馮辰辰，閆謹，唐娜，才金玲

(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院 天津市海洋資源與化學(xué)重點實驗室，天津 300457)

微藻資源在社會生活和經(jīng)濟發(fā)展中具有廣泛的用途，但采收成本過高的問題限制了微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。因此尋找一種經(jīng)濟、高效、環(huán)保的采收技術(shù)變得十分重要。與重力沉降、過濾、離心和浮選相比，絮凝具有投資少、效率高、操作簡單、適用范圍廣等優(yōu)勢[2-3]，具有巨大的應(yīng)用和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本文使用硫酸鋁、氯化鐵、氫氧化鈉、殼聚糖和聚丙烯酰胺對小球藻進行了絮凝采收?？疾炝瞬煌跄齽舛葘π∏蛟宀墒招实挠绊懬闆r；測定了絮凝前后小球藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)和總脂的含量；并對培養(yǎng)基進行了回收利用。最終確定殼聚糖是采收小球藻的最佳絮凝劑。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

TGL-16M高速臺式冷凍離心機；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；UV-1800PC紫外可見光分光光度計；AL204電子天平；LGJ-25C型冷凍干燥機；78HW-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

小球藻接種到BG-11培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基初始pH值為7.0，121 ℃滅菌20 min后使用)[4]，初始吸光度值OD680 nm調(diào)整為0.20，在溫度為(25±1) ℃，光暗比為12 h∶12 h，光照強度為3 000 lx的條件下進行培養(yǎng)[5]。培養(yǎng)期間每天早晚搖瓶1次，以防止小球藻貼壁生長。

1.3 實驗方法

1.3.1 絮凝劑濃度的選擇 每種絮凝劑選擇6個濃度梯度。硫酸鋁濃度為0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06 g/L；氯化鐵濃度為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12 g/L；氫氧化鈉濃度為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 g/L；殼聚糖濃度為0.002,0.004,0.006,0.008,0.010,0.012 g/L；聚丙烯酰胺濃度為0.005,0.010,0.015,0.020,0.025,0.030 g/L。

1.3.2 絮凝效率的計算 取一定體積對數(shù)生長期的小球藻藻液倒至燒杯中，加入不同濃度的絮凝劑，在磁力攪拌器上攪拌2 min后靜置，每隔一段時間，取液面下4 cm處的藻液，測定其在680 nm波長處的吸光度值OD680 nm，根據(jù)下式計算絮凝效率(%)[6]。

R=(ODt0-ODt)/ODt0×100%

(1)

式中 ODt0——初始時刻藻液的吸光度值；

ODt——t時刻藻液的吸光度值。

1.3.3 絮凝前后小球藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)和總脂含量的測定

順豐冷運董事長William E.O’Brien曾在2018年4月發(fā)表的《新零售，新冷鏈》主題演講中指出，傳統(tǒng)的第三方冷鏈企業(yè)已死，因為它已經(jīng)滿足不了新零售和新的消費者需求。面對新零售、新需求，冷鏈行業(yè)發(fā)展需要有平臺，需要有數(shù)據(jù)，來構(gòu)建一體化的解決方案。順豐和夏暉的合作，是為了拿到夏暉的冷鏈解決方案，利用第三方物流、第四方物流、第五方物流，給客戶做出來端到端的解決方案。順豐和夏暉的合作之后，從原材料的供應(yīng)商、生產(chǎn)商、物流商、零售和終端消費者，新夏暉都實現(xiàn)了連接。

1.3.3.1 總碳水化合物含量的測定 采用蒽酮-硫酸法對總碳水化合物的含量進行測定[7]。準(zhǔn)確稱取1.0 g小球藻藻粉，與24 mL蒸餾水和16 mL 6 mol/L的HCl溶液混合，在100 ℃水浴中加熱1 h，使用6 mol/L的NaOH溶液將冷卻后的混合液調(diào)節(jié)至中性并過濾到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到總碳水化合物待測液。

取體積為1 mL的待測液，向其中加入5 mL蒽酮試劑混勻，置于沸水浴中10 min，冷卻至室溫。使用分光光度計在波長620 nm處測定待測液的吸光度值，通過葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中的總碳水化合物含量。

