元江箭竹花器官形態(tài)與解剖觀察及其敗育分析*

黃 玲 鄧 琳,2 初彩華 詹 卉 王曙光

(1.西南林業(yè)大學生命科學學院 昆明 650224； 2.畢節(jié)第三實驗高級中學 畢節(jié) 553100； 3.西南林業(yè)大學亞太林學院 昆明 650224)

中國是竹子種類最豐富、分布最廣的國家，有39屬500余種(江澤慧，2011)。而竹類植物一般花周期較長，其營養(yǎng)生長階段需經歷60年甚至更長的時間才會進入生殖生長，大多數竹種開花后，往往會發(fā)生大面積的干枯與死亡，結實率低，在經濟和生態(tài)上都會造成巨大的損失(Janzen，1976；林樹燕等，2018a)。竹類植物這種開花生理特性，不僅給竹類有性生殖和胚胎發(fā)育研究工作帶來困難，也極大地限制了竹類植物花器官的形態(tài)、分類與遺傳學等方面的研究(林樹燕等，2010)。

在植物有性繁殖過程中，花粉是種子植物的雄配子體，花粉與植物遺傳育種密切相關，花粉的生活力是分析植物育性及繁殖能力的重要指標，其生活力是由遺傳基礎決定的，同時也受環(huán)境條件的影響而變化(王欽麗等，2002)。由于竹子零星開花、傳粉的有效性低和花粉敗育等，導致結實率低，使得竹子在開花結實和花粉萌發(fā)方面的研究進展緩慢。因此，花粉生活力在竹類植物遺傳育種中尤為重要(林樹燕等，2008a；2008b)。

現代分子生物學觀點及已有研究表明，植物開花受自身基因的調控，其表達在一定程度上還受溫度、光照和水分等環(huán)境因子的影響(田波等，2005)。前人的研究認為除上述因素可能導致的敗育外，竹子開花還受營養(yǎng)元素的影響，由于糖分的不規(guī)則轉化，導致竹子在開花過程中因營養(yǎng)供應不足而引起敗育(徐振國等，2018)。因此，通過野外獲取幼嫩時期的尚未分化的花芽進行試管培養(yǎng)，通過培養(yǎng)基為其提供充足的碳水化合物，同時避免外源植物激素的干擾，使其在試管內發(fā)育成小穗并開花，分析在避免野外不良環(huán)境條件的影響下的胚胎發(fā)育狀況十分必要。

目前，對竹子開花現象已有較多相關報道，但對竹子花生殖器官和胚胎發(fā)育、花粉形態(tài)和萌發(fā)、小穗試管開花等方面研究相對較少，目前僅對10余種竹子花器官進行了詳細描述，如毛竹(Phyllostachysedulis)、雷竹(P.violascens)、麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)、巨龍竹(D.sinicus)、鵝毛竹(Shibataeachinensis)、異葉苦竹(Arundinariasimoniif.heterophylla)、月月竹(Chimonobambusaszechuanensis)、孝順竹(Bambusamultiplex)、青絲黃竹(B.eutuldoidesvar.viridi-vittata)、綿竹(B.intermedia)、霞早綠竹(B.oldhamii‘XiaZao’ZSX)、黃條金剛竹(Pleioblastuskongosanensisf.aureostriatus)、翠竹(Sasapygmaea)等(孫立方等，2012；袁曉亮，2007；鐘遠標等，2017；王曙光等，2006；唐國建等，2016；王雨珺等，2017；林樹燕，2009; 林樹燕等，2009; 2017; 2018a; 2018b; 2019)。元江箭竹(Fargesiayuanjiangensis)屬禾本科(Gramineae)箭竹屬(Fargesia)，產于云南省元江、石屏，灌木狀竹類(中國科學院中國植物志編輯委員會，1996)。目前已有彭晟等(2006)對元江箭竹花序的補充描述，以及何文志等(2017)對元江箭竹維管束及韌皮部纖維細胞發(fā)育過程的研究，但對元江箭竹花進行系統的胚胎學研究仍未有相關報道。通過對元江箭竹花序結構進行重新描述，并對其胚胎發(fā)育進行解剖學研究，測定花粉萌發(fā)力及對自然與組培條件下花器官、雌雄配子的結構解剖進行觀察和分析，為竹類胚胎學、分類學和遺傳育種積累原始資料，并為元江箭竹育種工作提供新的理論知識。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料于2018年7月15日上午采自西南林業(yè)大學珍稀竹種園內的元江箭竹。

