薛曉陽 王娟娟 李明珠 王雪敏 李佳佳 （華裕農業(yè)科技有限公司 河北 邯鄲 056000）

2019年初山東某商品蛋雞場130日齡的雞出現零星死亡。臨床癥狀為腿部、腳部、肛周有血泡，疑似血管瘤，但剖檢無腫瘤癥狀。在200日齡檢測11只弱雞，無菌采集抗凝血進行病毒分離工作，培養(yǎng)2代，細胞上清液經ELISAP27抗原檢測為60%以上陽性，該病例結合臨床癥狀懷疑為J亞型白血病病例。

禽白血病(A vianleukosis virus，ALV)是由禽C型反錄病毒群的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，主要是淋巴細胞性白血病，其次是成紅細胞性白血病、成髓細胞性白血病。此外還可引起骨髓細胞瘤、結締組織瘤、上皮腫瘤、內皮腫瘤等。禽白血病的傳播方式分為垂直傳播及水平傳播，其中經卵垂直傳播是禽白血病的主要傳播方式，家禽感染禽白血病后可造成雞只生長發(fā)育遲緩、產蛋性能下降、免疫抑制等影響[1]。同品種雞的飼養(yǎng)呈現規(guī)?；⒓s化發(fā)展，蛋雞、地方品種雞感染J亞群ALV的病例報道不斷增多[2]。禽白血病導致的經濟損失主要有2個方面：一是產生腫瘤，導致雞的死亡；二是產生非腫瘤綜合征。此外，禽白血病一當感染后，可引起雞群的免疫抑制，會繼發(fā)諸如馬立克氏病、傳染性法氏囊、雞傳貧等免疫抑制病，從而造成更嚴重的損失[3]。本檢測病例具有該特點，無明顯腫瘤癥狀，就診斷過程做一分享。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 DF-1細胞由山東農業(yè)大學腫瘤與免疫抑制病實驗室惠贈。肝素鈉抗凝管購自江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司。EDTA-K2抗凝管購自山東省成武縣醫(yī)用制品廠。6孔細胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司。DMEM高糖培養(yǎng)基生產廠家gibco，產品貨號8119159，有效期至2020.5。0.25胰酶生產廠家gibco，產品貨號2008319，有效期至2020.9.30。青鏈霉素生產廠家gibco，產品貨號2068817，有效期2020.1.30。兩性霉素B生產廠家procell，有效期至2020.6。胎牛血清PAA品牌，生產日期SF181212。

1.1.2 實驗設備 二氧化碳培養(yǎng)箱品牌松下，型號MCO-18AC。倒置顯微鏡品牌NIKON，型號TS2。高壓滅菌鍋博訊品牌，型號YXQ-LS-50SII。超純水系統(tǒng)艾科浦公司生產，型號AWL-0501-H。電熱干燥箱，上海博訊生產，型號GZX-9140MBE。超凈工作臺上海博訊公司生產，型號SW-CT-LFD。醫(yī)用離心機湘儀設備，型號H1850。酶標儀BIOTeK品牌，型號ELX800，洗板機為BIOTeK品牌，型號ELX50。移液器，eppendorf品牌。

1.1.3 試劑盒 LLAg試劑盒為IDEXX產品，貨號LP244，有效期至2020.5.18。

1.1.4 檢測雞 11只商品蛋雞。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及接種細胞[4]（1）抗凝血：1500-2000r離心2min，取中間靠下層，注意不要取到紅細胞.本檢測使用12孔板接90μl，每孔加入過濾的肝素鈉抗凝劑20μl(12.5U/ml)。（2）接種完 樣品后2h更換維持液，用滅菌的PBS清理清洗細胞板3次，每孔1ml/次，加入1%細胞維持液維持5d，維持5d后進行傳代。（3）共傳2代，每一代的上清液留樣檢測。

1.2.2 細胞上清液白血病檢測 試劑為IDEXX產品，嚴格按照試劑說明進行。

2 檢測結果

2.1 細胞上清液P27蛋白檢測結果

表1 2代細胞培養(yǎng)液P27檢測結果

2.2 陽性率及S/P值統(tǒng)計

表2 陽性率及陽性樣品S/P值統(tǒng)計

3 討論

（1）檢測結果陽性雞只占到檢測雞只63%以上，并且第一代樣品S/P值較高，遠遠高于試劑盒 判定標準，且第二代陽性樣品S/P值進一步提高，達到2.16，可以確定為強陽性。可以證明該雞群可能存在大比例陽性雞只，生產性能可能會受到影響。因為DF-1可以排除禽內源性白血病檢出，因此檢出的白血病屬于致病性的可能性較大，因該檢測沒有進行后續(xù)病毒分型鑒定，但結合臨床癥狀初步懷疑是白血病J亞型的一個血管瘤癥狀。（2）ALV-J引發(fā)的腫瘤/血管瘤給中國養(yǎng)雞業(yè)帶來了很大的危害。在過去十多年里，全國已報道了100多個ALV-J毒株的分離鑒定，同時何愛飛等也有禽白血病所致血管瘤的報到[5]，王培坤等在三黃雞臨床血管瘤病例分離出A亞群與J亞群白血病病毒 ，說明臨床血管瘤有一定的病例，但是在一般企業(yè)實驗室診斷全面診斷技術較為困難，病理切片技術相對復雜，并且在結果讀取專業(yè)性要求較高，一般企業(yè)員工對深層次分子理論掌握不夠，PCR方法白血病鑒定對分子理論要求較高，而細胞培養(yǎng)結合ELISA聯合診斷在企業(yè)應用較為適用。（3）結合本案例白血病臨床解剖不一定有明顯的腫瘤癥狀，11只被檢雞只精神良好，但偏瘦，血管瘤也無很明顯癥狀，臨床從130d開始出現零星死亡，持續(xù)不斷，遠高于正常死亡標準，從病毒分離結果，第一代便有高比例陽性檢出，且S/P值較高，因DF-1細胞可以排除內源性感染，因此初步懷疑J亞群白血病的感染，同時也說明DF-1細胞結合ELISA驗證，高S/P值也是鑒定標準之一，在臨床檢測可以攻毒重視。