劉艷明，黃雅麗，李 婷，馮美茹，施文廣，鄧祖軍

(1 廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 廣州 510006； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

鐵皮石斛Dendrobium officinale 是隸屬于蘭科Orchidaceae 石斛屬Dendrobium 的多年生附生草本植物，為我國傳統(tǒng)名貴中藥[1]。鐵皮石斛入藥部分是其新鮮或干燥莖， 具有益胃生津、滋陰清熱的功效[1]。已有研究表明，鐵皮石斛的主要活性成分(如石斛多糖、生物堿等)具有降血糖、降血脂、降血壓、提高機(jī)體免疫力的作用，其在醫(yī)藥保健方面應(yīng)用越來越廣，需求量急劇上升[2]。但鐵皮石斛的種子極小、無胚乳， 自然條件下萌發(fā)率低，實(shí)生苗栽培較難，再加上人為過度采挖及生境破壞，野生鐵皮石斛資源已瀕臨滅絕[3]。目前鐵皮石斛主要來源于人工栽培，但人工栽培植株脫離原有生態(tài)環(huán)境， 藥材品質(zhì)與野生型存在一定的差異。汪群紅等[4]研究表明，野生鐵皮石斛莖中多糖含量和總氨基酸含量優(yōu)于人工栽培植株。而且人工種植過程中，鐵皮石斛較易受到微生物病害的侵染。由病原真菌膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 侵染所致的炭疽病是鐵皮石斛種植過程中的嚴(yán)重病害之一，它主要引起植株葉片圓形或類圓形凹陷性枯萎，可造成鐵皮石斛減產(chǎn)和品質(zhì)降低[5]。因此，如何提高人工栽培鐵皮石斛的藥材品質(zhì)以及有效防治種植過程中的炭疽病已成為鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)面臨的重要課題。

植物內(nèi)生菌是指在植物中度過全部或部分生命周期， 對宿主植物產(chǎn)生一定間接或直接作用，一般不引起植株病害的一類微生物， 主要包括真菌和細(xì)菌[6]。宿主植物可為內(nèi)生菌提供生存所需的環(huán)境、營養(yǎng)和能量等，同時內(nèi)生菌依靠自身的生命代謝活動對宿主植物產(chǎn)生影響[7]。已有大量研究表明內(nèi)生菌具有促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)宿主氮吸收、提高植物抗逆性及抗病性等作用[8]。也有研究結(jié)果表明藥用內(nèi)生真菌可以提高藥用植物的主要藥用活性成分，與其道地性的形成密切相關(guān)[9]。但目前對于野生型與人工栽培型鐵皮石斛內(nèi)生真菌的比較缺乏系統(tǒng)研究，而且關(guān)于內(nèi)生真菌對鐵皮石斛炭疽病的生物防治研究也鮮有涉及[10]。因此，本研究擬系統(tǒng)分析不同生境下鐵皮石斛(野生型和人工種植栽培型)內(nèi)生真菌多樣性，獲得其差異類群數(shù)據(jù)，并從中篩選具有對石斛炭疽菌具有抑制作用的活性菌株，從而為應(yīng)用內(nèi)生真菌于人工栽培鐵皮石斛品性改良及炭疽病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥用植株

野生鐵皮石斛(6 株)，采集自廣東省清遠(yuǎn)(23°20′49″N， 113°12′ 11″E)，其株高10～15 cm，生長狀態(tài)良好；人工栽培鐵皮石斛(6 株)采集自饒平鐵皮石斛人工種植基地(23°10′49″N，113°21′9″E)，株高20～35 cm，生長狀態(tài)良好。采樣時將整株植物挖出，用無菌塑料袋裝好，放入冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗室， 再置于4 ℃冰箱保存， 2 h 內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基購自于廣東環(huán)凱。T5×2 Premix(Tsingke)購自于廣東擎科生物；真菌基因組提取試劑盒(Magen)購自于上海玉博生物有限公司；引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)由華大基因合成。

1.3 試驗菌株

本研究使用的致植物炭疽病的炭疽菌為半知菌亞門Deuteromycotina 腔孢綱Coelomycetes 黑盤孢目Melanconiales 炭疽菌屬Colletotrichum 膠孢炭疽菌C. gloeosporioides， 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張桂芳老師提供。