1.2 花器官解剖觀察

采集元江箭竹不同發(fā)育時期的小穗，浸泡于50%FAA固定液中固定，并真空抽氣2 h待用。將采集到的小穗使用體式解剖鏡(Olympus HO11)進行結構解剖、測量和拍照。將解剖出來的花藥和子房，按李正理(1996)石蠟切片方法進行切片，利用番紅固綠染色，置于光學顯微鏡(Nikon-ECLIPSE400)下觀察并拍照。

1.3 組織培養(yǎng)

采取元江箭竹幼嫩尚未發(fā)育成熟的花芽作為外植體，連帶花枝剪下，用濕報紙包裹捆綁，防止外植體因失水而死亡。將采集到的外植體用自來水沖洗1～2 h后，在超凈工作臺內用2‰的HgCl2溶液消毒14 min，消毒后用無菌水清洗5次，接種于30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂、pH5.8的MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

1.4 花粉活力、萌發(fā)率測定

采集元江箭竹盛花期即將成熟而花藥未散粉的小穗，將收集到的小穗放置在干燥的硫酸紙上，陰干30～60 min，并人工收集花粉(王青等，2012)。

采用TTC染色法測定花粉活力。將收集到的花粉，置于凹面載玻片上，將配制好的TTC溶液滴加1～2滴，蓋上蓋玻片。染色5～10 min，每重復鏡檢3個視野，統計花粉總數和變紅色花粉數，并根據實驗公式(胡適宜，1993)進行計算：有生活力花粉百分數=變紅色的花粉數/花粉總數×100%。

采用離體萌發(fā)培養(yǎng)法測定花粉萌發(fā)率。采用正交試驗設計(蔗糖為50、100、150、200 g·L-1；硼酸為0.01、0.05、0.10、0.15 g·L-1)，將元江箭竹花粉灑在滴有營養(yǎng)液的凹面載玻片中央，置于25 ℃下培養(yǎng)，重復3次，顯微測量花粉粒的直徑、花粉管的長度，進行花粉萌發(fā)率計算(何風仙，2001；林樹燕等，2008b)。

2 結果與分析

2.1 花序的結構

元江箭竹莖稈節(jié)芽、花枝頂端和側芽節(jié)點可形成多個花序，在花序基部往往有1片葉鞘或帶有葉鞘的營養(yǎng)葉包裹著上部的幾枚小穗，幾枚小穗共同組成花序，單個小穗又由多個小花組成(圖1A、B)。當上部小穗發(fā)育成熟后，將營養(yǎng)葉剝開，花序基部有尚未發(fā)育成熟的小穗(圖1C)。元江箭竹花序可由主軸、側軸和小穗軸3部分組成，主軸上發(fā)生側軸，側軸上發(fā)生小穗軸，即花序屬于單軸分枝(圖1D)。竹子開花期間，整個花序中，中部和上部的小穗先開花，基部后開花。而在單個小穗中，基部小花先開放，上部小花后開放，頂端小花發(fā)育最晚甚至不育(圖1C、D)。小花發(fā)育成熟后，內外稃張開，花絲伸出懸掛于小花外，花絲細長呈白色，花藥為紫紅色或淡黃綠色，可能由于溫度差異所引起(圖1E)。

