劉方方，楊曉華，張楓琳，宋 敏，蘇 含，朱曉彤，束 剛，王麗娜，高 萍，江青艷，王松波

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院/廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣東 廣州 510642)

維持正常的腸道屏障功能對動物機體健康具有重要意義。腸道屏障功能的影響因素包括生理、病理、營養(yǎng)、應(yīng)激和環(huán)境等[1]，其中高脂飲食對機體腸道健康具有重要影響[2]。有研究表明，高脂飲食會對小鼠腸道黏膜屏障功能造成損傷，導(dǎo)致腸道形態(tài)與黏液層的破壞，腸道緊密連接蛋白的表達降低，腸道通透性增加，最終引起動物腹瀉[3]。此外，高脂飲食還可增加腸道上皮細胞中促炎因子TNFα 和IL-1β 的表達[4-8]。因此，通過營養(yǎng)調(diào)控提高動物機體腸道健康對于促進動物養(yǎng)殖提質(zhì)增效具有重要意義。

最近研究表明，多不飽和脂肪酸對動物腸道健康具有良好的促進作用[9-10]。其中魚油富含的長鏈n-3 多不飽和脂肪酸(n-3 Polyunsaturated fatty acid，n-3 PUFA)，如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)，是人和動物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[11]。魚油中含有豐富的n-3 PUFA，具有保護心臟、抗炎和降低甘油三酯的作用[12-13]。此外，n-3 PUFA 還有助于治療和預(yù)防肥胖，維持細胞正常生理功能，調(diào)節(jié)機體免疫功能[14]。目前有關(guān)魚油對機體的抗炎、保健功能研究相對較多，但其對高脂日糧(High-fat diet，HFD)造成的動物腸道損傷是否有改善作用尚不清楚。

本試驗以C57BL/6J 小鼠作為研究對象，研究日糧添加質(zhì)量分數(shù)為5%的魚油對高脂日糧飼喂小鼠腸道屏障功能的影響。研究旨在揭示魚油對高脂日糧導(dǎo)致的小鼠腸道屏障功能損傷的改善作用，為提高動物腸道屏障功能和腸道健康提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

選用36 只4 周齡C57BL/6J 雌性小鼠(購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，隨機分為對照組、高脂組和高脂+魚油組，每組12 只小鼠，分別飼喂基礎(chǔ)日糧、高脂日糧、高脂日糧添加質(zhì)量分數(shù)為5%的魚油(等能替換高脂日糧中脂肪)，小鼠日糧組成見表1。試驗持續(xù)21 周，每周測定小鼠采食量和體質(zhì)量，期間測定小鼠腸道通透性，收集小鼠糞便，測定粗脂肪含量和能值；采集小鼠血液，檢測血清中內(nèi)毒素水平；采集腸道組織，檢測小鼠腸道形態(tài)和杯狀細胞的數(shù)量，檢測腸道閉鎖小帶蛋白1 (Zonula， ZO-1)、閉合蛋白(Occludens-1，OCC)、緊密連接蛋白(Claudin-1)以及炎癥因子的表達。

1.2 材料和試劑

魚油由廣州市優(yōu)百特飼料科技有限公司贈送；內(nèi)毒素檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；熒光葡聚糖(FITC-Dextran) 購于美國Sigma 公司；β-actin 和ZO-1 抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；OCC 和Claudin-1 抗體購于美國Santa Cruz 公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 小鼠腸道通透性的檢測 將熒光葡聚糖粉末溶于75 mg/mL 磷酸鹽緩沖液(HBSS)，避光保存?zhèn)溆?。將小鼠固定，?00 mg/kg 體質(zhì)量的劑量對小鼠進行灌胃，4 h 后進行小鼠上頜采血100～150 μL，將血液避光室溫靜置30 min，4 ℃、3 000 r/min 離心取血清，然后根據(jù)等比稀釋做標準曲線，將血清和HBSS 緩沖液以1∶4 的體積比加入酶標板內(nèi)，測定D517 nm，計算血清中熒光葡聚糖的質(zhì)量濃度。

