陳富海，林曉君，凃彥芳，劉博婷，余 璐，蔡鞏林，林錦銓，彭 凌

（韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）可使豬患一種急性、熱性、敗血性傳染病，即豬丹毒.臨診癥狀急性型表現(xiàn)為敗血癥，亞急性表現(xiàn)為皮膚上出現(xiàn)疹塊.慢性病豬表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎.各國研究人員對(duì)丹毒絲菌的研究已有一百多年，然而對(duì)其致病機(jī)制及毒力因子目前還未研究清楚［1］.從眾多研究可知丹毒絲菌屬各種菌株的毒力差別很大，有66%的紅斑丹毒絲菌會(huì)使動(dòng)物致病，也有將近96%的扁桃體丹毒絲菌對(duì)動(dòng)物無害.1882 年，Pasteur 首次從豬體內(nèi)分離到此菌，對(duì)引起豬丹毒的病原進(jìn)行精確描述是由Loffler 完成的，同時(shí)他還描述了豬感染該菌后出現(xiàn)的臨床癥狀，這是第一個(gè)描述這種有機(jī)體作為傳染性病原體引起豬的疾病.1883 年，Pasteur 和Thuillier 首次使用豬丹毒疫苗，此后，這種弱毒活疫苗和菌苗被長期用于控制豬和火雞的丹毒病癥［2］.豬丹毒絲菌在養(yǎng)殖業(yè)、食品衛(wèi)生安全以及人體健康等方面帶來了極大的威脅［3-4］.豬丹毒絲菌感染會(huì)引起熱性或急性人畜共患的傳染病，主要的傳染源是病豬以及各種帶菌動(dòng)物（最主要是帶菌豬）［5］.滅活疫苗、弱毒疫苗是現(xiàn)有的預(yù)防手段，但仍存在缺點(diǎn)，如保護(hù)周期短、保護(hù)率低等［6］，而新一代的亞單位疫苗也存在免疫譜窄的弱點(diǎn).現(xiàn)發(fā)現(xiàn)反向疫苗可以用細(xì)菌的毒力因子作研究的重要線索，同時(shí)探索毒力因子的種類并研究其功能，還將在研制安全高效的疫苗方面提供重要的理論基礎(chǔ).因此對(duì)丹毒絲菌毒力因子的研究為了解各毒力因子相互關(guān)聯(lián)及其致病機(jī)制提供證據(jù)，并為有效減少豬丹毒對(duì)養(yǎng)殖業(yè)所造成的經(jīng)濟(jì)損失做出貢獻(xiàn).

筆者以臨床分離的豬丹毒絲菌野生強(qiáng)毒株為材料，采用DNA 重組技術(shù)構(gòu)建spaA 基因敲除載體，并利用該敲除載體結(jié)合同源重組技術(shù)敲除強(qiáng)毒株上的spaA 基因.然后比較強(qiáng)毒株和敲除株小鼠毒力的差異來揭示SpaA 在致病中的初步作用，并為進(jìn)一步揭示SpaA 在致病中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬丹毒絲菌野生株SG7、大腸桿菌DH5α（由本實(shí)驗(yàn)室保存）.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氨芐青霉素、瓊脂糖、HindⅢ酶 、Pst Ⅰ酶、XbaⅠ酶、SmaⅠ酶、T4 DNA 連接酶、2×Pfu PCR Mix、SanPrep 柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、質(zhì)粒載體pUC18、SanPrep DNA 抽提取試劑盒、SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒等均購買于生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.1.3 儀器

2720Thermal Cycler（美國Applied biosystem 公司）、JS-680 凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）、HZQ-F 恒溫振蕩培養(yǎng)箱、3K18 高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma）、Ultrospec2000 紫外/可見分光光度計(jì)（美國Amersham Pharmacia Biotech）、DYY-6B 型穩(wěn)壓溫流電泳儀（北京市六一儀器廠）.

1.1.4 培養(yǎng)基

TSB 培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，牛肉粉2.5%，胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.2%，Tween 80 0.05%；LB 培養(yǎng)基： 胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%.

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)spaA 基因序列的上下游序列、Amp 抗性基因序列和載體pUC18 的多克隆位點(diǎn)，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物Up-s/Up-As、DOWN-s/DOWN-As 和Amp-s/Amp-As，分別根據(jù)spaA 基因設(shè)計(jì)和spaA 基因上下游區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)引物IN-1/IN-2 和外引物OUT-1/OUT-2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.引物信息見表1（斜體加粗部分為酶切位點(diǎn)）.

