結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全球其發(fā)病率及死亡率均位居第3位[1]。近幾十年中，中國(guó)結(jié)直腸癌的治療已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但是結(jié)直腸癌相關(guān)的死亡率并未顯著改善[2-4]。因此，探索具有診斷價(jià)值的腫瘤標(biāo)記物對(duì)于結(jié)直腸癌患者的早期診斷和預(yù)后至關(guān)重要。

驅(qū)動(dòng)蛋白家族（KIFs）是一類微管依賴的運(yùn)動(dòng)蛋白，主要負(fù)責(zé)微管穩(wěn)定、解聚、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞分裂[5]。自1985年首次證實(shí)以來(lái)，驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，包括14個(gè)超家族（超過(guò)40個(gè)成員）[6]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，驅(qū)動(dòng)蛋白在多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7-8]。KIF23是驅(qū)動(dòng)蛋白家族中的一員，其在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨架的改變和細(xì)胞分裂過(guò)程中紡錘體的形成均有重要作用[9-10]。KIF23在多種癌癥中過(guò)表達(dá)，但目前尚缺乏KIF23在結(jié)直腸癌中的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中KIF23在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)116例結(jié)直腸癌患者中KIF23的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2010年2月至2013年2月期間于河南大學(xué)淮河醫(yī)院行手術(shù)治療的116例結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本及臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）有完整臨床資料；2）術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌患者；3）術(shù)前未行放療、化療及內(nèi)分泌等治療；4）已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌患者；2）合并其他腫瘤病史。其中男性67例，女性49例。腫瘤分化程度：高分化3例，中分化86例，低分化27例。腫瘤位置：升結(jié)腸26例，橫結(jié)腸7例，降結(jié)腸4例，乙狀結(jié)腸23例，直腸56例。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第8版確定腫瘤TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 隨訪 通過(guò)門(mén)診或住院就診、電話、微信等方式隨訪，確診時(shí)間為起點(diǎn)，所有患者進(jìn)行5年隨訪，期間若有腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡則終止隨訪。

1.2.2 生物學(xué)分析 本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cancergenome.nih.gov/）下載所有可用的結(jié)直腸癌KIF23 mRNA數(shù)據(jù)表達(dá)譜，包括380例癌組織和51例癌旁正常組織，使用Excel 2019和GraphPad 6.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換和分析。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 結(jié)直腸癌組織中KIF23 蛋白表達(dá)的檢測(cè)嚴(yán)格按照SP 免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將石蠟包埋的組織標(biāo)本行連續(xù)切片，厚度約4 μm，切片行二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水。切片置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8 min至沸，?；? min 保溫再轉(zhuǎn)中低火7 min，3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min，血清封閉30 min 后，加入KIF23 抗體（克隆號(hào)：Q02241，1：100，美國(guó)Cusabio 公司）4℃過(guò)夜。第2天PBS 沖洗3次后加入相應(yīng)種屬二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水，透明，中性樹(shù)脂封片。

1.2.4 結(jié)果判定 病理結(jié)果由本院兩名資深病理科主任醫(yī)師分別閱片完成。切片中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒狀物質(zhì)為陽(yáng)性，染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：0分，不著色；1分，淡黃色（弱陽(yáng)性）；2分，棕黃色（中陽(yáng)性）；3分，棕褐色（強(qiáng)陽(yáng)性）。腫瘤細(xì)胞比例：0分：無(wú)陽(yáng)性結(jié)果；1分：＜25%的陽(yáng)性結(jié)果；2分：25%～50%的陽(yáng)性結(jié)果；3分：50%～75%的陽(yáng)性結(jié)果；4分：≥75%的陽(yáng)性結(jié)果。將陽(yáng)性結(jié)果的百分比和染色強(qiáng)度的得分相乘即為最終染色指數(shù)（SI）：0～1分為陰性表達(dá)，2～3分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析KIF23表達(dá)與患者病理參數(shù)及預(yù)后相關(guān)性；生存曲線采用Kaplan-Meier 法繪制，Log-Rank 檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中KIF23 mRNA表達(dá)水平

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中KIF23的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，在配對(duì)組織（P＜0.001，圖1A）及非配對(duì)組織（P＜0.001，圖1B）中，KIF23在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。