2.2 小穗及小花的形態(tài)結構

元江箭竹花枝上每個小穗具穎片2枚，著生于基部，先端急尖。每個小穗有4～5朵小花，相鄰小花間具明顯小穗梗，長0.3～0.6 cm，節(jié)部膨大，具白色絨毛(圖2A-C)。元江箭竹小花由稃片(內、外稃)、漿片、雌蕊和雄蕊4部分組成，為不完全花。小花均長0.9 cm，稃片2枚，外稃先端急尖，紫紅色，邊緣具硬毛。內稃對生于外稃內側，具芒，背部具2脊，邊緣具絨毛(圖2D)。各時期內稃背部張開程度不同，小花成熟時期，內稃張開，內稃邊緣呈淡紫色，花藥伸出。小花未成熟時期，外稃長于內稃，成熟時期，內、外稃近等長(圖2B、E)。漿片3枚，漿片位于雄蕊與內稃之間，1枚由內稃包被，另外2枚靠近外稃，較大。當雌、雄蕊發(fā)育未成熟時，漿片飽滿透明，隨著雌、雄蕊逐漸發(fā)育成熟，漿片變黃皺縮(圖2G、H)。開花時，漿片吸水膨大，外稃被撐開，花藥裸露垂懸于小花外，屬于開放型(圖2F; 圖1E)。雄蕊3枚，花藥黃色略帶暗紅色斑點，花藥基部著生于花絲頂端，屬于基著藥，其尖端呈2分叉，花藥成熟散粉時，花藥尖端呈淡紫色(圖2I)。雌蕊1枚，子房呈卵球形，柱頭2裂，呈羽毛狀，花柱短、柱頭長，屬于短花柱長柱頭型，為雌雄異位(圖2J)。雌蕊成熟后，子房表面具紋絡，顏色呈黃褐色(圖2K)。當小花發(fā)育成熟后，內外稃張開，柱頭和花藥同時伸出，雌雄蕊同熟(圖2L)。

圖1 元江箭竹花枝及花序

圖2 元江箭竹小花的形態(tài)

2.3 子房及花藥的解剖結構與發(fā)育

元江箭竹子房橫切，可見其胎座類型為側膜胎座(圖3A)。將雌蕊縱切，可見元江箭竹具1室單子房，倒生胚珠，雙珠被(圖3F)。在胚珠發(fā)育時期，可見珠心與薄壁細胞相似，之后靠近珠孔端內的珠心開始分裂(圖3B、C)。在胚囊母細胞時期，可見胚珠的雙珠被開始分化，之后形成孢原細胞(圖3D、E)。隨后雙珠被迅速伸長，胚囊母細胞經減數分裂最終形成4核胚囊(圖3F)。由此可見，元江箭竹雌蕊發(fā)育前期正常。由于其野外開花較少，材料有限，再加上試驗中出現的失誤，元江箭竹成熟的雌配子體解剖結構未能觀察到。

圖3 元江箭竹子房及花藥的形態(tài)及發(fā)育

通過對不同時期的花藥進行解剖發(fā)現，在次生造孢時期，藥隔組織將花藥隔開形成4個藥室，花藥壁由外向內依次為表皮層、藥室內壁(纖維層)、中層和絨氈層，同時造孢細胞分裂形成花粉母細胞(圖3I)。花粉母細胞經過前期的物質準備開始進行減數分裂，經減數第1次分裂形成二分體，二分體進行第2次減數分裂最終形成四分體，完成減數分裂的整個過程(圖3I-M)。四分體進一步發(fā)育形成4個獨立的單核小孢子，隨后單核小孢子體積逐漸變大，細胞質液泡化形成中央大液泡，將細胞核推向一側，即為單核靠邊期(圖3N、O)。單核小孢子進一步發(fā)育，其液泡消失，細胞質占據整個細胞，細胞核進行1次有絲分裂，形成二細胞型花粉粒(圖3P)。

小孢子母細胞時期，小孢子母細胞體積較大、近圓形，細胞質濃縮且沒有明顯的液泡產生(圖3H)。小孢子母細胞形成二分體時期，二分體細胞呈對稱型，同時其絨氈層開始出現退化，花粉成熟時，絨氈層細胞完全退化僅存薄層，元江箭竹的絨氈層細胞為腺質型(圖3Q)。由此可見，絨氈層提供養(yǎng)分主要從二分體時期開始至花粉粒成熟(圖3M、N)。當花藥成熟后，藥室內壁細胞木質化加厚形成間隔的纖維層，縱裂散粉(圖3R)。