表1 引物序列和位置

1.2.2 目的片段的制備

以豬丹毒絲菌基因組DNA 作為模板，用表1 的引物分別擴(kuò)增上游片段L、下游片段R 和Amp 抗性基因A. PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收后分別用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ、Xba Ⅰ+Sma Ⅰ、Pst Ⅰ+Xba Ⅰ.雙酶切反應(yīng)體系：目的片段或質(zhì)粒載體（1～3μg），10×Tango Buffer（10μL），酶（2.5μL），用ddH2O 補(bǔ)足至總體積100μL. 37 ℃溫育3 h，65 ℃熱水浴15 min 使酶滅活，并回收酶切產(chǎn)物.

1.2.3 L、R 和A 片段的克隆

質(zhì)粒載體經(jīng)Hind Ⅲ+Pst Ⅰ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切處理的上游片段L 連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)培，經(jīng)質(zhì)粒提取、雙酶切和測序鑒定篩選出陽性克隆子pUC18-L.pUC18-L 經(jīng)Pst Ⅰ和Xba Ⅰ酶切后與經(jīng)同樣酶切處理的Amp 抗性基因A 段相連，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定后獲得正確重組質(zhì)粒pUC18-LA.pUC18-LA 經(jīng)過Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切后與同樣酶切處理的下游片段R 相連，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定最終獲得敲除載體pUC18-LAR.

1.2.4 敲除載體pUC18-LAR 的鑒定

用SanPrep 柱 式 質(zhì) 粒 小 量 抽 提 試 劑 盒 提 取 質(zhì) 粒，用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ、Hind Ⅲ+Xba Ⅰ、HindⅢ+SmaⅠ進(jìn)行交叉雙酶切鑒定.雙酶切體系：DNA（8.5μL），兩種酶（各0.5μL），10×Tango Buffer（1μL），37 ℃酶切1h.酶切產(chǎn)物經(jīng)65 ℃熱水浴15 min 使酶失活.經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆子，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序.

1.2.5 豬丹毒絲菌感受態(tài)制備

挑選豬丹毒絲菌單菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基（10 mL）中30℃培養(yǎng)16 h，取菌液（0.1 mL）轉(zhuǎn)接于TSB 液體培養(yǎng)基（10 mL），37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600=0.4），菌液經(jīng)30 min 冰浴后，分裝于預(yù)冷的離心管中，4 ℃離心（6 000 g/min）15 min 后，去上清，用預(yù)冷超純水重懸菌體沉淀，4 ℃離心（8 000 r/min）15min，重復(fù)兩次后，用500μL 14%預(yù)冷甘油溶液重懸細(xì)菌.

1.2.6 基因敲除菌的構(gòu)建

將鑒定正確的敲除載體pUC18-LAR（10 μL）與豬丹毒絲菌感受態(tài)（100 μL）置于冰上輕柔的混勻10 min.混合物在1.25 kv、600 Ω、25 μF 的電轉(zhuǎn)參數(shù)下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化.電轉(zhuǎn)化后，用37 ℃預(yù)溫的TSB 培養(yǎng)基（950 μL，含馬血清5%）懸浮細(xì)菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，離心（4 000 r/min）5 min 后涂布于TSB 瓊脂培養(yǎng)基（含5 μg/mL 氨芐青霉素）.

1.2.7 基因敲除株的鑒定

為檢測spaA 基因片段是否被抗性基因替換而缺失，挑取氨芐青霉素平板上的單菌落為模板，用表1的內(nèi)引物IN-1/IN-2 和外引物OUT-1/ OUT-2 分別進(jìn)行PCR 鑒定.反應(yīng)體系：2×PCR Mix（5μL），引物（各0.5μL），豬丹毒絲菌野生株SG7 基因組DNA 或疑似菌DNA（1μL），ddH2O（8μL）.反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸4 min，30 個(gè)循環(huán)后終延伸72 ℃ 10 min.將引物OUT-1/OUT-2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，獲得的基因敲除株暫命名為SG7ΔspaA.

1.2.8 小鼠毒力試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將55 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分成2 個(gè)大組，野生株SG7大組分5 個(gè)小組，敲除株SG7ΔspaA分為6 小組，每小組5 只.將兩種菌株培養(yǎng)后，采用10 倍梯度進(jìn)行稀釋后攻毒，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 梯度濃度菌液，對(duì)照鼠注射0.5 mL TSB液體培養(yǎng)基.對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，用Reed-Muench 法計(jì)算2 個(gè)菌株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量.

