辛 悅,楊萬山,金光洙,孫 抒*,趙俊軍

(1.大連市中心醫(yī)院 病理科，遼寧 大連116000；2.延邊大學醫(yī)學院 病理學與法醫(yī)學教研室，吉林 延吉133002;3.延邊大學藥學院 藥物化學教研室，吉林 延吉133002)

從天然藥用資源中尋找高效低毒的化合物作為新一代的化療藥物已備受矚目。二氫青蒿素和大黃素的抗腫瘤作用日益受到關注，對其抗腫瘤作用機制的研究也廣泛開展[1-4]。大量研究表明二氫青蒿素和大黃素對腫瘤細胞均可起到抑制其增殖，誘導其凋亡[5,6]；抑制腫瘤新生血管的形成；抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的作用[7]。本實驗使用的復合物是通過合成開發(fā)的兩個抗腫瘤活性單體--二氫青蒿素和大黃素通過酯鍵結合的新型抗腫瘤候選化合物-β-二氫青蒿素-大黃素復合物。為了檢測該藥物是否具有二氫青蒿素和大黃素一樣的抗腫瘤作用，我們設計了以下實驗。目前關于β-二氫青蒿素-大黃素復合物抗腫瘤作用尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物

人胃癌細胞SGC-7901購買于北京華美生科生物技術有限公司，由本實驗室體外培養(yǎng)、傳代。β-二氫青蒿素-大黃素復合物由延邊大學藥學院金光洙博士合成提供，先用吐溫80和0.3%的纖維素鈉溶解，并將其混勻，于-4℃保存?zhèn)溆?。再根?jù)需要，用PBS稀釋成實驗所需濃度。

1.2 主要試劑及儀器

MTT(Biomol公司)；蘇木素染液(Solarbio公司)；單克隆抗體(CyclinD1，Ki-67)、Annexin-V/PI試劑盒、(美國Becton Dikinson公司)；光學顯微鏡、熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)；流式細胞儀(美國BD公司)；全波長酶聯(lián)免疫檢測儀(TECAN公司產品，型號infiniteM200PRO)。

1.3 方法

1.3.1MTT比色法

將濃度為6×104個/ml的胃癌SGC-7901細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，實驗孔每孔加入180 μl的細胞懸液后，放入培養(yǎng)箱過夜。次日觀察貼壁后，每個實驗孔加入20 μl的藥物，藥物終濃度分別為2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml，而對照組每孔則加入20 μl的藥物溶劑作為陰性對照。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入20 μl的 MTT溶液(其濃度為5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h后，取出，避光，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，放在震蕩儀上振蕩，最后酶聯(lián)免疫檢測儀檢測在波長為492 nm處的吸光度(Optical density，OD)值。

為了保證實驗的準確性，重復實驗3次。利用公式計算出細胞的增殖抑制率。計算公式如下：腫瘤細胞增殖抑制率(%)=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.2倒置相差顯微鏡觀察

從37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中取出人胃癌SGC-7901細胞，在顯微鏡下選出處于對數(shù)生長期的細胞，分別加入終濃度為2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物和等量的藥物溶劑作為加藥組和對照組，再放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在倒置相差顯微鏡下分別觀察并拍照記錄。

1.3.3AO/EB染色

實驗組和對照組，分別加入終濃度為2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物和等量的藥物溶劑，將加完藥的6孔板重新再放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取相同體積的溴化乙錠和吖啶橙(濃度各為100 μg/ml)，混勻制成AO/EB熒光染色混合液，熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.3.4免疫細胞化學染色

將處于對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞吹打制成濃度為6×104個/ml的細胞懸液，設定實驗組和對照組，分別加入終濃度為2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物和等量的藥物溶劑，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，依據(jù)SABC免疫組織化學染色試劑盒步驟進行染色，操作步驟根據(jù)實際情況略加修正。Ki-67、CyclinD1單抗工作液(按1∶100的比例用抗體稀釋液稀釋)。結果的判斷：以每張爬片見棕黃色顆粒為陽性，以無色或淡染為陰性判斷。Ki-67、CyclinD1主要在細胞核表達。在40×10高倍鏡下觀察，并隨機選取5個視野，分別記錄陽性細胞和細胞總數(shù)。利用公式：陽性表達率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，計算陽性表達率。

