檢測(cè)與診斷技術(shù)要點(diǎn)（第二版）（上）

1 概述

1.1 病原特性 非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種有囊膜的DNA 病毒，是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員。ASFV 粒子直徑約為200 納米，呈正20面體結(jié)構(gòu)，由多層同心圓結(jié)構(gòu)組成，由內(nèi)到外依次是基因組DNA、基質(zhì)層、內(nèi)膜、核衣殼和外囊膜。首次發(fā)現(xiàn)的傳入我國(guó)的ASFV毒株屬于基因II型。ASFV的衣殼蛋白p72，膜蛋白p54、p30 和p12 具有良好的抗原性。ASFV 耐受酸堿的范圍較廣，pH 值4～10 條件下在無(wú)血清的培養(yǎng)基中保持穩(wěn)定，但在pH值低于4或高于11.5時(shí)數(shù)分鐘內(nèi)可被滅活。ASFV 對(duì)環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，在低溫條件下可存活數(shù)年。ASFV對(duì)熱的抵抗力較弱，60 ℃20 min 或56 ℃70 min 可被滅活。一般的消毒措施均可有效殺滅ASFV。最有效的消毒劑是去污劑、次氯酸鹽、堿類及戊二醛。

1.2 傳染源 帶非洲豬瘟病毒的野豬和發(fā)病家豬的分泌物及排泄物，含有病死豬組織或非洲豬瘟病毒污染的泔水，含非洲豬瘟病毒的豬肉及其制品，以及鈍緣軟蜱。

1.3 傳播途徑 感染豬與健康易感豬的直接接觸可傳播非洲豬瘟病毒。非洲豬瘟病毒可通過(guò)飼喂污染的泔水、污染的飼料、墊草、車輛、設(shè)備、衣物等間接傳播。鈍緣蜱屬的軟蜱，特別是O.moubata（非洲）和O.erraticus（歐洲）是ASFV 的宿主和傳播媒介。消化道和呼吸道是最主要的感染途徑。

1.4 易感動(dòng)物 家豬和野豬。其他哺乳動(dòng)物包括人類均不感染非洲豬瘟病毒。目前報(bào)道的發(fā)病豬群主要是飼喂了被非洲豬瘟病毒污染的泔水。不同品種、日齡和性別的豬均對(duì)非洲豬瘟病毒易感。

1.5 潛伏期 家豬為3～19 d不等。

1.6 臨床癥狀 非洲豬瘟是能引起不同品系、不同年齡家豬和野豬一系列綜合征的疾病。急性豬瘟表現(xiàn)為高燒、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血，死亡率高。ASFV 有強(qiáng)毒力、中等毒力和低毒力三種類型毒株。臨床上可分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。

1.6.1 最急性型 發(fā)病豬體溫達(dá)41～42 ℃，呈現(xiàn)厭食、食欲廢絕、精神沉郁、皮膚充血等癥狀，1～4 d 內(nèi)死亡。也有無(wú)癥狀死亡的豬。發(fā)病率和病死率均可達(dá)100%。

1.6.2 急性型 發(fā)病豬體溫達(dá)40～42 ℃，呈現(xiàn)厭食、不愿活動(dòng)、皮膚發(fā)紅、嘔吐、鼻腔出血、血便、便秘等。妊娠母豬流產(chǎn)。病死率可達(dá)90%～100%。

1.6.3 亞急性型 與急性型類似。病豬出現(xiàn)中度發(fā)熱，食欲下降。皮膚出血和水腫，感染后7～20 d死亡，病死率為30%～70%。

1.6.4 慢性型 病豬體重下降、生長(zhǎng)不良，呈現(xiàn)間歇熱，耳部、腹部和大腿內(nèi)側(cè)皮膚發(fā)生壞死或潰瘍，關(guān)節(jié)腫大，感染豬可出現(xiàn)呼吸道癥狀。

1.7 實(shí)驗(yàn)室診斷 ASF 的實(shí)驗(yàn)室診斷分為病原學(xué)診斷（包含病毒分離、病毒抗原和基因組DNA的檢測(cè)）和抗體檢測(cè)。依據(jù)地區(qū)或國(guó)家的疾病情況及診斷實(shí)驗(yàn)室的能力選擇合適的診斷方法。

