液相色譜-四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定保健食品中11種磷酸二酯酶抑制劑

趙孔祥，楊 爽，柴銘駿，劉 旸，葛寶坤

(天津海關動植物與食品檢測中心，天津300461)

磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑，俗稱那非類藥物，以西地那非為代表，主要用于治療男性勃起功能障礙。近年來，抗疲勞類保健品在市場上大量銷售，多數(shù)消費者認為:保健食品藥效緩和、毒副作用小、可以長期服用。但由于一些不法分子受利益驅(qū)使，為了增強其產(chǎn)品功效，在抗疲勞類保健品中大量非法添加壯陽類化學成分。消費者在不知情的情況下，長期或超劑量服用含有那非類藥物的保健品，會出現(xiàn)頭暈、惡心、青光眼等癥狀，甚至對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成嚴重損傷[1-2]。

保健食品中磷酸二酯酶抑制劑的測定方法主要有表面增強拉曼光譜法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-11]以及高分辨質(zhì)譜法等[12-15]。表面增強拉曼光譜法簡便快速，但容易受到基質(zhì)干擾且靈敏度不高。高效液相色譜法分離度高、專屬性較強、分析速率快，但分析復雜樣品時可能會有干擾，出現(xiàn)假陽性。液相色譜-質(zhì)譜法兼具高效的分離能力和高專屬性、高靈敏度的特性，可以同時得到目標化合物的保留時間、相對分子質(zhì)量、離子碎片等信息，從而對其結(jié)構(gòu)進行確證，提高了測定結(jié)果的可靠性，但受到方法的制約，只能對有限的目標化合物開展測定。高分辨質(zhì)譜法通過精確質(zhì)量數(shù)進一步提高了測定結(jié)果的可靠性，但靈敏度一般不如液相色譜-質(zhì)譜法。四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法的四極桿可根據(jù)質(zhì)荷比對目標化合物離子進行篩選，由C型離子阱對待測離子進行富集，再運送至靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜(Orbitrap)中獲取精確質(zhì)量數(shù)，同時運用高能誘導裂解(HCD)技術(shù)，由HCD 裂解池碎裂后獲得豐富的碎片離子信息。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、二級質(zhì)譜圖相關性等在篩査的同時，實現(xiàn)高靈敏度的定性確證及定量。近年來四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法在保健食品中非法添加成分測定方面的應用逐漸增加[16-19]，已有研究者將其應用于磷酸二酯酶抑制劑測定的報道[20]。

本工作采用液相色譜-四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法(LC-Q-Orbitrap)，建立了同時測定保健食品中11種磷酸二酯酶抑制劑的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive型靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，配Transcent 1250型液相色譜儀；Millipore MILLI-Q型純水器；CR22GⅢ型高速離心機。

11 種磷酸二酯酶抑制劑標準儲備溶液:0.100 g·L－1，分別移取適量的伐地那非、那紅地那非、紅地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非的標準品，用甲醇稀釋而成。

11 種磷酸二酯酶抑制劑混合標準溶液:1.00 mg·L－1，分別移取適量的0.100 g·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑標準儲備溶液，用50%(體積分數(shù)，下同)甲醇溶液稀釋混合而成。

甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純；伐地那非標準品、那紅地那非標準品、紅地那非標準品、羥基豪莫西地那非標準品、西地那非標準品、豪莫西地那非標準品、氨基他達拉非標準品、他達拉非標準品、硫代艾地那非標準品、偽伐地那非標準品、那莫西地那非標準品的純度依次為99.3%，98.3%，99.6%，99.9%，99.9%，99.6%，99.9%，99.5%，99.5%，99.7%，99.9%；試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm)，柱溫30 ℃；進樣體積10μL；流量0.3 m L·min－1。流動相:A 為0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.0 min時，B為2%；1.0～18.0 min時，B由2%升至100%，保持5.0 min；23.0～25.0 min時，B由100%降至2%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式(ESI＋)；毛細管電壓3 500 V；離子傳輸管溫度280 ℃，溶劑蒸發(fā)器溫度300 ℃；全掃描分辨率70 000，自動觸發(fā)二級質(zhì)譜分辨率17 500；一級質(zhì)譜駐留時間100 ms，二級質(zhì)譜駐留時間50 ms；掃描質(zhì)荷比(m/z)120～750；二級質(zhì)譜采用自動觸發(fā)方式產(chǎn)生碎片離子，碰撞裂解氣為高純氮氣。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3 試驗方法

稱取粉碎后的保健食品固體樣品2.00 g 于50 m L的離心管中，加入50 m L的50%甲醇溶液。

移取保健食品液體樣品10 m L，加入40 m L的50%甲醇溶液。

上述混合物渦旋混勻后，超聲提取15 min，溶液用水定容至50.0 m L，離心后，取上清液，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾后，按儀器工作條件進行測定。

如果保健食品樣品中某成分檢出量超過標準曲線的線性范圍，需要進行適當稀釋，重新分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

