miRNA-244與miRNA-328在膽管癌患者血清中的表達(dá)及意義*

楊自華，郭平學(xué)，王西輝，吳 娟，張峰偉

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（西安710038）

膽管癌是一類起源于肝內(nèi)或肝外膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率占肝膽腫瘤總發(fā)病率的10%～15%。膽管癌惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其易向肝動(dòng)脈或門靜脈侵襲［1］。由于診斷困難和手術(shù)治療預(yù)后較差的原因，近年來(lái)膽管癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著患者的生命［2］。目前，根治性切除手術(shù)是膽管癌患者得到治愈或長(zhǎng)期生存的唯一手段［3］。由于膽管癌在發(fā)病初期并無(wú)明顯癥狀，大多初診患者已失去根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。因此，有效診斷和評(píng)估膽管癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)指標(biāo)顯得尤為重要［4］。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一條具有20～25個(gè)核苷酸序列的內(nèi)源性非編碼RNA，可與特定m RNA 結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)［5］。miRNA 具有進(jìn)化保守的特性，在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。現(xiàn)有的研究顯示，某些miRNA 在腫瘤組織的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、分化、血管生成、遷移、代謝和侵襲過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。miRNA-244與miRNA-328 在腫瘤患者中的表達(dá)有變化，而關(guān)于miRNA-244與miRNA-328在膽管癌患者中的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)miRNA-244和miRNA-328在膽管癌患者血清中的含量變化，探究miRNA-244和miRNA-328 在膽管癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的病理生理學(xué)作用。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行，所有患者均簽署知情同意書。選取2017年1月至2018年12月在西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的膽管癌患者52例作為研究組，其中膽管癌未轉(zhuǎn)移患者20例，膽管癌伴轉(zhuǎn)移患者32例，選取同期收治的肝良性瘤患者43例作為對(duì)照組。膽管癌未轉(zhuǎn)移患者納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18～70周歲；②初次就診，入院診斷為膽管癌；③無(wú)膽管外淋巴及外周組織轉(zhuǎn)移。膽管癌伴轉(zhuǎn)移患者的納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18～70周歲；②初次就診，入院診斷為膽管癌；③原發(fā)性膽管腫物或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性病變經(jīng)病理學(xué)診斷為膽管癌。根據(jù)病史排除惡性腫瘤，系統(tǒng)性免疫功能疾病，腎臟心臟功能不全等患者。

2 血清樣本采集 所有研究對(duì)象于入院次日清晨7～8點(diǎn)以常規(guī)方法采集5 ml靜脈血至無(wú)添加劑采血管中。血液樣本于常溫下放置1 h 后3000 r／min離心20 min，取上層1 ml血清至EP管中，加入1 ml Trizol試劑，于-80℃超低溫冰箱中保存。

3 主要儀器與試劑 Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。實(shí)時(shí)定量PCR 試劑購(gòu)自寶生生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)定量PCR 儀為Bio-Red 公司產(chǎn)品。-80超低溫冰箱購(gòu)自Thermo Fisher公司。

4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)血清中miRNA 的表達(dá)

通過(guò)Trizol法提取血清RNA，進(jìn)行擦除DNA 和反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA 用于反轉(zhuǎn)錄，按照說(shuō)明書配制反轉(zhuǎn)錄體系。實(shí)時(shí)定量PCR 采用兩步法，條件如下:步驟一，預(yù)變性，95℃，30 s；步驟二，PCR 反應(yīng)，95℃5 s，60℃30 s，此步驟循環(huán)40次。通過(guò)2-ΔΔCt法檢測(cè)miRNA-244和miRNA-328的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列，見(jiàn)表1。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，繪制miRNA-244和miRNA-328診斷膽管癌轉(zhuǎn)移的受試者工作特征曲線（ROC 曲線），計(jì)算ROC曲線下面積（AUC）、靈敏度、特異性等。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T T A

表1 引物序列

結(jié) 果

1 研究對(duì)象一般資料比較 見(jiàn)表2。對(duì)照組、膽管癌未轉(zhuǎn)移組和膽管癌伴轉(zhuǎn)移組患者性別和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 研究對(duì)象一般資料比較

2 血清中miRNA-244和miRNA-328表達(dá)水平比較 qRT-PCR 結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。膽管癌未轉(zhuǎn)移組患者血清miRNA-244較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），膽管癌轉(zhuǎn)移組患者血清miRNA-244較對(duì)照組也明顯升高（P＜0.05），說(shuō)明miRNA-244可能是膽管癌促進(jìn)發(fā)生、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素和預(yù)測(cè)指標(biāo)；膽管癌未轉(zhuǎn)移組血清miRNA-328較對(duì)照組有降低趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而膽管癌伴轉(zhuǎn)移組患者血清miRNA-328明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明miRNA-328可能對(duì)膽管癌的發(fā)生，轉(zhuǎn)移有抑制作用并具有預(yù)測(cè)意義。

表3 各組miRNA-244和miRNA-328血清表達(dá)量比較

3 血清中miRNA-244和miRNA-328表達(dá)水平在膽管癌伴轉(zhuǎn)移患者中的診斷價(jià)值 通過(guò)繪制miRNA-244和miRNA-328在血清中表達(dá)水平的ROC曲線，分別評(píng)價(jià)兩者對(duì)膽管癌轉(zhuǎn)移的診斷效能（圖2）。血清中miRNA-244的表達(dá)水平佳界值為4.26，此時(shí)其靈敏度和特異度分別為73.0% 和60.1%，AUC 值為0.7225，（P=0.0161）；血清miRNA-328表達(dá)水平AUC值為0.5941（P=0.3346）。這些結(jié)果提示，血清miRNA-244的表達(dá)水平可以較好地區(qū)分膽管癌是否轉(zhuǎn)移。