1.7.1 鑒定病原 國(guó)家法定實(shí)驗(yàn)室診斷必須進(jìn)行豬原代巨噬細(xì)胞或骨髓培養(yǎng)接種分離病毒，用熒光抗體試驗(yàn)（FAT）檢測(cè)組織涂片或冷凍切片中的抗原，用PCR方法檢測(cè)基因組DNA。PCR是一種優(yōu)良的、靈敏的、快速的ASFV 檢測(cè)技術(shù)，在很多情況下都是非常有用的。特別是組織不適合病毒分離和抗原檢測(cè)的情況。

在可疑病例中，病料在豬原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代，并重復(fù)上述過(guò)程。

1.7.2 血清學(xué)試驗(yàn) 耐受過(guò)ASF 自然感染的豬通常在感染后7～10 d產(chǎn)生抗ASFV抗體，這些抗體能持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間。若疾病呈地方性流行，或者是由低毒力毒株引起的最初的暴發(fā)，對(duì)于新暴發(fā)的研究需要對(duì)送檢的血清中的特殊抗體和組織滲出液進(jìn)行檢測(cè)。很多方法如間接熒光抗體（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和免疫印跡試驗(yàn)均可用于抗體檢測(cè)。

2 早期發(fā)現(xiàn)

為盡早發(fā)現(xiàn)ASF 疫情，首先要讓豬場(chǎng)全體員工熟悉ASF 的臨床癥狀。了解周邊3 km 范圍內(nèi)的養(yǎng)豬場(chǎng)戶、屠宰場(chǎng)點(diǎn)、生豬交易場(chǎng)所、無(wú)害化處理場(chǎng)等情況，密切關(guān)注周邊生豬異常死亡情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情隱患。

時(shí)刻關(guān)注本豬場(chǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)的豬只異常情況，包括豬只的精神狀態(tài)、采食情況、體溫變化、體表變化和經(jīng)產(chǎn)母豬表現(xiàn)等。目前我國(guó)大多數(shù)的ASFV 感染病例屬于急性-亞急性。通常，ASF 急性-亞急性的癥狀主要包括：發(fā)燒、昏睡、厭食、皮膚出血以及循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題并伴有神經(jīng)失調(diào)。

2.1 看精神狀態(tài) 及時(shí)發(fā)現(xiàn)欄舍內(nèi)眼神異常的豬只（這時(shí)豬只可能還未排毒）、精神沉郁的豬只，并及時(shí)采樣和送檢。豬場(chǎng)要積極發(fā)動(dòng)一線員工關(guān)注異常豬只，對(duì)于提前發(fā)現(xiàn)豬只異常并及時(shí)采樣經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陽(yáng)性的，給予相應(yīng)獎(jiǎng)勵(lì)。

2.2 觀察采食情況 關(guān)注群體和個(gè)體豬只的采食情況，對(duì)于采食量稍微減少的（排除飼料因素），要盡快采樣送檢。采食量明顯下降的豬只一般會(huì)伴隨著體溫升高。

2.3 監(jiān)測(cè)體溫變化 正常保育豬、育肥豬的體溫一般在39～40 ℃之間；正常成年基礎(chǔ)豬群的體溫在38～39 ℃之間（其中母豬發(fā)情、分娩前后幾天，體溫會(huì)升到39～40 ℃之間）。如果發(fā)現(xiàn)體溫超過(guò)正常范圍的豬只，應(yīng)及時(shí)采樣送檢。為了防止測(cè)量體溫時(shí)交叉污染，體溫計(jì)必須一豬一換，須戴手套和穿防護(hù)服；可采用遠(yuǎn)紅外體溫計(jì)測(cè)溫，盡量不入欄。

2.4 觀體表變化 看到皮膚發(fā)紅豬只，表明豬只處于發(fā)燒狀態(tài)。另外，有些豬只打針時(shí)出現(xiàn)凝血不良。對(duì)于這些異常豬只，要及時(shí)采樣檢測(cè)。