2.4 花藥發(fā)育過程中的敗育

對元江箭竹花藥進行切片觀察，在其發(fā)育的過程中，主要有以下幾種敗育現象：1)在小花發(fā)育的過程中，其絨氈層細胞發(fā)育異常，在次生造孢時期，絨氈層細胞向內出現過度肥大生長，占據整個藥室，不能形成花粉母細胞(圖4A)。2)部分花藥壁出現皺縮，花藥壁內物質融合成一團或花粉粒收縮，在單個藥室內，部分中層和絨氈層退化，造孢細胞不能正常發(fā)育(圖4B)。3)不形成有效小孢子母細胞。在小孢子母細胞分裂期，花藥的維管束、藥壁和藥隔皆正常發(fā)育，小孢子母細胞退化或消失，部分小孢子母細胞發(fā)育異常(圖4C)。4)不能形成有效花粉，出現空殼花粉粒。小孢子具萌發(fā)孔，但不具細胞核與細胞質(圖4D)。

2.5 自然條件下花粉活力及萌發(fā)率分析

取元江箭竹成熟花粉在顯微鏡下觀察，取30個視野，觀察顏色和測量直徑。根據對照組觀察發(fā)現，元江箭竹花粉粒平均長47.48 μm、寬40.36 μm，形狀近球形，具1個圓形萌發(fā)孔，花粉粒呈黃褐色。用TTC染色法測定其活力，觀察發(fā)現部分花粉與TTC反應呈紅色，元江箭竹花粉活力為54.78%(圖5A、B)。

將元江箭竹成熟花粉分別置于配置好的16組營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，通過顯微鏡進行觀察，發(fā)現元江箭竹幾乎所有培養(yǎng)基培養(yǎng)的花粉粒均未形成花粉管，這說明元江箭竹盡管花粉粒活力達到54.78%，但絕大多數花粉粒不具備授粉能力，花粉萌發(fā)率極低，甚至不萌發(fā)(圖5C)。由于絕大多數花粉粒沒有長出花粉管，因此真正能進行正常授粉的花粉非常少。

圖4 各種發(fā)育異常的花藥

圖5 花粉萌發(fā)和TTC染色

2.6 組培條件下花藥結構與發(fā)育

取元江箭竹尚未分化花芽進行消毒后，接種于MS培養(yǎng)基中進行初代培養(yǎng)。當進行第1次繼代后，小穗完成分化并伸出苞片外(圖6A-C)。元江箭竹小穗進行第3次繼代培養(yǎng)時，小穗開始在試管內開花，花藥伸出小穗外(圖6D)。通過對成熟的花藥進行石蠟切片觀察，發(fā)現組培條件下成熟花藥的花藥壁發(fā)育正常，不發(fā)生皺縮現象，由外向內依次為表皮、藥室內壁和絨氈層，中層已經消失，絨氈層完全退化為一薄層，藥室內壁形成較厚且連續(xù)的纖維層，花藥縱裂，花粉粒被正常釋放(圖6E、F)。通過對其花粉粒進行顯微觀察，發(fā)現花粉粒發(fā)生敗育，或融合成一團，或不具細胞核和細胞質，或出現皺縮等現象(圖6G、H)。由此可知，元江箭竹花芽在組培條件下，雖然提供了充足的養(yǎng)分且能夠發(fā)育為正常的小穗，但仍未產生正常可育的花粉粒，這與野外條件下敗育現象一致。

圖6 試管內開花及其花藥結構

3 討論

3.1 元江箭竹花序

竹類植物花序是以小穗作為基本單位，小穗本身是一枚穗狀花序。根據李楊漢(1978)對花序的定義，將植物開花順序由頂端和中部先開花隨后向基部開花稱為有限花序，將花序中由基部向頂部依次開花稱為無限花序。而McClure等(1982)和耿伯介(1986)將竹類植物花序定義為有限花序(有限真花序)和無限花序(無限假花序)兩大類型，即有限花序的花序連續(xù)一次發(fā)生，小穗基部不具潛伏芽，無限花序具有無限制的次序發(fā)生，在營養(yǎng)枝上具潛伏芽，與李楊漢(1978)對花序的定義是不一致的。而根據林樹燕等(2018a)對霞早綠竹、黃條金剛竹、翠竹的研究發(fā)現，黃條金剛竹和翠竹基部不具潛伏芽但仍能分化出小穗，而霞早綠竹新形成的小穗是由前期分化的小穗基部產生，竹子中同一花序的小穗發(fā)育向基，同一小穗上的小花發(fā)育向頂，因此將竹類植物花序統稱為混合花序。元江箭竹整個花序也為有限花序，中部和上部的小穗先開花，隨后向基部側生小穗陸續(xù)開花，其開花順序具有限花序的特點。而單個小穗為總狀花序，即無限花序，由小穗基部的小花先開放，隨后再向頂部開放，其開花順序具無限花序的特點。元江箭竹同時具備了2種類型的花序，因此其花序為混合花序，支持了林樹燕等(2018a)認為竹類植物花序為混合花序的觀點。