1.3.3.2 總蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍法對總蛋白質(zhì)的含量進行測定[8]。準(zhǔn)確稱取0.01 g小球藻藻粉，將其溶于1 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液中，在80 ℃水浴中加熱10 min，然后冷卻至室溫并加入9 mL超純水混勻，在10 000×g，4 ℃的條件下離心20 min以移去沉淀，最后得到的上清液即為總蛋白質(zhì)待測樣品(每個樣品重復(fù)處理提取3次)。

取1 mL待測樣品和4 mL考馬斯亮藍溶液置于10 mL干凈的試管中，混勻后在室溫下靜置2 min，在波長595 nm處測定待測樣品的吸光度值，通過蛋白質(zhì)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測樣品中總蛋白質(zhì)的含量。

1.3.3.3 總脂含量的測定 采用Bligh-Dyer法對總脂的含量進行測定[9]。準(zhǔn)確稱取0.1 g小球藻藻粉至50 mL離心管中，加入7.6 mL氯仿/甲醇/H2O混合液(1∶2∶0.8)，混合均勻后振蕩2 min，然后超聲提取5 min，接著在4 ℃，4 000 r/min的條件下離心20 min，將上層提取液倒入125 mL分液漏斗中，下層藻粉殘渣再抽提1次，合并2次上層提取液于125 mL分液漏斗中，向分液漏斗中加入4 mL氯仿，使氯仿/甲醇/水的比例為2∶2∶0．8，振蕩30 s，之后再加入4 mL水，使氯仿/甲醇/H2O的比例變?yōu)?∶2∶1.8，振蕩30 s，靜置2 h分層，將下面的氯仿層轉(zhuǎn)移到25 mL的圓底燒瓶中，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干至恒重，稱取蒸干前后蒸發(fā)瓶重量差，即為待測樣品的總脂質(zhì)量，進而可以計算出小球藻藻粉中總脂的含量。

1.3.4 培養(yǎng)基的回收利用 實驗結(jié)束后，對培養(yǎng)基進行過濾、回收，往其中補充小球藻生長所需的營養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)回收培養(yǎng)基的pH進行滅菌，滅菌完成后，接入新鮮的小球藻藻液進行培養(yǎng)，觀察小球藻在回收培養(yǎng)基中的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度絮凝劑對小球藻的絮凝效果

2.1.1 不同濃度硫酸鋁對小球藻的絮凝效果 硫酸鋁對小球藻的絮凝效果見圖1。

圖1 不同濃度硫酸鋁濃度對小球藻的絮凝效果Fig.1 Flocculation effect of different concentrations of aluminum sulfate on Chlorella sp.

由圖1可知，濃度為0.01 g/L時，硫酸鋁對小球藻的絮凝效果比較差，絮凝70 min后，絮凝效率仍不到30%；濃度增加為0.02 g/L時，絮凝70 min，硫酸鋁對小球藻的最大絮凝效率為50.6%；當(dāng)硫酸鋁濃度為0.03～0.06 g/L時，小球藻的絮凝速度很快，絮凝10 min，小球藻的絮凝效率達到70%以上。其中，絮凝10 min，0.05 g/L和0.06 g/L的硫酸鋁對小球藻的絮凝效率可以達到90%以上；絮凝進行70 min，絮凝效率達到最大值，分別為98.7%和99.2%。綜合考慮，選用0.05 g/L的硫酸鋁絮凝采收小球藻。

2.1.2 不同濃度氯化鐵對小球藻的絮凝效果 氯化鐵對小球藻的絮凝效果見圖2。

圖2 不同濃度氯化鐵對小球藻的絮凝效果

由圖2可知，氯化鐵對小球藻的絮凝效率隨著濃度的增加而增大。當(dāng)濃度為0.02～0.04 g/L時，氯化鐵對小球藻的絮凝效果一般，絮凝進行70 min，絮凝效率低于60%；當(dāng)氯化鐵濃度為0.06～0.08 g/L 時，絮凝70 min，小球藻的絮凝效率均在70%以上。其中，濃度為0.10 g/L和0.12 g/L的氯化鐵絮凝70 min后，絮凝效率達到最大值，分別為93.5%和94.2%。綜合考慮，選用0.10 g/L的氯化鐵對小球藻進行絮凝采收。

2.1.3 不同濃度氫氧化鈉對小球藻的絮凝效果 氫氧化鈉對小球藻的絮凝效果見圖3。

圖3 不同濃度氫氧化鈉對小球藻的絮凝效果Fig.3 Flocculation effect of different concentrations of sodium hydroxide on Chlorella sp.