2.5 看經(jīng)產(chǎn)母豬的表現(xiàn) 經(jīng)產(chǎn)母豬除上述臨床表現(xiàn)外，還會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)。ASF 造成流產(chǎn)有別于其他疫病常見(jiàn)的黑胎或白胎，會(huì)出現(xiàn)胎兒均質(zhì)發(fā)紅。

一旦發(fā)現(xiàn)可疑癥狀，應(yīng)第一時(shí)間采樣送檢。采樣優(yōu)先順序如下：鼻腔拭子＞唾液＞陰門(mén)拭子＞肛門(mén)拭子。

3 現(xiàn)場(chǎng)排查

3.1 準(zhǔn)備工作

3.1.1 人員準(zhǔn)備 了解非洲豬瘟基本知識(shí)（基本的生物學(xué)特征、流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)、剖檢病理變化等）。了解非洲豬瘟感染與傳播的高風(fēng)險(xiǎn)因素（飼喂泔水、生物安全水平低、動(dòng)物販運(yùn)、豬肉及其制品流通）。了解排查工作中需遵守的生物安全操作要求，避免人為造成傳播。養(yǎng)殖戶等相關(guān)人員可能面臨較大壓力，應(yīng)注意工作方式方法。

3.1.2 車輛準(zhǔn)備 車輛必須徹底清洗消毒。車輛不攜帶無(wú)關(guān)物品。在車內(nèi)、車的后備箱里鋪塑料布防止污染。

3.1.3 物品準(zhǔn)備（生物安全防護(hù)及采樣所需物品）

3.1.3.1 進(jìn)場(chǎng)所需材料清單 膠靴；垃圾袋（包括生物危險(xiǎn)品垃圾袋）；一次性生物安全防護(hù)服；自封袋（用來(lái)裝手機(jī)或其他設(shè)備）；口罩；面部用消毒濕巾；鞋套或靴套；密封用膠帶；一次性乳膠手套；護(hù)目鏡；洗滌劑及刷子；消毒劑及噴壺（適用于非洲豬瘟病毒的消毒劑）。

3.1.3.2 采樣所需材料清單 一般材料：標(biāo)簽和記號(hào)筆；數(shù)據(jù)記錄表、筆、寫(xiě)字板；盛放針頭和刀片的銳器盒；高壓滅菌袋；用于環(huán)境采樣的拭子和盛放拭子用的離心管。

樣品包裝運(yùn)輸所需材料：容器/離心管/小瓶（防漏并標(biāo)示清楚）；吸水紙；密封性好的容器或袋子，作為二次包裝（即防漏），用于儲(chǔ)存動(dòng)物樣品的容器和采血管；冷藏箱（+4 ℃）；便攜式-80 ℃冷凍箱/干冰/液氮罐（僅在遠(yuǎn)離設(shè)備齊全的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行取樣時(shí)才需要）；保定動(dòng)物的材料（如套索、木板）。

采血所需材料：消毒劑和脫脂棉（酒精棉）；不含抗凝劑的無(wú)菌采血管（10 mL）（紅色蓋子）；含有EDTA的無(wú)菌采血管（10 mL）（紫色蓋子）；根據(jù)豬的大小和采樣部位（頸靜脈、耳緣靜脈）選取真空采血管或10～20 mL注射器。

3.2 進(jìn)出養(yǎng)殖場(chǎng)要求

3.2.1 抵達(dá)養(yǎng)殖場(chǎng) 車輛停在養(yǎng)殖場(chǎng)入口附近，不要駛進(jìn)場(chǎng)內(nèi)。

在養(yǎng)殖場(chǎng)指定的地點(diǎn)（清潔區(qū)），穿戴個(gè)人防護(hù)設(shè)備（如需要，應(yīng)遵循養(yǎng)殖場(chǎng)的要求進(jìn)行個(gè)人防護(hù)），并進(jìn)行物資準(zhǔn)備、消毒劑制備等。

