盧家仕 韋紹龍 黃素梅 韋弟 李朝生 龍盛風(fēng) 覃柳燕

摘要：【目的】采用ISSR分子標(biāo)記對13份廣西收集引進(jìn)和選育的香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為廣西香蕉品種改良及枯萎病抗性育種提供參考依據(jù)。【方法】從100條ISSR引物中篩選出多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用PoPgen 1.32計算遺傳多樣性指數(shù)，DICE法計算遺傳相似系數(shù)。利用非加權(quán)平均距離法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析?！窘Y(jié)果】共篩選出8條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，利用其從13份香蕉種質(zhì)材料中擴(kuò)增出234條條帶，平均每條引物擴(kuò)增出29.25條條帶，其中多態(tài)性條帶229條，多態(tài)性比率97.86%，平均觀察等位基因數(shù)（Na）1.9786、有效等位基因數(shù)（Ne）1.4023、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）0.2603、Neis基因多樣性指數(shù)（H?）0.4135。13份香蕉種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)為0.50～0.90，其中，巴貝多與GK1的遺傳相似系數(shù)最小，為0.50，抗枯1號與抗枯5號的遺傳相似系數(shù)最大，為0.90。在遺傳相似系數(shù)0.59處可將13份香蕉種質(zhì)資源聚成四大組，其中第Ⅱ組在相似系數(shù)0.74處被分為a和b亞組。在遺傳相似系數(shù)0.90處可將13份香蕉種質(zhì)材料完全區(qū)分開。【結(jié)論】廣西香蕉種質(zhì)資源的遺傳多樣性非常豐富。利用ISSR分子標(biāo)記可將遺傳背景及形態(tài)特征不同的香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行有效分類，可用于香蕉種質(zhì)資源分類、親緣關(guān)系鑒定及輔助育種等研究。

關(guān)鍵詞： 香蕉;種質(zhì)資源;ISSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;親緣關(guān)系;聚類分析

Abstract：【Objective】The genetic diversity and the genetic relationship among 13 accessions of introduced and bred banana germplasm resouces in Guangxi were analyzed by using molecule marker technique of inter-simple sequence repeat（ISSR） in order to provide references for banana variety improvement and breed of fusarium wilt resistant varieties in Guangxi. 【Method】The polymorphic primers were screened from 100 ISSR primers for PCR amplification. The genetic diversity index was calculated by PoPgen 1.32 soft and the genetic similarity coefficient was calculated by DICE method. Furthermore， the cluster analysis of different banana germplasm resources was analyzed by using unweighted pair-group method with arithmetic means（UPGMA）. 【Result】Eight ISSR primers，that could amplify stable and clear bands with fine polymorphism， were screened from 100 ISSR primers.The 234 bands in total were amplified from 13 accessions of banana germplasm resources， and each primer in average could amplify 29.25 bands. Of which， 229 amplified bands were present polymorphic and the polymorphism rate was 97.86 %. Through analysis of genetic diversity， the mean observed number of alleles（Na） was 1.9786， the effective number of alleless（Ne） was 1.4023，? the Shannons Information index（I） was 0.2603 and the Neis genetic diversity index（H） was 0.4135. The genetic similar coefficient among 13 accessions ranged from 0.50 to 0.90; the genetic similarity coefficient between Barbados and GK1 was the lowest with 0.50， and that of Kangku 1 and Kangku 5 was the highest with 0.90. The 13 accessions could be classified into four groups（I，II， III and IV） at the genetic similarity coefficient of 0.59， and the II group could be divided into two subgroups（a and b） at the similarity coefficient of 0.74. Meanwhile， 13 accessions could be completely distinguished at the genetic similarity coefficient of 0.90. 【Conclusion】The banana germplasm resources in Guangxi present very rich genetic diversity. The genetic background and the morphological difference can be effectively classified by using the ISSR molecular marker technique，which would be helpful for germplasm resources classification， identification of genetic relationship and banana assisted breeding.