圖1 血清中miRNA-244和miRNA-328的表達(dá)

圖2 血清miRNA-244和miRNA-328診斷膽管癌伴轉(zhuǎn)移的ROC曲線

討 論

膽管癌是指原發(fā)于左右肝管匯合部至膽總管下端的肝外膽管惡性腫瘤。近年來(lái)，由于飲食習(xí)慣和醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，膽管癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)［7］。高齡和慢性膽道炎癥刺激是膽管癌發(fā)生的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，臨床治療膽管癌常用的方法有手術(shù)治療、放療、化療等［8-9］。而現(xiàn)有的膽管癌早期診斷和預(yù)后判斷技術(shù)尚不成熟，難以早期發(fā)現(xiàn)膽管癌和有效評(píng)估預(yù)后，這導(dǎo)致膽管癌成為預(yù)后最兇險(xiǎn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅患者的生命［10-11］。近年來(lái)的研究表明，miRNA 不但參與人體的正常生理活動(dòng)，同時(shí)也與一些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究顯示，特定的miRNA 對(duì)食道癌、胰腺癌及肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生具有預(yù)測(cè)作用，可作為一些腫瘤的血清標(biāo)記物。本研究顯示，miRNA-244和miRNA-328在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中血清的表達(dá)量均發(fā)生重大變化，因此有望利用miRNA-244 和miRNA-328對(duì)膽管癌的診斷和預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，有效提高患者的治愈率和生存率。

miRNA 是大約20～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的單鏈RNA分子，miRNA 能夠通過(guò)結(jié)合靶基因3′-UTR 區(qū)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。有研究顯示miRNA 在腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。在各種類別的惡性腫瘤研究顯示，因?yàn)殡y以從懷疑惡性腫瘤的患者獲得有用的組織活檢，miRNA 作為潛在的腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物越來(lái)越吸引更多研究者的目光。

在生理狀態(tài)下，miRNA-244可通過(guò)抑制卵丘細(xì)胞中的Ptx3 分子延遲卵母細(xì)胞的成熟［12］，通過(guò)下調(diào)DMRT1促進(jìn)生精細(xì)胞的自我更新［13］，同時(shí)可以抑制SMAD4分子的表達(dá)抑制多種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化［14］。在循環(huán)系統(tǒng)中，miRNA-244 可受血管緊張素II的影響而促進(jìn)心肌纖維化形成［15］。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miRNA-244通過(guò)抑制SPG7，抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［16］。關(guān)于腫瘤的研究中，miRNA-244同樣扮演重要角色，miRNA-244 通過(guò)抑制m TOR 蛋白表達(dá)，激活Caspase-9／3 表達(dá)促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展［17］；而且，miRNA-244亦可通過(guò)下調(diào)SUFU 蛋白的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和內(nèi)皮向間充質(zhì)干細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化［18］。miRNA-244的表達(dá)量在宮頸癌中被上調(diào)，參與肝細(xì)胞癌的生成，并在腫瘤的遷移、侵襲和癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用［19］，而在胰腺癌中miRNA-244亦發(fā)揮著類似的作用［20］。

miRNA-328在生理和病理狀態(tài)下也發(fā)揮著重要的作用。研究顯示，miRNA-328通過(guò)下調(diào)TGFβRIII，激活TGFβ1 通路促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化［21］。miRNA-328同時(shí)具有修復(fù)支氣管上皮細(xì)胞的潛力［22］。而在腫瘤細(xì)胞的研究中，miRNA-328 通過(guò)抑制TCF7L2 蛋白，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤形成［23］，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制PTPRJ蛋白促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［24］，miRNA-328通過(guò)抑制CD44基因的m RNA，抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和內(nèi)皮-間充質(zhì)干細(xì)胞表性轉(zhuǎn)化［25］。miRNA-328在白藜蘆醇治療骨肉瘤時(shí)會(huì)大量表達(dá)，通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。miRNA-328 也可通過(guò)抑制磷酸酶來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用［26］。同時(shí)miRNA-328具有抑制胰腺癌腫瘤細(xì)胞增殖和代謝的功能。

本研究膽管未轉(zhuǎn)移患者和膽管癌伴轉(zhuǎn)移患者的血清，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)隨著膽管癌病情的發(fā)展miRNA-244的表達(dá)量逐漸升高，而miRNA-328的表達(dá)量在膽管癌轉(zhuǎn)移患者中降低。上述結(jié)果表明，miRNA-244和miRNA-328的檢測(cè)在一定程度上有利于醫(yī)生對(duì)膽管癌進(jìn)行初篩。由于miRNA-244與miRNA-328均與腫瘤細(xì)胞的增殖、代謝、遷移和侵襲密切相關(guān)。通過(guò)ROC 曲線分析miRNA-244 與miRNA-328在膽管癌伴轉(zhuǎn)移患者中的診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-244可以有效的區(qū)分膽管癌是否轉(zhuǎn)移。因此，血清中miRNA-244 和miRNA-328 水平有望成為膽管癌的可靠標(biāo)志物。