3.2 元江箭竹花器官特性

竹類植物的花一般由稃片、漿片、雄蕊和雌蕊4部分組成。根據花的構造和開花特點，可將竹子小花分為開放型和閉合型2種(林樹燕等，2010)。元江箭竹為典型的開放型小花，開花時漿片吸水膨脹將內外稃片撐開，花藥伸出，風媒傳粉。

不同竹種雌雄蕊發(fā)育的同步化程度并不一致。林樹燕等(2012)對鵝毛竹開花現象進行研究觀察，發(fā)現鵝毛竹小花發(fā)育成熟時，花藥先伸出散粉枯萎后，少量的雌蕊柱頭才露出稃片。王曙光等(2006)觀察到巨龍竹花藥發(fā)育成熟伸出散粉時，雌蕊已萎縮干枯。這2種竹種均為雌雄異熟，但又不相同，鵝毛竹小花屬于雄蕊發(fā)育成熟早于雌蕊類型，而巨龍竹小花則為雌蕊發(fā)育早于雄蕊類型。元江箭竹小花發(fā)育成熟時，內、外稃張開，柱頭及花藥同時伸出，此現象與月月竹(林樹燕等，2009)小花發(fā)育雌、雄蕊同熟一致。

元江箭竹雌蕊花柱極短，而2叉分枝的羽毛狀柱頭極長，屬于典型的短花柱長柱頭型，與唐國建等(2016)報道的青絲黃竹柱頭一致。元江箭竹花絲細長，花藥成熟后花絲顯著伸長，使花藥垂懸于小花外，造成了雌、雄蕊空間位置的不一致，因此屬于典型的異花授粉。此外，鵝毛竹(林樹燕，2009)、月月竹(林樹燕等，2009)、車筒竹(Bambusasinospinosa)(Wangetal.，2015)、巨龍竹(王曙光等，2006)、青絲黃竹(唐國建等，2016)等多個竹種的小花，均屬于花絲細長引起雌、雄蕊異位并導致異花授粉這一類型。

3.3 元江箭竹的雄蕊敗育

野外觀察發(fā)現元江箭竹結實率極低，在整個開花期課題組沒有收集到1粒種子，這主要是雄蕊敗育造成的。在元江箭竹雄蕊發(fā)育過程中，可大量觀察到花粉粒敗育的現象，具體表現為4種類型：1)絨氈層細胞向內過度發(fā)育，未形成正常花粉粒；2)花藥室發(fā)生皺縮、藥室內物質融合成一團；3)花粉粒收縮變形、退化或消失；4)花粉粒細胞質、細胞核消失，花粉粒空殼。這些敗育現象在大多數的竹種中都會出現，如Wang等(2015)對龍竹(Dendrocalamusgiganteus)、慈竹(Bambusaemeiensis)和車筒竹的敗育進行研究，在龍竹中發(fā)現大部分花藥室皺縮、花粉融合成團，而在慈竹和車筒竹中發(fā)現空殼花粉粒及絨氈層過度發(fā)育等現象。林樹燕等(2012)發(fā)現鵝毛竹能正常發(fā)育的花粉數量很少，大部分小孢子發(fā)育異常甚至解體。除此之外，在月月竹(林樹燕等，2009)、青絲黃竹(唐國建等，2016)、綿竹(王雨珺等，2017)、霞早綠竹(林樹燕等，2019)中均有雄蕊敗育的報道。