0 引言

【研究意義】香蕉是芭蕉科芭蕉屬多年生草本植物，是熱帶亞熱帶地區(qū)的重要水果，栽培面積大，其產(chǎn)量較柑橘、葡萄和蘋果高，被譽(yù)為“世界果王”（許林兵，2006）。我國南部是香蕉原產(chǎn)地之一。香蕉栽培品種多數(shù)為三倍體，主要由兩個野生品種尖葉蕉（A基因組）與長梗蕉（B基因組）種內(nèi)或種間雜交、變異、進(jìn)化而成（秦獻(xiàn)泉等，2007;牟海飛等，2010）。根據(jù)植株形態(tài)特征和經(jīng)濟(jì)特性，我國主要食用香蕉可分為香牙蕉（AAA）、大蕉（ABB）、粉蕉（ABB）、龍牙蕉（AAB）和貢蕉（AA）等五大類（張展偉，2010）。由于植物性狀通常受環(huán)境因素和遺傳基因的影響導(dǎo)致品種特性發(fā)生改變，僅靠形態(tài)特征較難區(qū)分開來，不利于種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)利用。分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境條件和植物生長發(fā)育的影響，已被廣泛用于植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，為分子輔助育種提供技術(shù)支持。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)開展香蕉種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，探究其親緣關(guān)系，對香蕉種質(zhì)資源開發(fā)利用及抗病品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有大量利用分子標(biāo)記技術(shù)開展香蕉遺傳多樣性分析的研究報道。于曉英（2001）、譚衛(wèi)萍等（2010）利用AFLP分子標(biāo)記對香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。陳源等（2008）利用RAPD分子標(biāo)記對香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。李博等（2011）利用cqSSR分子標(biāo)記對香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。謝子四等（2012）、漆艷香等（2017）分別利用SRAP分子標(biāo)記對香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。孫嘉曼等（2016）、林丹鑾（2017）分別利用 SSR分子標(biāo)記對香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。以上分子標(biāo)記較穩(wěn)定、可靠、操作簡便，不受外部環(huán)境條件干擾，但存在一些缺點(diǎn)，如AFLP分子標(biāo)記需要高質(zhì)量的DNA模板及制膠技術(shù)，RAPD分子標(biāo)記重復(fù)性較差，SSR和cqSSR分子標(biāo)記的引物開發(fā)較因難，SRAP分子標(biāo)記則需要分別設(shè)計其正、反向引物再兩兩配對篩選引物，實(shí)驗操作較復(fù)雜。ISSR分子標(biāo)記克服了上述分子標(biāo)記的缺點(diǎn)，具有對DNA模板質(zhì)量要求低、引物設(shè)計容易、操作簡單、多態(tài)性好、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于對香蕉種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析研究，如劉紹欽等（2007）、牟海飛等（2010）分別利用ISSR分子標(biāo)記對廣東選育和國外引進(jìn)的香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，鮮見利用ISSR分子標(biāo)記對廣西收集引進(jìn)和選育的香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以廣西收集和選育的香蕉種質(zhì)資源為研究對象，采用ISSR分子標(biāo)記分析其遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為廣西香蕉枯萎病抗性育種及品種改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試香蕉種質(zhì)名稱及來源見表1。Taq DNA Polymerase、超純水和dNTPs購自生工生物工程（上海）股份有限公司;ISSR引物、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶異戊醇（24∶1）、2% β巰酯乙醇和其他生化試劑均購自國拓生物技術(shù)有限公司。主要儀器設(shè)備：Grant GR150水浴鍋（GR150-12，英國）、Bio Photometer RNA/DNA濃度電度測定儀（Eppendorf，德國）、Biometra TProfessional PCR儀（Tprofe，德國）、MixMate PBC-11 5353混勻儀（Eppendorf，德國）、MIKRO 220R 2205冷凍離心機(jī)（HETTICH，德國）、EN 61010-1電泳儀（Bio-Rad，美國）、DYCP-31DN型電泳槽（北京市六一儀器廠）和Firereader XS D-56-26.M凝膠成像系統(tǒng)（UVI，英國）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采集香蕉新鮮完全未展開心葉，參考改良的CTAB法（盧家仕等，2012）提取其基因組DNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

1. 2. 2 ISSR引物合成及篩選 利用加拿大哥倫比亞大學(xué)設(shè)計并公布的100條ISSR引物序列，由國拓生物技術(shù)有限公司合成。同時選取抗枯萎病品系GK1和主栽的感枯萎病品種桂蕉1號進(jìn)行引物初篩，從中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性好的引物用于后續(xù)試驗。

1. 2. 3 ISSR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 反應(yīng)體系20.0 μL：10×Buffer 2.0 ?L，10 mmol/L dNTPs 0.4 ?L，5 U/?L Taq DNA Polymerase 0.2 ?L，10-5 ?mol/?L引物1.0 ?L，40 ng/?L DNA模板1.5 ?L，超純水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 50 s，50～55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，共進(jìn)行38個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra TProfessional PCR儀上完成。擴(kuò)增產(chǎn)物加入3.5 uL含核酸染料的6×Loading Buffer充分混勻后取其10.0 ?L用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE，電壓110 V，電泳時間50 min，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察。

1. 3 統(tǒng)計分析

觀察ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，同一水平線上有條帶記為1，無條帶記為0，得到[0，1]矩陣，統(tǒng)計條帶數(shù)量。將[0，1]矩陣導(dǎo)入PoPgen 1.32計算多態(tài)性比率、觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）和Neis基因多樣性指數(shù)（H?）等遺傳多樣性指數(shù)。最后將[0，1]矩陣導(dǎo)入NTsys 2.10e，利用DICE法計算遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)平均距離法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

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（責(zé)任編輯 陳 燕）