1.4 內(nèi)生真菌的分離和純化

參考文獻(xiàn)[11]的方法對鐵皮石斛植株進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離與純化：用自來水沖洗掉鐵皮石斛植株上的泥土后，將其根、莖、葉剪切成約2 cm的小段， 依次浸泡在體積分?jǐn)?shù)為75% 的乙醇溶液2 min， NaClO 溶液(10.91～ 65.45 g/L)5 min，無菌水沖洗3 遍或以上， 晾干后將其剪成約0.5 cm×0.5 cm 的小片置于PDA 平板上， 28 ℃條件下培養(yǎng)2～4 周。待菌絲從組織塊切口處長出， 挑出菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板上，2～3 次純化后保存。同時收集表面消毒時最后1 次沖洗樣品的水樣，進(jìn)行消毒效果的檢測。

1.5 內(nèi)生真菌的鑒定

采用載玻片法[11]培養(yǎng)真菌， 在顯微鏡下觀察真菌的菌絲、孢子及子實(shí)體結(jié)構(gòu)， 同時結(jié)合其菌落特征進(jìn)行分類。應(yīng)用真菌基因組DNA kit(Magen)完成真菌DNA 提取工作。以提取的內(nèi)生真菌DNA為模板，擴(kuò)增rRNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因(Internal transcribed spacer regions of ribosomal DNA， rDNAITS)；10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳(80 V，30 min)鑒定PCR 產(chǎn)物后，送上海美吉生物有限公司測序，最后將測序序列在Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中比對。

1.6 鐵皮石斛內(nèi)生真菌抗膠孢炭疽菌活性的篩選

采用平板對峙法將膠孢炭疽菌和內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接到PDA 板上，28 ℃條件下活化培養(yǎng)，7 d 后用打孔器獲取0.5 cm×0.5 cm 的菌餅；以單接膠孢炭疽菌菌餅的PDA 板為對照組，3 次重復(fù)；試驗組中內(nèi)生真菌菌餅和膠孢炭疽菌菌餅接種在同一PDA 板上，2 個菌餅中心連線過PDA 板中點(diǎn)，間距為5.5 cm，每種拮抗菌做3 次重復(fù)；所有菌株在28 ℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)，每天觀察菌株生長情況；在第7 天測量對照組膠孢炭疽菌生長半徑和試驗組膠孢炭疽菌指向內(nèi)生真菌方向的菌株半徑。按下列公式計算內(nèi)生真菌對膠孢炭疽菌的抑菌率：抑菌率= (病原菌對照菌落半徑-病原菌指向拮抗菌半徑) /病原菌對照菌落半徑× 100%。

1.7 數(shù)據(jù)處理

參考文獻(xiàn)[11]的方法對野生和人工種植鐵皮石斛內(nèi)生真菌的定殖率 (Colonization rate， CR)、分離率(Isolation frequency， IF)、相對分離頻率(Relative frequency， RF)、Shannon-Wiener 多樣性指數(shù) (H')、均勻度指數(shù) (E)、相似性指數(shù) (C) 進(jìn)行計算及分析。采用Excel、SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計，利用Duncan’s 法分析鐵皮石斛不同部位的定殖率、分離率、多樣性指數(shù)等是否存在差異， 采用t 檢驗分析不同生境下的數(shù)據(jù)是否存在差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生與人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離

將最后一遍沖洗石斛樣品的水樣涂布PDA 平板， 28 ℃條件下培養(yǎng)14 d 后無菌落生長。將從根、莖、葉分離出的內(nèi)生真菌各取5 株代表性真菌菌絲體進(jìn)行相同程序的表面消毒后置于PDA 平板上培養(yǎng)， 14 d 后未見真菌生長。以上結(jié)果表明， 表面消毒過程已將樣品表面的附生菌消除， 分離到的菌株來自于樣品內(nèi)部， 屬于鐵皮石斛內(nèi)生真菌。