由圖3可知，濃度小于0.2 g/L時，氫氧化鈉對小球藻的絮凝效果比較差，絮凝效率不到20%；當(dāng)濃度增加到0.3～0.6 g/L時，氫氧化鈉對小球藻絮凝效率有了大幅度的增長，絮凝效率可以達到60%以上；而當(dāng)氫氧化鈉的濃度為0.6 g/L時，僅需要30 min的時間，氫氧化鈉就可以絮凝90%以上的小球藻；絮凝進行100 min，0.6 g/L的氫氧化鈉對小球藻絮凝效率達到最大值，為98.3%。綜合考慮，選用0.6 g/L的氫氧化鈉絮凝采收小球藻。

2.1.4 不同濃度殼聚糖對小球藻的絮凝效果 殼聚糖對小球藻的絮凝效果見圖4。

圖4 不同濃度殼聚糖濃度對小球藻的絮凝效果Fig.4 Flocculation effect of different concentrations of chitosan on Chlorella sp.

由圖4可知，殼聚糖絮凝小球藻需要的時間比較短，所需的濃度也比較低。絮凝2 min后，各濃度殼聚糖對小球藻的絮凝效率便趨于穩(wěn)定，之后隨著絮凝時間的增加，絮凝效率不會有明顯的變化。絮凝12 min后，各濃度殼聚糖對小球藻的絮凝效率達到最大值。其中，濃度為0.002～0.004 g/L時，殼聚糖對小球藻的絮凝效果比較差，絮凝效率不到50%；當(dāng)濃度為0.004～0.012 g/L時，殼聚糖對小球藻的絮凝效率可以達到60%以上；其中，0.010 g/L和0.012 g/L的殼聚糖僅需2 min的時間就可以絮凝90%以上的小球藻；12 min后，絮凝效率達到最大值，分別為98.1%和98.8%。綜合考慮，選用濃度為0.010 g/L殼聚糖絮凝采收小球藻。

2.1.5 不同濃度聚丙烯酰胺對小球藻的絮凝效果 聚丙烯酰胺對小球藻的絮凝效果見圖5。

圖5 不同濃度聚丙烯酰胺濃度對小球藻的絮凝效果Fig.5 Flocculation effect of different concentrations of polyacrylamide on Chlorella sp.

由圖5可知，聚丙烯酰胺對小球藻具有比較好的絮凝效果。當(dāng)聚丙烯酰胺濃度為0.005 g/L時，小球藻的絮凝效率可以達到50%以上；當(dāng)濃度為0.010～0.030 g/L時，聚丙烯酰胺可以絮凝60%以上的小球藻；其中0.025 g/L和 0.030 g/L的聚丙烯酰胺僅需2 min，對小球藻的絮凝效率便可以達到90%以上，最終兩種濃度下聚丙烯酰胺對小球藻的絮凝效率分別為94.6%和95.3%。綜合考慮，選用濃度為0.025 g/L聚丙烯酰胺絮凝采收小球藻。

2.2 絮凝前后小球藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)和總脂含量的比較

絮凝劑對微藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)和總脂等物質(zhì)的影響情況是評價該絮凝劑能否推廣應(yīng)用的一個重要參考標(biāo)準(zhǔn)。5種絮凝劑絮凝前后小球藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)和總脂含量的比較見圖6。