1.3.5流式細胞儀檢測

選取處于對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞株→經過消化，吹打，離心，制成6×104個/ml細胞懸液→將細胞懸液移至培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁后，分別加入終濃度為2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物作為加藥組，加入等量藥物溶劑的作為對照組，上機檢測及分析結果：采用Mod Fit 3.0軟件，對細胞周期分布情況、樣品單參數(shù)DNA含量進行分析，并得出凋亡細胞的百分比含量和細胞周期的分布情況。

1.3.6統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞的抑制增殖作用

MTT的結果顯示出β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞具有明顯抑制增殖作用外(見表1)，隨著β-二氫青蒿素-大黃素復合物作用時間的延長，人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制率也明顯升高，其差異具有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明其具有時間依賴性；而隨著β-二氫青蒿素-大黃素復合物濃度的升高，人胃癌SGC-7901細胞的生長抑制率也顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明其具有濃度依賴性。當β-二氫青蒿素-大黃素復合物分別作用24 h、48 h、72 h時，SGC-7901細胞的IC50分別為7.4 μg/ml、4.6 μg/ml、2.4 μg/ml。

表1 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞株抑制增殖作用

注:相同濃度不同時間，同前一組比較▲P<0.05;相同時間不同濃度同前一組比較*P<0.05

對β-二氫青蒿素-大黃素復合物處理48 h后的人胃癌SGC-7901細胞進行流式細胞儀檢測分析，發(fā)現(xiàn)其細胞周期分布發(fā)生了顯著的變化(見表2)。對照組G0/G1期細胞占40.51±1.67%，G2/M期細胞占24.53±1.84%，S期細胞占34.34±2.03%；實驗組2.5 μg/ml的G0/G1期細胞占58.93±1.39%，較對照組升高，G2/M期占16.74±1.49%，S期細胞占27.44±0.77%，均較對照組減少。同樣，實驗組5 μg/ml和實驗組7.5 μg/ml兩組G0/G1期百分率升高，G2/M期和S期均減少(見表2)，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由數(shù)據(jù)可以看出，β-二氫青蒿素-大黃素復合物干擾了人胃癌SGC-7901細胞周期的分布，將細胞阻滯在G1期，抑制細胞的增殖，誘導其凋亡。

細胞發(fā)生凋亡時，其細胞核內的DNA發(fā)生斷裂，處于降解的過程，所以含量比G0/G1期的二倍體細胞低，體現(xiàn)在熒光直方圖上，就會在G0/G1期峰前出現(xiàn)特征性的亞二倍體峰(Apoptotic Peak，AP峰，又稱凋亡峰，圖1)。本實驗對照組細胞凋亡率為1.06±0.08%，3組實驗組細胞凋亡率分別為5.43±0.16%、8.44±0.17%、28.16±0.28%。可見其凋亡率隨藥物濃度的升高而增加，呈濃度梯度趨勢(表2),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 流式細胞儀分析細胞周期及凋亡率結果

表2 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對SGC-7901細胞周期的影響

注：*與對照組相比，▲與低濃度組相比，?與中濃度組相比，P<0.05

2.2 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞的誘導凋亡作用

倒置相差顯微鏡觀察對照組細胞貼壁良好，形態(tài)多為梭形或者多角形，伸展、透光性好，分布均勻，生長旺盛；實驗組分別加入2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氫青蒿素-大黃素復合物，作用48 h后，細胞外形皺縮，圓化，體積變小，雖細胞膜完整，但可見發(fā)泡現(xiàn)象，增殖受到不同程度的抑制。