2 結(jié)果分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增

目的片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示上游片段L 長度大小為（1 107 bp），下游片段R 片段長度大小為（924 bp），Amp 抗性基因A 長度大小為（861 bp），與設(shè)計(jì)的片段大小一致.

圖1 目的片段的PCR擴(kuò)增

圖2 重組載體pUC18-LAR 酶切鑒定電泳圖

2.2 敲除載體pUC18-LAR 的鑒定

pUC18-LAR 的酶切鑒定見圖2，結(jié)果顯示pUC18-L 用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ雙酶切后獲得2 686 bp 和1 107 bp 兩 個(gè) 片 段，pUC18-LA 用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ雙 酶 切 后 獲 得2 686 bp 和1 968 bp 兩 個(gè) 片 段，pUC18-LAR 用Hind Ⅲ+Sma Ⅰ雙酶切后獲得2 686 bp、2 892 bp 兩個(gè)片段表明L、A、R 片段連接正確，測序結(jié)果表明3 個(gè)片段連接順序正確，無發(fā)生突變.

2.3 突變菌株的鑒定

基因敲除載體pUC18-LAR 電轉(zhuǎn)豬丹毒絲菌感受態(tài)細(xì)胞后，平板上長出若干單菌落，采用內(nèi)引物IN-1/IN-2 進(jìn)行菌落PCR 鑒定，結(jié)果見圖3，野生株能擴(kuò)增出符合預(yù)期大?。? 402 bp）的條帶，有3 個(gè)菌落沒有擴(kuò)增出條帶，可能為疑似敲除株，以這3 個(gè)疑似菌為模板用引物外引物OUT-1/OUT-2 鑒定，結(jié)果見圖4，以pUC18-LAR 作為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示，只有一個(gè)疑似菌株擴(kuò)增出與陽性對(duì)照一致大小的片段（2 365 bp），送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果說明此菌敲除成功.

圖3 內(nèi)引物IN-1/IN-2 菌落PCR 鑒定結(jié)果

圖4 引物OUT-1/OUT-2 菌落PCR 鑒定結(jié)果

2.4 小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果

野生株SG7 和敲除株SG7ΔspaA.對(duì)小鼠LD50（半數(shù)致死量）的測定統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2 和表3.根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算2 個(gè)菌株的半數(shù)致死量，野生株SG7 和敲除株SG7ΔspaA.對(duì)小鼠LD50 的分別為7.3×103CFU/mL 和7.45×105CFU/mL，與野生株相比敲除株SG7ΔspaA. 對(duì)小鼠的毒力降低102 倍.

表2 野生株SG7 株對(duì)小鼠LD50 的測定

表3 敲除株SG7ΔspaA 對(duì)小鼠LD50 的測定

3 討論

豬丹毒為散發(fā)性或地方流動(dòng)性傳染病，有時(shí)也出現(xiàn)爆發(fā)性流行，各種年齡和品種的豬均易感，給全球各地的養(yǎng)殖業(yè)帶來影響.有研究通過對(duì)比不同年代菌株的基因發(fā)現(xiàn)spaA 基因?yàn)楸Ｊ鼗?，同源性?00%［12-13］.SpaA 是豬丹毒絲菌的主要免疫保護(hù)性抗原，幾乎存在于所有毒力較強(qiáng)的菌株中，主要的保護(hù)功能核心區(qū)段為氨基端，且是由抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)［14-17］.SpaA 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了spaA 基因敲除載體，與spaA 基因上下游序列有部分同源序列，通過同源重組使得spaA 基因被敲除.電穿孔轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化率高，幾乎所有的細(xì)菌都有一套與之匹配的電穿孔操作條件的優(yōu)點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)利用該方法將豬丹毒絲菌spaA 基因敲除載體pUC18-LAR 導(dǎo)入野生株SG7 獲得基因敲除株SG7ΔspaA.敲除株SG7ΔspaA 相較于野生株對(duì)小鼠的毒力降低了102 倍，與豬丹毒絲菌的致病性有關(guān).為其致病機(jī)制和相關(guān)的疫苗研發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ).

4 結(jié)論

測序結(jié)果表明豬丹毒絲菌敲除株SG7ΔspaA 構(gòu)建成功.通過小鼠毒力實(shí)驗(yàn)證明，敲除株SG7ΔspaA 相較于野生株對(duì)小鼠的毒力降低了102 倍，證實(shí)SpaA 確實(shí)與豬丹毒絲菌的致病性有關(guān)，為后繼的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供一定的參考.