符家武，吳昊，李君良，葉燁，陳婧，周海紅，李友

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東湛江市524001

腦卒中是我國發(fā)病率、致殘率、致死率和復(fù)發(fā)率較高的一種腦血管疾病，已成為我國國民死亡的主要原因[1-3]。卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中最常見的一種精神心理障礙并發(fā)癥，是抑郁障礙的特殊類型，在腦卒中患者中的發(fā)病率為25%～79%，其中缺血性腦卒中患者PSD 的發(fā)病率更高[4-5]。PSD 臨床表現(xiàn)主要為情緒低落和興趣缺失，嚴(yán)重者引起認(rèn)知功能障礙，影響患者神經(jīng)功能康復(fù)，降低患者生活質(zhì)量[6-7]。

PSD 具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。microRNA通過調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育信號通路和靶基因表達(dá)，參與神經(jīng)元的生成、塑形和突觸發(fā)育等過程，與神經(jīng)精神障礙等疾病密切相關(guān)[8-10]。魯豫等[11]發(fā)現(xiàn)，缺血性PSD患者外周血microRNA-137 表達(dá)水平降低。Zhao 等[12]發(fā)現(xiàn)，PSD 大鼠腦組織和外周血microRNA-137 表達(dá)低于正常對照組，過表達(dá)microRNA-137 可改善抑郁行為。本研究以廣東漢族人為對象，分析microRNA-137 基因內(nèi)含子區(qū)rs1625579 位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性PSD易感性的關(guān)系，并探討rs1625579 位點(diǎn)不同基因型與microRNA-137表達(dá)水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017 年1 月至2019 年1 月，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的初發(fā)急性缺血性腦卒中患者，均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議通過的缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱MRI 或CT 檢查確診；發(fā)病2 周后，17 項(xiàng)漢密爾頓抑郁量表評分≥8 分者納入患者組(n=250)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②發(fā)病至入院時間≤1周；③能獨(dú)立配合完成漢密爾頓抑郁量表評分。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)可能對患者產(chǎn)生消極影響的其他疾病，如惡性腫瘤、自身免疫性疾病、癲癇、出血性腦卒中、癡呆及甲狀腺功能減退等；②既往有原發(fā)性抑郁癥等精神疾病史。

選擇同期本院體檢中心體檢的健康人250 例為對照組。

所有研究對象均為廣東漢族人，相互間無血緣關(guān)系。兩組性別、年齡無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

本研究已經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因型檢測

采集空腹外周靜脈血2 ml，基因組抽提試劑盒(QIAGEN公司)提取基因組DNA。SNaPshot[13]檢測microRNA-137 基因內(nèi)含子區(qū)rs1625579 多態(tài)性位點(diǎn)基因型。

rs1625579 位點(diǎn)多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物序列：

上游5'-TTT AGT CAA CAT TTG CAT TTG GAA GC-3'；

下游5'-CAA CAG ATT CCA AAG GTC TCT AGT GTG C-3'。

1.2.2 外周血單個核細(xì)胞microRNA-137檢測

密度梯度離心和TRIzol法分別外周血單個核細(xì)胞及其總microRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將單個核細(xì)胞總microRNA 逆轉(zhuǎn)錄。SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR 儀檢測microRNA-137 相對表達(dá)量，以U6 為內(nèi)參。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μl，預(yù)變性94 ℃3 min，1 個循環(huán)；變性94 ℃15 s，退火、延伸和檢測熒光62 ℃40 s，共40個循環(huán)。

表1 兩組一般資料比較

U6引物序列：

上游5'-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3'；

下游5'-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3'。

每個樣本重復(fù)檢測3次，計算2-ΔΔCt值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。Hardy-Weinburg 平衡檢驗(yàn)遺傳平衡吻合度；等位基因和基因型分布組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計量資料以()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 等位基因和基因型分布

患者組(P=0.116)和對照組(P=0.379)microRNA-137 基因rs1625579 位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinburg 平衡。兩組間TT、GT 和GG 基因型分布有顯著性差異(P＜0.05)；TT 基因型是危險因素(OR=2.139，95%CI 1.272～3.595，P=0.004)；患者組T 等位基因頻率明顯高于對照組(OR=2.033，95%CI 1.255～3.294，P=0.003)。見表2。

2.2 microRNA-137表達(dá)

患者組microRNA-137 相對表達(dá)量為(0.68±0.32)，顯著低于對照組(1.71±0.48)(t=28.230，P＜0.001)。對照組中，TT 基因型microRNA-137 相對表達(dá)量(1.63±0.47)，顯著低于GT和GG基因型(1.92±0.52) (t=3.764，P＜0.001)。

3 討論

PSD 在腦卒中后1 個月內(nèi)、1～6 個月以及6 個月后，發(fā)病率分別約為33%、33%和34%[14-16]。PSD 臨床癥狀多樣，難以被早期識別，許多患者未能得到及時有效治療，延緩神經(jīng)功能恢復(fù)。

microRNA 是一種長度為19～23 個堿基的內(nèi)源性小RNA 分子，在調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平中發(fā)揮重要作用。microRNAs 廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與神經(jīng)細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡，神經(jīng)元遷移和突觸塑形等過程，與缺血性腦卒中、精神分裂癥和抑郁癥等神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)[17-18]。Smalheiser 等[19]發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦組織microRNA-137 表達(dá)水平降低。楊曉煜等[20]發(fā)現(xiàn)，缺血性PSD 大鼠外周血和腦組織microRNA-137 表達(dá)水平降低，可能通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸離子能谷氨酸受體2A 基因的表達(dá)參與缺血性PSD發(fā)病。

microRNA-137 位于1p21.3。Ripke 等[21]的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-137 基因rs1625579 位點(diǎn)多態(tài)性與精神分裂癥易感性相關(guān)。本研究以廣東漢族人為對象，首次分析microRNA-137 基因rs1625579 位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性PSD 易感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TT 基因型可能是缺血性PSD 易感的危險因素，可能因?yàn)門T基因型導(dǎo)致microRNA-137 表達(dá)下降。rs1625579 多態(tài)性影響microRNA-137 表達(dá)的具體機(jī)制，以及microRNA-137 異常表達(dá)參與缺血性PSD 發(fā)病機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。

本研究樣本量相對小，分析了microRNA-137 基因的rs1625579 位點(diǎn)，存在不足。進(jìn)一步研究可增加樣本量，并探討microRNA-137 基因其余位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性PSD 易感性的關(guān)系。PSD 在卒中后不同時期均可發(fā)病，本研究參考以往文獻(xiàn)，只選取發(fā)病2 周后發(fā)病的患者為研究對象。可收集卒中后不同時期并發(fā)抑郁癥的患者，做進(jìn)一步分析。

綜上所述，microRNA-137 基因內(nèi)含子區(qū)rs1625579 位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性PSD 易感性密切相關(guān)，TT 基因型可能通過下調(diào)microRNA-137 的表達(dá)，參與缺血性PSD的發(fā)病。

表2 兩組microRNA-137基因rs1625579位點(diǎn)基因型和等位基因分布

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。