1.3.2 HE 染色和PAS 染色 剪取1 cm 左右的小鼠腸段，放在40 g/L 的多聚甲醛中固定24～36 h，脫水之后用石蠟進行包埋。然后切片(5 μm 厚)、貼片、烘片，酒精脫蠟，進行HE 染色[15]，在顯微鏡中觀察染色效果，并選3 個以上不同的視野，記錄每個視野里每根絨毛高度(lV)和隱窩深度(dC)，計算絨毛高度與隱窩深度比值(lV/dC)。

PAS 染色[16]樣品采集與保存同HE 染色，在顯微鏡中觀察染色效果，并選3 以上個不同的視野，記錄每個視野里每根絨毛上杯狀細胞的數(shù)量。

1.3.3 Western blot 檢測緊密連接蛋白表達 使用含1 mmol/L 蛋白酶抑制劑(Phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSF)的放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解小鼠空腸和回腸黏膜樣品，離心取上清，根據(jù)二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid， BCA)法測定蛋白濃度。取等量樣品，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene fluoride，PVDF)。50 g/L 脫脂奶粉室溫孵育膜2 h。然后取1 μL 的ZO-1、OCC、Claudin-1 和β-actin 等一抗，分別加入2 000、500、500 和5 000 μL 的緩沖溶液稀釋，進行膜孵育一抗，4 ℃條件下過夜。室溫孵育二抗90 min，電化學發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)顯色、曝光。保存圖片，利用Image J 軟件統(tǒng)計條帶灰度。

1.3.4 實時熒光定量PCR 檢測炎癥因子表達 提取小鼠空腸和回腸黏膜組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實時熒光定量PCR 檢測促炎因子IL-8、TNF-α、IL-6 和IL-1β 和抗炎因子IL-10 的mRNA表達。引物序列及產(chǎn)物長度見表2。

1.3.5 能量排出檢測 收集1 周內(nèi)小鼠排出的糞便，烘干、稱質(zhì)量，將糞便研磨粉碎，利用氧彈式測熱計C200 測定糞便的能值。1 周內(nèi)小鼠能量排出(kJ)=糞便能值(kJ/g)×糞便質(zhì)量(g)。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值和標準誤表示。利用SigmaPlot 12.5 軟件，采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)對各組均值之間的差異進行分析，采用Duncan’s 法進行多組數(shù)據(jù)之間的比較。

表 2 小鼠炎癥因子引物序列Table 2 Sequences for primers of mouse inflammation factors

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加魚油對小鼠生長性狀的影響

與對照組相比，高脂組的小鼠采食量顯著降低、體質(zhì)量顯著升高；與高脂組相比，高脂+魚油組的小鼠采食量顯著升高、體質(zhì)量顯著降低(P＜0.05)(圖1A、1B)。在能量攝入和排出方面，與高脂組相比，高脂+魚油組的小鼠能量攝入顯著升高、能量排出顯著減少(圖1C、1D)。同時，高脂+魚油顯著降低了糞便中粗脂肪的含量(圖1E)。

圖 1 日糧添加魚油對小鼠生長性狀的影響Fig. 1 Effect of dietary supplementation of fish oil on mouse growth

2.2 日糧添加魚油對小鼠腸道形態(tài)的影響

小鼠腸道HE 染色如圖2 所示，與對照組相比，高脂組腸道絨毛明顯變短，而添加魚油可改善高脂對絨毛造成的損傷。絨毛高度與隱窩深度比值(lV/dC)統(tǒng)計結(jié)果如圖3 所示，與對照組相比，高脂組空腸和回腸的lV/dC分別降低了13.8%和19.2%，差異顯著；與高脂組相比，高脂+魚油組空腸和回腸的lV/dC分別提高了43.1%和67.5%，差異顯著。