如表1 所示，本研究從432 個鐵皮石斛組織塊中分離到236 株內(nèi)生真菌，其中132 株來自野生鐵皮石斛，104 株來自人工栽培鐵皮石斛。野生植株內(nèi)生真菌在莖中的定殖率最高(72.22%)，其次為根部(56.94%)，而葉的定殖率最低(22.22%)，各部位內(nèi)生真菌的分離率與定殖率呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律，分離率從高到低依次為莖 (86.11%)、根(68.06%)、葉(29.17%)。人工栽培植株內(nèi)生真菌在葉中的定殖率最高(50.00%)，其次為莖部(43.06%)，而根的定殖率最低(25.00%)，各部位內(nèi)生真菌的分離率從高到低依次為葉 (55.56%)、莖 (55.56%)、根(33.33%)。野生樣品內(nèi)生真菌總定殖率和總分離率均高于人工栽培植株，具體到部位，野生型植株內(nèi)生真菌的根、莖的定殖率和分離率顯著高于人工栽培植株，而葉部則相反，人工栽培植株葉部內(nèi)生真菌的定殖率和分離率顯著高于野生型。

表 1 鐵皮石斛內(nèi)生真菌的定殖率和分離率1)Table 1 The colonization rate and isolation rate of endophytic fungi in Dendrobium officinale

2.2 野生與人工種植鐵皮石斛內(nèi)生真菌的類群結(jié)構(gòu)

本研究從野生和人工栽培鐵皮石斛中共分離到236 株內(nèi)生真菌，先利用菌落形態(tài)、孢子及子實(shí)體結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行分類，然后從各類中挑出1～4 株典型菌株進(jìn)行分子鑒定，綜合分析結(jié)果顯示，它們分屬于30 個屬，具體列于表2。

表 2 代表性鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分子鑒定Table 2 Molecular identification of representative endophytic fungi from Dendrobium officinale

續(xù)表 2 Continued table 2

如表3 所示，野生植株中共分離到132 株菌，屬于24 個屬，其優(yōu)勢類群為硬孔菌屬Rigidoporus(12.88%)、顯革菌屬Phanerochaete(10.61%)、短梗霉屬Aureobasidium(9.85%)、栓菌屬Trametes(9.09%)、裂褶菌屬Schizophyllum(8.33%)、炭疽菌屬(6.82%)、青霉屬P e n i c i l l i u m(4.5 5%) 和蠟孔菌屬Ceriporia(4.55%)。野生鐵皮石斛各部位內(nèi)生真菌類群分布存在明顯的差異：根部內(nèi)生真菌屬于18 個屬，其優(yōu)勢類群為裂褶菌屬(16.33%)、硬孔菌屬(14.29%)、短梗霉屬(10.20%)、栓菌屬(10.20%)、蠟孔菌屬(8.16%)、顯革菌屬(6.12%)、蟻巢傘屬Termitomyces(6.12%)、隔孢伏革屬Peniophora(6.13%)；莖部分離到19 個屬，其優(yōu)勢類群為硬孔菌屬(12.90%)、顯革菌屬(12.90%)、炭疽菌屬(12.90%)、短梗霉屬(8.07%)、擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis(6.45%)、栓菌屬(6.45%)；葉部共分離到11 個屬，優(yōu)勢菌群為短梗霉屬(14.29%)、顯革菌屬(14.29%)、栓菌屬(14.29%)、子囊菌屬Ascomycota(14.29%)、硬孔菌屬(9.52%)、青霉屬(9.52%)。硬孔菌屬、短梗霉屬、顯革菌屬和栓菌屬這4 個屬在根、莖、葉均為優(yōu)勢菌屬，隔孢伏革屬、擬層孔菌屬、酵母屬M(fèi)eyerozyma 和Subulicystidium只在根中分布，而伏革菌屬Phlebiopsis、曲霉屬Aspergillus、莖點(diǎn)霉屬Phoma 和淺黃囊孔屬Flavodon 只在莖中分布，間座殼屬Diaporthe 只在葉中有分布。

從人工栽培樣品根、莖、葉中總共分離到104 株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定歸為16 個屬(表3)，其優(yōu)勢類群為鐮刀菌屬(21.14%)、青霉屬(11.54%)、木霉屬Trichoderma(11.54%)、曲霉屬(9.62%)、耙齒菌屬(9.62%)。人工植株各部位的內(nèi)生真菌類群結(jié)構(gòu)也存在較大的差異：根部內(nèi)生真菌分屬于8 個屬，其優(yōu)勢類群為木霉屬(25.01%)、曲霉屬(16.67%)、青霉屬(16.67%)；莖部內(nèi)生真菌分為10 個屬，優(yōu)勢類群為鐮刀菌屬(45.00%)、耙齒菌屬(15.00%)；葉中共分離到12 個屬，優(yōu)勢菌屬為青霉屬(15.00%)、鐮刀菌屬(10.00%)、曲霉屬(10.00%)、木霉屬(10.00%)、耙齒菌屬(10.00%)、顯革菌屬(10.00%)和Grammothele