2.2 KIF23在結(jié)直腸癌組織中的蛋白表達(dá)水平

采用免疫組織化學(xué)法分析KIF23在結(jié)直腸癌組織中的蛋白表達(dá)水平。KIF23 蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2），結(jié)直腸癌組織中KIF23 陽(yáng)性表達(dá)呈棕色或棕褐色。結(jié)果顯示，KIF23在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為61.2%（71/116），陰性或低表達(dá)率為38.8%（45/116）。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中KIF23在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)差異

2.3 結(jié)直腸癌中KIF23的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

如表1所示，結(jié)直腸癌中KIF23的表達(dá)與T、N、M及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和腫瘤位置無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

2.4 KIF23表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性

Kaplan-Meier 生存分析表明，KIF23 高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期相比低表達(dá)患者明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。Cox回歸分析結(jié)果顯示KIF23表達(dá)可作為影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表2，3）。

圖2 KIF23在結(jié)直腸癌組織中蛋白的表達(dá)情況

表1 KIF23表達(dá)與116例結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

表1 KIF23表達(dá)與116例結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系（續(xù)表1）

圖3 Kaplan-Meier分析KIF23表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

表2 單因素及Cox多因素分析各因素對(duì)結(jié)直腸癌患者總生存期的影響

表3 單因素及Cox多因素分析各因素對(duì)結(jié)直腸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期的影響

表3 單因素及Cox多因素分析各因素對(duì)結(jié)直腸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期的影響（續(xù)表3）

3 討論

作為驅(qū)動(dòng)蛋白家族的一員，KIF23 發(fā)揮“分子馬達(dá)”的作用[11]。KIF23 通過(guò)參與微管的聚合動(dòng)力學(xué)，在細(xì)胞周期內(nèi)催化MT細(xì)胞骨架的快速空間重塑，是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[12-13]。在有絲分裂過(guò)程中，KIF23 參與了中間體的形成，并通過(guò)招募參與細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)因子進(jìn)一步影響胞質(zhì)分裂過(guò)程[14]。KIF23的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致一系列問(wèn)題，其中包括紡錘體的分離增加、過(guò)早的姐妹染色單體分離，以及最終單極或雙極紡錘體的形成[15]。有絲分裂過(guò)程中姐妹染色體分離發(fā)生異常，導(dǎo)致染色體非整倍性和基因組的不穩(wěn)定，最終可能誘發(fā)腫瘤[16]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，KIF23在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，參與腫瘤的惡性進(jìn)展過(guò)程。KIF23過(guò)表達(dá)與ER陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，敲除KIF23可抑制他莫昔芬敏感和耐藥乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡[17]。有研究顯示，KIF23在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)上調(diào)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)[18]。在非小細(xì)胞肺癌中KIF23 高表達(dá)，沉默KIF23表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而改善患者預(yù)后[19]。本研究證實(shí)KIF23在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并且高表達(dá)KIF23 患者預(yù)后較差，與上述結(jié)論一致。通過(guò)分析KIF23表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，得出KIF23表達(dá)水平與T、N、M及TNM分期密切相關(guān)，提示其與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)Cox回歸分析說(shuō)明KIF23表達(dá)是影響結(jié)直腸癌患者總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示KIF23可能作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的分子標(biāo)記物。

既往研究表明，KIF23與影響腫瘤細(xì)胞分裂、染色體分離、增殖和轉(zhuǎn)移的多種癌基因的表達(dá)相關(guān)[18]。有研究發(fā)現(xiàn)沉默KIF23在體內(nèi)和體外均抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并且在轉(zhuǎn)錄水平上受TCF-4調(diào)控[20]。TCF-4是經(jīng)典Wnt/β-catenin/TCF 通路的核心組成部分[21]，其與細(xì)胞核中的β-catenin相互作用形成復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的增殖、分化、存活和凋亡。有研究表明，通過(guò)shRNA沉默KIF23調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過(guò)程可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展[22]。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的KIF23可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移以及細(xì)胞周期進(jìn)展。但是KIF23在腫瘤中作用的分子機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，KIF23高表達(dá)預(yù)示結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后，并參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此，監(jiān)測(cè)KIF23表達(dá)可能為結(jié)直腸癌的臨床診療及預(yù)后評(píng)估提供重要的參考價(jià)值。