AO/EB染色，48 h后經熒光顯微鏡觀察，對照組細胞呈現(xiàn)為形態(tài)結構正常的綠色均勻熒光(圖3-2A)；實驗組細胞隨著濃度的逐漸增高，可見發(fā)出綠色熒光的正常細胞數(shù)量逐漸減少，發(fā)出黃綠色熒光的早期凋亡細胞和發(fā)出橙紅色熒光的晚期凋亡細胞數(shù)量逐漸增多，偶爾可見發(fā)出紅色熒光的壞死細胞(圖2B、圖2C、圖2D)。

圖2 AO/EB熒光染色實驗觀察細胞形態(tài)(×400倍)

2.3 β-二氫青蒿素-大黃素復合物對胃癌細胞株抑制增殖作用相關基因蛋白表達的影響

利用免疫細胞化學染色的方法檢測了48 h后β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞中的細胞增殖核抗原Ki-67和細胞周期蛋白CyclinD1的表達的影響。Ki-67和CyclinD1均在細胞核表達，經實驗發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白的對照組細胞胞核均呈深棕色，細胞狀態(tài)良好，且胞核形狀規(guī)則；而實驗組細胞變小變圓、胞核固縮，與鄰近細胞分離，隨著藥物濃度逐漸增高，細胞數(shù)量減少，棕色顆粒數(shù)量也隨之減少，棕黃色染色越淡。利用計算公式得出蛋白陽性表達率，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 免疫細胞化學染色實驗后Ki-67、CyclinD1蛋白陽性表達率的變化

3 討論

青蒿素(Artemisinin),是從菊科植物黃花蒿的葉和花蕾中提取出的一種具有過氧化基團結構的倍半萜內酯化合物，是由我國最先開發(fā)并得到國際認可的抗瘧中草藥。值得驕傲的不僅在于青蒿素被譽為是“治瘧神藥”，拯救了數(shù)百萬計的生命，還在于其發(fā)現(xiàn)者屠呦呦教授因此被授予了2015年諾貝爾生理或醫(yī)學獎的殊榮。

青蒿素中的主要活性成分為二氫青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)又名為雙氫青蒿素。分子式為C15H24O5，分子量為284。DHA是目前所了解的青蒿素類化合物中抗腫瘤作用上佳的一類成分[8]。另一經典的抗腫瘤中草藥為大黃素(emodin)。大黃素，化學名1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthra-quinone)，又稱朱砂蓮甲素，分子式為：C15H10O5，屬蒽醌類衍生物,是從植物Polygonum Cuspidatum中提取的，具有廣泛的生物學活性及藥理作用[9,10]，這兩種經典中草藥-二氫青蒿素和大黃素，他們的抗腫瘤作用日益受到關注，對其抗腫瘤作用機制的研究也廣泛開展[11-14]。本實驗所用的復合物是將二氫青蒿素和大黃素兩種抗腫瘤活性單體通過酯鍵結合形成的復合物，我們的實驗通過MTT比色法檢測到β-二氫青蒿素-大黃素復合物對人胃癌SGC-7901細胞有抗增殖作用；又通過多項傳統(tǒng)的和現(xiàn)代的染色技術，從形態(tài)學上觀察到了受β-二氫青蒿素-大黃素復合物影響的SGC-7901細胞發(fā)生的變化；利用流式細胞儀對藥物作用前后細胞的周期及凋亡率做了半定量的檢測，發(fā)現(xiàn)β-二氫青蒿素-大黃素復合物干擾了人胃癌SGC-7901細胞周期的分布，將細胞阻滯在G1期，抑制細胞的增殖，誘導其凋亡。免疫細胞化學實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，β-二氫青蒿素-大黃素復合物作用的人胃癌SGC-7901細胞的實驗組中，細胞增殖核抗原Ki-67和細胞周期蛋白CyclinD1的表達明顯降低，說明β-二氫青蒿素-大黃素復合物抑制了細胞的增殖，并且抑制增殖的原因可能與周期分布異常有關?？梢姡?二氫青蒿素-大黃素復合物是一種極具開發(fā)價值的新型抗胃癌藥物。