圖 2 日糧添加魚油對小鼠空腸和回腸絨毛形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of dietary supplementation of fish oil on the villus morphology of mouse jejunum and ileum

圖 3 日糧添加魚油對小鼠空腸和回腸的絨毛高度與隱窩深比值(lV/dC)的影響Fig. 3 Effect of dietary supplementation of fish oil on the ratio of villus length to crypt depth (lV/dC) in mouse jejunum and ileum

2.3 日糧添加魚油對小鼠腸道杯狀細胞數(shù)量的影響

PAS 染色結(jié)果如圖4 所示。與對照組相比，高脂組小鼠回腸杯狀細胞數(shù)量減少了14.2%，差異顯著；與高脂組相比，高脂+魚油組的杯狀細胞數(shù)量增加了16.7%，差異顯著(圖5)。

圖 4 小鼠回腸PAS 染色圖Fig. 4 PAS staining of mouse ileum

2.4 日糧添加魚油對小鼠腸道通透性的影響

如圖6 所示，與對照組相比，高脂組的小鼠血清中熒光葡聚糖和內(nèi)毒素質(zhì)量濃度分別升高了50.3%和82.0%，差異顯著；與高脂組相比，高脂+魚油組血清中熒光葡聚糖和內(nèi)毒素質(zhì)量濃度分別降低了34.3%和50.4%，差異顯著。以上結(jié)果表明，魚油可逆轉(zhuǎn)高脂導(dǎo)致的小鼠腸道通透性的增加。

2.5 日糧添加魚油對小鼠腸道緊密連接蛋白表達的影響

圖 5 日糧添加魚油對小鼠回腸杯狀細胞數(shù)量的影響Fig. 5 Effect of dietary supplementation of fish oil on goblet cell number in mouse ileum

如圖7 和圖8 所示，與對照組相比，高脂組小鼠空腸和回腸中緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1 和Occludin 的表達量顯著降低；與高脂組相比，高脂+魚油組空腸和回腸緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin 的表達量顯著升高。

2.6 日糧添加魚油對小鼠腸道炎癥因子表達的影響

如圖9 所示，與對照組相比，高脂組小鼠空腸中促炎因子IL-8 和IL-6 的mRNA 表達量顯著升高，抗炎因子IL-10 的mRNA 表達量顯著降低，回腸中促炎因子IL-8、IL-6 和IL-1β 的mRNA 表達量顯著升高。與高脂組相比，高脂+魚油組小鼠空腸和回腸中促炎因子IL-8、IL-6、IL-1β 的mRNA 表達量顯著降低，抗炎因子IL-10 mRNA 表達量顯著增加。

圖 6 日糧添加魚油對小鼠血清中熒光葡聚糖和內(nèi)毒素含量的影響Fig. 6 Effects of dietary supplementation of fish oil on fluorescent glucan and endotoxin contents in mouse serum

圖 7 小鼠空腸和回腸緊密連接蛋白的Western blot 檢測結(jié)果Fig. 7 Western blot results of tight junction proteins in mouse jejunum and ileum

圖 8 日糧添加魚油對小鼠空腸和回腸緊密連接蛋白表達的影響Fig. 8 Effect of dietary supplementation of fish oil on the expression of tight junction protein in mouse jejunum and ileum

圖 9 日糧添加魚油對小鼠空腸和回腸炎癥因子表達的影響Fig. 9 Effect of dietary supplementation of fish oil on the expression of inflammatory factor in mouse jejunum and ileum

3 討論與結(jié)論

3.1 日糧添加魚油對高脂飼喂小鼠的生長性能及營養(yǎng)物質(zhì)吸收的影響

有文獻報道，在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖試驗中，魚油可以顯著降低高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠肥胖效應(yīng)[17]。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與高脂組相比，日糧添加魚油能顯著降低高脂引起的小鼠體質(zhì)量的增加，同時能顯著提高小鼠的能量攝入、降低能量排出和糞便中粗脂肪的含量，提示魚油可促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。此外，魚油可在提高小鼠的能量攝入同時顯著降低體質(zhì)量，這可能與魚油促進動物運動和增加能量代謝有關(guān)。