(10.00%)。曲霉屬、青霉屬、木霉屬、踝節(jié)菌屬Talaromyces 在根、莖、葉均有分布；鐮刀菌屬、耙齒均屬、顯革菌屬只分布在莖、葉部；栓菌屬、裂褶菌屬、隔孢伏革屬只分布在根和葉部；硬孔菌屬只在根部分布；新梭孢屬Neofusicoccum、赤霉菌屬、Pilatoporus 只在莖部分布；Grammothele、炭疽菌屬只在葉部分布。

表 3 鐵皮石斛根、莖、葉中內(nèi)生真菌不同屬的占比Table 3 Genus proportions of endophytic fungi in roots, stems and leaves of Dendrobium officinale %

2.3 鐵皮石斛不同部位內(nèi)生真菌的多樣性和相似性比較

由表4 可知，野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)(H′)為2.95，根、莖、葉的內(nèi)生真菌H′分別為2.70、2.82、2.28，莖中內(nèi)生真菌多樣性最高；根、莖、葉的均勻度指數(shù)(E) 分別為0.92、0.94、0.95，統(tǒng)計無顯著差異，3 個部位內(nèi)生真菌類群分布均勻。野生植株中莖與根相似性最高(C莖-根=0.72)，其次是莖與葉的相似性(C葉-莖=0.65)，根與葉的相似性最低(C根-葉=0.60)；根據(jù)Jaccard 相似性系數(shù)原理判斷標(biāo)準(zhǔn)，野生鐵皮石斛根、莖、葉3 個部位兩兩之間的內(nèi)生真菌類群組成均為中等相似。人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生真菌的H′為2.49，根、莖、葉的內(nèi)生真菌H′分別為1.98、1.84、2.42；根、莖、葉的E 分別為0.95、0.80、0.97，說明葉中的內(nèi)生真菌多樣性最高，且類群最均勻，莖中多樣性指數(shù)最低，且類群最不均勻；人工栽培植株中根與葉相似性最高(C根-葉=0.70)，其次是莖與葉的相似性(C葉-莖=0.64)，根與莖的相似性最低(C根-莖=0.44)；根據(jù)Jaccard 相似性系數(shù)原理判斷標(biāo)準(zhǔn)，人工栽培鐵皮石斛植株內(nèi)生真菌類群在根葉和莖葉中均為中度相似，根莖中為中度不相似。

表 4 鐵皮石斛根、莖、葉中內(nèi)生真菌的多樣性1)Table 4 The diversity of endophytic fungi in roots, stems and leaves of Dendrobium officinale

2.4 抗炭疽病活性菌株的篩選

圖1 為膠孢炭疽菌與鐵皮石斛內(nèi)生真菌共培養(yǎng)7 d 后的部分菌落形態(tài)。通過共培養(yǎng)試驗，從內(nèi)生真菌中篩選到34 株對膠孢炭疽菌具明顯拮抗效應(yīng)的菌株(表5)，它們對膠孢炭疽菌的抑制率均超過 50%。這34 株菌分屬于20 個屬，其中占比最高的是顯革菌屬(11.76%)，其次為裂褶菌屬(8.82%)和擬莖點(diǎn)霉屬(8.8 2%)。菌株F 1 0 2(蠟孔菌Ceriporia sp.)、F27(硬孔菌Rigidoporus sp.)、F103(蟻巢傘菌Termitomyces sp.) 和F122(伏革菌Peniophora sp.)對膠孢炭疽菌的抑制效果較好，其抑菌率分別達(dá)到93.06%、88.20%、87.48% 和84.57%。

圖 1 鐵皮石斛內(nèi)生真菌對膠孢炭疽菌生長的影響Fig. 1 The effects of fungal endophytes from Dendrobium officinale on the growth of Colletotrichum gloeosporioides

表 5 野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌對膠孢炭疽菌的抑制作用1)Table 5 Inhibitory effects of endophytic fungi of wild Dendrobium officinale on Colletotrichum gloeosporioides