進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)區(qū)域前，脫下和摘掉不必要的衣服和物品（夾克、領(lǐng)帶、手表等），清空衣服口袋，按照養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)場(chǎng)程序（淋浴洗澡或其他方式）進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)域。電子設(shè)備（移動(dòng)電話等）應(yīng)放置在密封的塑料袋中，以便隨后進(jìn)行清潔和消毒。在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)，只能通過(guò)塑料袋使用手機(jī)，不要從袋子里拿出。其他非一次性物品，應(yīng)在消毒后進(jìn)場(chǎng)。如需要，應(yīng)按照養(yǎng)殖場(chǎng)物資進(jìn)場(chǎng)程序進(jìn)行消毒后進(jìn)場(chǎng)。消毒工作要在清潔干燥的地面進(jìn)行（最好是混凝土地面），應(yīng)劃分清潔區(qū)和非清潔區(qū)并保證界線清晰。

3.2.2 穿戴個(gè)人防護(hù)設(shè)備（在清潔區(qū)）

（1）脫下鞋子，并放在塑料布上。

（2）在遵守養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)場(chǎng)要求的前提下，部分場(chǎng)需要脫去全部個(gè)人衣服，洗澡后穿戴養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)部衣服方可進(jìn)場(chǎng)。

（3）部分場(chǎng)可以首先穿戴一次性防護(hù)服，穿上靴子。戴手套，手套要用膠帶封上。

（4）如果需要穿防水服，防水服應(yīng)套在靴子外層。再戴一層手套，方便中間更換。

（5）靴套至少覆蓋膠鞋底部和下部。

（6）進(jìn)場(chǎng)前，戴口罩并仔細(xì)檢查物品清單。

3.2.3 離場(chǎng)前準(zhǔn)備

（1）在非清潔區(qū)域?qū)佑|過(guò)養(yǎng)殖場(chǎng)的所有物品進(jìn)行清洗和消毒處理。

（2）對(duì)盛放樣品容器的表面進(jìn)行消毒，然后放在清潔區(qū)。

（3）脫下鞋套放入非清潔區(qū)的垃圾袋中，然后徹底擦洗靴子（特別是鞋底）。脫下手套并放入非清潔區(qū)的垃圾袋中。脫下一次性防護(hù)服并放入非清潔區(qū)的垃圾袋中。脫下靴子，對(duì)靴子進(jìn)行消毒后放入清潔的袋子里。

（4）手和眼鏡也必須進(jìn)行消毒，并用消毒濕巾清潔臉部。

（5）進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)域的人員在指定區(qū)域沐浴更衣后方可離開(kāi)。

（6）非一次性物品（膠靴等）和盛放樣品的容器用雙層袋盛放并用膠帶封裝?？纱┗厝粘５男?。攜帶出養(yǎng)殖場(chǎng)的袋子需放在車輛內(nèi)預(yù)先鋪好的塑料布上。

（7）接觸過(guò)樣品或潛在污染的車輛，應(yīng)進(jìn)行重點(diǎn)清洗消毒。

（8）在離開(kāi)可能受到污染的區(qū)域之前，清潔和消毒汽車的輪胎和表面。清除所有可見(jiàn)的污垢。不要忘記清理隱藏的區(qū)域，如車輪拱、輪胎板和汽車底部。清除所有污垢后，用消毒劑噴灑表面。

（9）處理車內(nèi)所有垃圾并清理所有污垢（應(yīng)妥善處理垃圾）。用浸有消毒劑的布擦拭方向盤(pán)、變速桿、踏板、手閘等。

3.2.4 離場(chǎng)后

（1）如家中沒(méi)有飼養(yǎng)生豬，可以回家淋浴并徹底清洗頭發(fā)，并將當(dāng)天所穿衣服浸泡在消毒劑中30 min；如果家中飼養(yǎng)生豬，則應(yīng)在其他地方沐浴、清洗。

（2）如果進(jìn)入了疑似感染場(chǎng)，確診前不應(yīng)前往任何飼養(yǎng)生豬的場(chǎng)所。如果確認(rèn)該場(chǎng)感染了非洲豬瘟，3 d內(nèi)不應(yīng)前往任何有豬的場(chǎng)所。