3.2 日糧添加魚油對高脂飼喂小鼠腸道形態(tài)及黏膜屏障的影響

魚油主要成分為EPA 和DHA，可通過降低γ-干擾素(Interferon-γ， IFN-γ) 和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)的表達保護腸道屏障的完整性。有文獻報道，在高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠肥胖試驗中，高脂可導(dǎo)致腸道形態(tài)的破壞[4，18]。在本試驗中，HE 染色結(jié)果顯示，高脂日糧顯著降低腸道絨毛高度與隱窩深的比值(lV/dC)，而高脂日糧添加魚油能顯著提高腸道lV/dC。這與魚油能夠增加營養(yǎng)物質(zhì)吸收的結(jié)果是相一致的。此外有報道稱，高脂可導(dǎo)致小鼠腸道內(nèi)杯狀細胞數(shù)量減少、腸道黏液屏障損壞[19]。與該報道結(jié)果一致，本試驗研究發(fā)現(xiàn)高脂日糧能夠減少小鼠腸道杯狀細胞數(shù)量，而高脂+魚油組則較高脂組的腸絨毛上杯狀細胞的數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果提示，魚油能夠改善高脂導(dǎo)致的腸道絨毛形態(tài)與黏液屏障的損傷。

3.3 日糧添加魚油對高脂飼喂小鼠腸道通透性及緊密連接蛋白的影響

有報道指出，高脂與腸道通透性增加密切相關(guān)，高脂日糧可導(dǎo)致脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS) 在循環(huán)系統(tǒng)中增加，改變腸道通透性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂日糧顯著提高血清中熒光葡聚糖和內(nèi)毒素的水平，說明高脂增加了小鼠腸道的通透性。而高脂添加魚油可逆轉(zhuǎn)高脂導(dǎo)致的小鼠腸道通透性的增加。此外，與腸道通透性的結(jié)果相一致，我們的結(jié)果顯示，高脂日糧顯著降低緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 和Claudin-1 的表達，而高脂添加魚油能顯著增加緊密連接蛋白的表達。以上結(jié)果表明，魚油可緩解或改善由高脂引起的腸道緊密連接屏障的損傷。

3.4 日糧添加魚油對高脂飼喂小鼠腸道炎癥的影響

研究顯示，過多脂肪沉積可誘導(dǎo)腸腔內(nèi)LPS 水平升高，導(dǎo)致腸道微生態(tài)平衡失調(diào)，激活Toll 樣受體(Toll-like receptor 4，TLR4)和NOD 樣受體蛋白(Nucleotide binding oligomerization domain，NOD)炎癥信號通路[21]，引發(fā)動物腸道產(chǎn)生炎癥，改變腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加腸道通透性，進而影響腸道健康[22]。與基礎(chǔ)日糧相比，飼喂高脂日糧4 周以后，血清中的LPS 水平增加，進而引起全身性的炎癥反應(yīng)[23]。為了證實魚油是否能降低腸道炎癥反應(yīng)，本研究檢測了小鼠腸道中炎癥因子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂日糧可增強小鼠腸道中炎癥反應(yīng)，破壞屏障功能，而添加魚油則顯著降低促炎因子IL-8、IL-6 和IL-1β 的表達，增加抗炎因子IL-10 的表達，提示魚油可改善高脂造成的腸道炎癥反應(yīng)。

綜上所述，高脂日糧可導(dǎo)致小鼠腸道屏障功能損傷和腸道炎癥反應(yīng)，而高脂+魚油可改善高脂造成的屏障功能損傷，該過程可能與魚油降低腸道炎癥有關(guān)。以上研究結(jié)果揭示了魚油對高脂日糧導(dǎo)致的小鼠腸道屏障功能損傷的改善作用，為魚油在提高動物腸道屏障功能和腸道健康中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。