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌的總體定殖率、分離率及多樣性指數(shù)均高于人工栽培植株。由于植物內(nèi)生菌主要來源于環(huán)境微生物，因而這可能是兩者的生境不同導(dǎo)致的：野生鐵皮石斛多生長在氣候濕潤、植被豐富的山地環(huán)境中，周邊及土壤中微生物多樣性豐富[12-13]，而大棚環(huán)境下的人工栽培植株的物種較為單一，栽培基質(zhì)經(jīng)過消毒等處理，因而其生長環(huán)境的微生物多樣性較低[14]。雖然野生型植株內(nèi)生真菌總體分離率和定殖率高于人工栽培型，但人工栽培植株葉部的內(nèi)生真菌分離率和定殖率卻高于野生型。與根、莖相比，植物葉部內(nèi)生真菌的重要來源是空氣微生物[15]，而且葉部表面積大，葉部內(nèi)生真菌豐度受周邊環(huán)境條件(濕度、溫度)影響更直接。人工栽培環(huán)境下植株水的噴灑量大，環(huán)境濕度和溫度更穩(wěn)定，從而導(dǎo)致人工栽培植物葉部被水?dāng)y帶的空氣真菌侵染的幾率更大，濕度和溫度也更利于真菌在葉部的繁殖，因而其分離率和定殖率相對于野生型更高。也有研究發(fā)現(xiàn)人工栽培植株和野生型植株葉部的化學(xué)成分(多糖、氨基酸和生物堿)存在一定差異，這些差異成分也可能有利于內(nèi)生真菌在其體內(nèi)的定殖[4-16]。有研究表明，道地藥材在其特定生境中形成的內(nèi)生菌群可以通過影響宿主植物藥用活性物質(zhì)的合成，從而參與到藥材道地性的形成過程[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型鐵皮石斛內(nèi)生真菌類群結(jié)構(gòu)與人工栽培植株具有較大的差異：野生植株的優(yōu)勢菌群為硬孔菌屬等，人工栽培植株的優(yōu)勢菌群為鐮刀菌屬等。隔孢伏革屬、擬層孔菌屬和酵母屬、Subulicystidium 只在野生鐵皮石斛根部分離到，伏革菌屬、曲霉屬、莖點(diǎn)霉屬、淺黃囊孔屬只在野生鐵皮石斛莖中分離到，間座殼屬只在野生鐵皮石斛葉中分離到。這些野生型鐵皮石斛與人工栽培植株內(nèi)生真菌類群的差異信息將為人工栽培鐵皮石斛的藥材品質(zhì)的改良提供前期基礎(chǔ)。

膠孢炭疽菌是引起珠三角地區(qū)人工栽培鐵皮石斛炭疽病的主要菌株[5]。目前對于棚栽區(qū)炭疽病主要采用化學(xué)農(nóng)藥等進(jìn)行防治[5]。化學(xué)農(nóng)藥雖然具有一定的防治效果，但病菌容易產(chǎn)生耐藥性，防治效果并不穩(wěn)定，而且還容易造成農(nóng)藥殘留，影響石斛的質(zhì)量，因此急需尋找新的安全有效的石斛炭疽病防治方法[18]。內(nèi)生真菌可與宿主植物形成緊密的共生關(guān)系，并對其產(chǎn)生持續(xù)、穩(wěn)定的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌可通過多種機(jī)制提高植物抵抗生物病害的能力，并已成功應(yīng)用到多種植物病害的防治研究中，如內(nèi)生菌Epicoccum nigrum ASU11 可降低馬鈴薯黑腐病的嚴(yán)重程度[19]，小麥根部內(nèi)生菌鏈霉菌Streptomyces sp. DEF 09 菌株可使小麥赤霉病嚴(yán)重程度降低60%[20]，因此內(nèi)生真菌在植物病害的生物防治中具有良好的應(yīng)用前景。本研究從鐵皮石斛中篩選到34 株具有拮抗炭疽菌的內(nèi)生真菌，它們對膠孢炭疽菌的抑制率均高于50%，其中菌株Ceriporia sp. F102、Rigidoporus sp. F27、Termitomyces sp.F103 和Peniophora sp. F122 的抑菌效果較好，其抑菌率分別為93.06%、88.20%、87.48%和84.57%。這些菌株將為鐵皮石斛炭疽病的生物防治提供潛在的生防菌資源，其在田間的生防效果有待后續(xù)進(jìn)一步研究。