速率的要求靈活設(shè)計(jì)。Hassani等[31]首先將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子包埋在絲素蛋白納微米球中，然后再嵌入到含有萬古霉素的絲素蛋白支架中構(gòu)建雙重藥物釋放系統(tǒng)。經(jīng)體外釋放動(dòng)力學(xué)表明，萬古霉素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分別在21天和28天內(nèi)釋放了9956%和14%，釋放的萬古霉素能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng);且血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生物活性依然達(dá)到75%，有望解決骨組織修復(fù)過程中細(xì)菌感染的問題。Crivelli等[32]發(fā)現(xiàn)絲素蛋白納微米球是雙藥（塞來昔布或姜黃素）的細(xì)胞和血液相容性的最佳載體，證實(shí)了絲素蛋白納微米球可以促進(jìn)雙藥的抗炎特性，并可以用于骨關(guān)節(jié)炎的高效治療。

5 結(jié) 論

首先，氨基酸為組成單位的絲素蛋白納微米球具有優(yōu)異的生物相容性和可靠的生物安全性。其次，制備方法和機(jī)理研究的不斷優(yōu)化與深入為絲素蛋白高效裝載藥物提供了技術(shù)和理論支撐。最后，以絲素蛋白納微球?yàn)檩d體基質(zhì)實(shí)現(xiàn)從單一的小分子藥物到雙元藥物的成功裝載及高效遞送為藥物控釋制劑的研發(fā)和應(yīng)用提供了豐富的實(shí)踐依據(jù)。

盡管絲素蛋白納微米球極具開發(fā)潛力，但起步晚，有許多不足之處。絲素蛋白納微米球需后處理，流程增加的同時(shí)影響藥物的載藥量和活性;釋放速率難以精準(zhǔn)調(diào)控，難溶性藥物存在滯釋，甚至停釋的現(xiàn)象;研究?jī)H停留在實(shí)驗(yàn)室可行性的研究基礎(chǔ)上，目前尚未有針對(duì)絲素蛋白納微米球的控釋制劑問世，離真正的臨床治療應(yīng)用尚有距離。因此，科研學(xué)者們應(yīng)重點(diǎn)在絲素蛋白納微米球的理化性能、載、釋藥性能，以及不同的給藥途徑需求上下足功夫。

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