（3）再次對(duì)汽車內(nèi)部和外部進(jìn)行消毒。清除汽車上的所有塑料布，并妥善處理。

3.2.5 消毒劑選擇

（1）非洲豬瘟病毒對(duì)熱的抵抗力較弱，一般的消毒措施都可以將病毒殺滅，但是在感染病豬組織以及低溫條件下病毒的存活時(shí)間可達(dá)6個(gè)月以上乃至數(shù)年。

（2）最有效的消毒劑是去污劑、次氯酸鹽、堿類及戊二醛。

（3）8/1 000 的氫氧化鈉（30 min）、2%～3%次氯酸鹽氯（30 min）、3/1 000福爾馬林（30 min）、3%鄰苯基苯酚（30 min），均可滅活病毒。堿類（氫氧化鈉、氫氧化鉀等）、氯化物和酚化合物適用于建筑物、木質(zhì)結(jié)構(gòu)、水泥表面、車輛和相關(guān)設(shè)施設(shè)備的消毒，酒精和碘化物適用于人員消毒。

（4）不易消毒的設(shè)備放置在陽(yáng)光下暴曬消毒。

3.3 臨床診斷 非洲豬瘟病豬主要臨床表現(xiàn)的差異較大，不易識(shí)別，但通常有以下幾種或全部典型癥狀，包括高熱、嘔吐、腹瀉或便秘，有的便血，虛弱、難以站立，體表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮膚呈紅色、紫色或藍(lán)色，有的咳嗽、呼吸困難，母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或弱胎。出現(xiàn)上述臨床癥狀后，一般2～10 d 內(nèi)死亡。剖檢可見(jiàn)內(nèi)臟多個(gè)器官組織出血，脾臟顯著腫大，顏色變暗，質(zhì)地變脆。部分首次發(fā)生非洲豬瘟的養(yǎng)殖場(chǎng)，豬群發(fā)病非常急，最急性型不表現(xiàn)任何癥狀而突然死亡，無(wú)特殊臨床表現(xiàn)和剖檢病變。

3.3.1 臨床癥狀 根據(jù)其毒力，ASFV 分為三個(gè)主要類別：高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力毒株。ASF的臨床表現(xiàn)形式從特急性（非常急）到無(wú)癥狀（不明顯）不等。目前我國(guó)大多數(shù)的ASFV感染病例屬于急性-亞急性。非洲豬瘟的特征通常是豬突然死亡、死前呈現(xiàn)體溫升高。臨床表現(xiàn)從感染7 d 之內(nèi)急性死亡，到持續(xù)幾周或幾個(gè)月的慢性感染不等。

主要臨床癥狀有：無(wú)癥狀突然死亡；發(fā)病率、病死率高；高熱，體溫升高至40.5～42 ℃；耳、四肢、腹背部皮膚有出血點(diǎn)、發(fā)紺；嘔吐，腹瀉或便秘，糞便帶血；虛弱、步態(tài)僵直，不愿站立等；偶見(jiàn)眼、鼻有黏液膿性分泌物。

其他臨床癥狀有：精神沉郁、食欲下降；呼吸困難，濕咳；關(guān)節(jié)疼痛、腫脹；妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔。

3.3.2 剖檢病變 非洲豬瘟特征性剖檢病變通常是可見(jiàn)多臟器出血。

最明顯的剖檢病變是：淋巴結(jié)（特別是胃腸和腎）增大、水腫以及整個(gè)淋巴結(jié)出血，形態(tài)類似于血塊；脾臟顯著腫大，一般情況下是正常脾的3～6倍，顏色變暗，質(zhì)地變脆；腎臟表面有瘀點(diǎn)（斑點(diǎn)狀出血）。

剖檢變化還可能包括：皮下出血；心包積液和體腔積水、腹水；心臟表面（心外膜）、膀胱和腎臟（皮質(zhì)和腎盂）有出血點(diǎn)；肺可能出現(xiàn)充血和瘀點(diǎn)，氣管和支氣管有泡沫，嚴(yán)重的有肺泡和間質(zhì)性肺水腫；身體有瘀點(diǎn)、瘀斑（較大的出血），胃、小腸和大腸中過(guò)量的凝血；肝充血和膽囊出血。

（未完待續(xù)）