50μg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標準溶液的色譜圖見圖1。

2.2 提取溶劑的選擇

樣品的提取溶劑有水、甲醇、乙腈和乙醇等。根據(jù)11種磷酸二酯酶抑制劑的物理溶解性質(zhì)，采用水和有機溶劑的混合溶液作為提取溶劑。試驗考察了甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水等3種提取溶劑對11種磷酸二酯酶抑制劑回收率的影響。結(jié)果表明:以甲醇-水作為提取溶劑時，11種磷酸二酯酶抑制劑的回收率相對較高。試驗選擇提取溶劑為50%甲醇溶液。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

1.00 mg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標準溶液通過流動注射直接注入質(zhì)譜儀，電離方式優(yōu)化表明11種磷酸二酯酶抑制劑在電噴霧正離子模式下靈敏度最高。采集11種磷酸二酯酶抑制劑母離子的精確質(zhì)量數(shù)(見表1)。每種磷酸二酯酶抑制劑的理論精確質(zhì)量數(shù)與實測精確質(zhì)量數(shù)相對誤差的絕對值都小于5×10－4%，靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜可以提供高的可信度。優(yōu)化碰撞能量，獲得二級碎片信息，各種磷酸二酯酶抑制劑的多個子離子精確質(zhì)量數(shù)見表1。子離子精確質(zhì)量數(shù)的比對提高了測定結(jié)果的可靠性。進一步優(yōu)化離子源霧化條件，獲得最佳的靈敏度。試驗選擇的質(zhì)譜條件見1.2節(jié)。

2.4 色譜條件的選擇

超高壓液相色譜(UPLC)柱由于粒徑小，可以在低流量獲得較高的柱效，因此試驗采用100 mm的UPLC柱進行優(yōu)化。磷酸二酯酶抑制劑的極性差別較大，試驗對比了Waters HSS T3、Shield RP C18和BEH C18等3種色譜柱，由于Waters HSS T3色譜柱提升了極性化合物的保留，并且可以耐受高比例的水相和流動相，在低p H 下色譜柱壽命較長，且Waters HSS T3色譜柱的分離度優(yōu)于其他兩種色譜柱。因此，試驗選用Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm)。

圖1 混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

流動相的組成對峰形、靈敏度及分離度有較大的影響。試驗分別以乙腈和甲醇作為強洗脫溶劑，0.1%甲酸溶液、10 mmol·L－1乙酸銨溶液以及含0.02%甲酸的10 mmol·L－1乙酸銨溶液作為弱洗脫溶劑，互相組合進行試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在流動相中增加0.1%甲酸溶液能夠改善大部分目標物的峰形，且能提高靶標物質(zhì)的離子化效率，從而增強化合物的響應。試驗中部分化合物保留時間較長，考慮到乙腈比甲醇洗脫能力強，采用乙腈作為流動相進行洗脫。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，大部分磷酸二酯酶抑制劑峰形對稱，可實現(xiàn)基線分離。

表1(續(xù))

綜合考慮，試驗選擇0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相。

2.5 標準曲線和檢出限

采用50%甲醇溶液對1.00 mg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標準溶液進行稀釋，得到2，5，10，20，50，100μg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標準溶液系列。按儀器工作條件對上述混合標準溶液系列進行測定，并繪制標準曲線。結(jié)果表明:11種磷酸二酯酶抑制劑的質(zhì)量濃度均在2～100μg·L－1內(nèi)與其對應的峰面積呈線性關系，線性回歸方程和相關系數(shù)見表2。根據(jù)10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N)，結(jié)果見表2。

表2 線性回歸方程、相關系數(shù)和測定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and lower limits of determination

考慮樣品稀釋倍數(shù)，液體樣品測定下限為0.1～2.5μg·kg－1，固體樣品測定下限為0.5～12.5μg·kg－1。

2.6 精密度和回收試驗

按試驗方法對空白活力捷液樣品(樣品1)和空白鋅補晶粉樣品(樣品2)進行加標回收試驗，平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

由表3可知:回收率為75.7%～98.9%，RSD 為5.9%～14%。

2.7 樣品分析

按試驗方法對32個市售及電商平臺的保健食品樣品進行分析，其中1個電商平臺的瑪卡片樣品中西地那非的質(zhì)量分數(shù)為51.89 g·kg－1(提取液稀釋10 000倍)，其色譜圖和一級、二級高分辨質(zhì)譜圖見圖2。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6) %

圖2 樣品色譜圖和一級、二級高分辨質(zhì)譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample and primary as well as secondary high resolution mass spectra

由圖2可知:色譜保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)以及二級高分辨質(zhì)譜圖均與標準譜圖一致，進一步確認了西地那非在樣品中的存在。個別保健食品樣品中確實存在磷酸二酯酶抑制劑非法添加問題。

本工作采用液相色譜-四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定保健食品中11種磷酸二酯酶抑制劑的含量。高分辨質(zhì)譜法提供的精確質(zhì)量數(shù)信息提高了測定結(jié)果的可靠性。