圖6 物質(zhì)含量的比較Fig.6 The comparison of material contents

由圖6可知，硫酸鋁、氯化鐵、氫氧化鈉、殼聚糖和聚丙烯酰胺絮凝采收的小球藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)、總脂的含量與自然沉降收集的小球藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)、總脂的含量沒有顯著的差別。說明硫酸鋁、氯化鐵、氫氧化鈉、殼聚糖和聚丙烯酰胺在絮凝采收小球藻的過程中不會破壞小球藻的營養(yǎng)價值，方便了小球藻產(chǎn)品的后續(xù)加工和利用。

2.3 培養(yǎng)液回收利用情況

小球藻在回收培養(yǎng)液中的生長情況見圖7。

圖7 小球藻在回收培養(yǎng)液中的生長情況Fig.7 The growth of Chlorella sp.in recycled culture medium

由圖7可知，與新鮮培養(yǎng)基中的小球藻相比，小球藻在回收的培養(yǎng)液中可以正常生長，并且兩者的生長情況沒有顯著的區(qū)別。說明硫酸鋁、氯化鐵、氫氧化鈉、殼聚糖和聚丙烯酰胺作為絮凝劑采收小球藻，絮凝后產(chǎn)生的培養(yǎng)基可以回收利用，這既有利于生產(chǎn)成本的降低，又可以達到節(jié)約水資源、保護環(huán)境的效果。

2.4 絮凝成本的比較

在微藻采收過程中，絮凝劑的選擇，除了考慮絮凝效率外，還應(yīng)該考慮絮凝成本，這樣才能起到降低生產(chǎn)成本的目的。根據(jù)下式計算絮凝成本[10]，結(jié)果見表1。

絮凝成本(元/kg)=絮凝劑價格×絮凝劑劑量/藻液濃度×絮凝效率×1 000

(4)

表1 絮凝成本的比較
Table 1 The comparison of flocculation costs

絮凝劑劑量/(g·L-1)絮凝效率/%絮凝劑價格/(元·t-1)藻液濃度/(g·L-1)絮凝成本/(元·kg-1)硫酸鋁0.0598.74 0000.734 10.28氯化鐵0.1093.52 8000.734 10.41氫氧化鈉0.698.32 1000.734 11.75殼聚糖0.01098.150 0000.734 10.69聚丙烯酰胺0.02594.621 0000.734 10.72

由表1可知，與氫氧化鈉、殼聚糖和聚丙烯酰胺相比，硫酸鋁和氯化鐵需要的絮凝成本較低。但選擇硫酸鋁和氯化鐵作為絮凝劑，如果后期處理不當(dāng)，殘留的硫酸鋁和氯化鐵可能會對環(huán)境和收集的微藻造成污染，影響微藻產(chǎn)品的后續(xù)加工利用[11]；氫氧化鈉是通過調(diào)節(jié)藻液的pH引發(fā)藻細胞絮凝[12]，絮凝成本最高；并且氫氧化鈉自身及其溶液具有腐蝕性，在采收過程中存在安全隱患；殼聚糖和聚丙烯酰胺都屬于高分子絮凝劑，聚丙烯酰胺本身安全無毒，但其中未反應(yīng)的丙烯酰胺對人體具有毒性[13]；與硫酸鋁和氯化鐵相比，雖然殼聚糖的絮凝成本較高，但其具有安全環(huán)保、用量少、絮凝時間短、可生物降解等特點[14]，使用方便、安全，對小球藻產(chǎn)品的后續(xù)加工利用十分有利。因此，在所選擇的5種絮凝劑中，殼聚糖作絮凝劑具有更加良好的應(yīng)用前景，這Nayak等[12]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究實驗結(jié)果表明，硫酸鋁、氯化鐵和氫氧化鈉對小球藻具有良好的絮凝效果，絮凝效率都在90%以上，這與趙奎等[10]的研究結(jié)果一致；殼聚糖和聚丙烯酰胺同樣可以絮凝采收90%以上的小球藻，這與Wu等[15]的實驗結(jié)果相一致；絮凝前后小球藻細胞內(nèi)總碳水化合物、總蛋白質(zhì)和總脂含量沒有明顯的差別；絮凝后回收的培養(yǎng)液可以重復(fù)利用。綜合考慮，殼聚糖作為絮凝劑具有良好的應(yīng)用前景。