根據劉巧紅等(2011)對不同發(fā)育時期甜菜(Betavulgaris)花粉TTC染色活力測定的研究發(fā)現，花粉中的脫氫酶可以將TTC還原成紅色，若花粉中的酶失活則不能被染色，花粉生命力衰退或部分喪失生活力則染色較淺或局部被染色。李曉芬等(2009)對紫竹(Phyllostachysnigra)的花粉生活力進行測定發(fā)現，紫竹花粉生活力極高，但花粉萌發(fā)率卻極低。而在麻竹和梁山慈竹(Dendrocalamusfarinosus)中也發(fā)現類似的現象，結實率低的原因與花粉的生活力無關(鐘遠標，2016)。元江箭竹花粉通過TTC染色顯示其活力達54.78%，但花粉萌發(fā)率極低，說明元江箭竹花粉發(fā)育不良，甚至不育，只開花而不結實。因此，在分析竹子花粉粒敗育時，僅僅依靠活力測定是不夠的，必須要結合花粉萌發(fā)率進行綜合分析。由于元江箭竹花粉粒皺縮、退化、消失或不具細胞質和細胞核等原因，加之開花竹叢少且為異花授粉，在自然條件下很難見到元江箭竹的果實。

3.4 組培條件下元江箭竹花芽發(fā)育及開花分析

Nadgauda等(1990)對印度箣竹(Bambusaarundinacea)組培條件下試管內開花研究發(fā)現，部分試管花外稃不能打開，花開不同步，致使結實率低，而且印度箣竹花藥開裂時間及時長受濕度、溫度及光照強度的影響。鐘遠標等(2017)認為，在麻竹開花后期由于植株體內消耗大量養(yǎng)分，會導致雌蕊的柱頭發(fā)育不良，加上難以散粉等，都會導致麻竹結實率下降。同樣是以麻竹為材料進行研究，發(fā)現麻竹在開花過程中，開花不育的原因之一是營養(yǎng)元素供應不足，由于竹子大量開花，加上營養(yǎng)元素的不規(guī)則轉化，消耗大量營養(yǎng)，導致竹子只開花不結實(徐振國等，2018)。因此，通過組培條件下培養(yǎng)元江箭竹花芽，為小穗的發(fā)育提供充足的碳水化合物，避免外源激素及不良環(huán)境條件的影響，對于探討元江箭竹花器官的發(fā)育狀況是十分必要的。

本研究選取尚未分化的花芽為外植體，通過組織培養(yǎng)的方法為元江箭竹花芽發(fā)育提供充足的養(yǎng)分，使其在試管內自發(fā)的分化并發(fā)育為正常的小穗，且在試管內正常開花。不同于印度箣竹(Nadgaudaetal.，1990)的是元江箭竹內外稃可以正常打開，花藥可以正常伸出小穗外，小穗及小花結構也發(fā)育正常，但其花藥依舊未形成正常的花粉粒。這種敗育現象暗示了元江箭竹花粉敗育可能并不是由于大量開花導致竹叢養(yǎng)分不足而造成的，具體導致元江箭竹花粉敗育的內在機理，尚需進一步研究。

4 結論

1)元江箭竹花序頂生或側生，單軸分枝，混合花序?；ㄐ蛴啥鄠€小穗和小花組成，整個花序上部及中部小穗先發(fā)育成熟，漸及基部。單個小穗基部小花優(yōu)先發(fā)育成熟，開花順序由基部漸及中部和上部。2)元江箭竹開花為雌雄異位，開放型，異花授粉?；ǚ刍盍﹄m高，但花粉萌發(fā)率極低，甚至完全不萌發(fā)，導致元江箭竹結實率下降。3)元江箭竹屬于典型的花藥敗育?；ǚ勰讣毎苓M行正常的減數分裂，少數形成二核花粉粒，但多數花藥無法形成具有受精能力的花粉粒，其花藥敗育可以總結為4種類型。4)花藥發(fā)育異常是導致元江箭竹敗育、結實率低的主要原因。通過組培手段提供充足的外源養(yǎng)分，未能提高元江箭竹花粉的可育性。