代謝工程改造釀酒酵母促進L-苯丙氨酸的合成

冉艷朋，徐沙，李由然，蔣瑋，顧正華，丁重陽，張梁，石貴陽

(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)作為人體必需的8種氨基酸之一，在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[1-2]。L-苯丙氨酸生產(chǎn)主要分為化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵法。由于化學(xué)合成和酶法生產(chǎn)存在成本高、原料來源有限及環(huán)境污染嚴重等問題，微生物發(fā)酵法已成為主要生產(chǎn)方法[3]。目前，主要通過代謝工程改造大腸桿菌(Escherichiacoli)作為細胞工廠合成L-苯丙氨酸[4-6]，但是噬菌體污染和食品安全問題限制了它的應(yīng)用[7]。與大腸桿菌和其他細菌微生物相比，用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為宿主具有產(chǎn)物安全性、高酸受性、高底物受性和抗噬菌體等諸多優(yōu)勢[8]，在現(xiàn)代工業(yè)中已得到了廣泛的應(yīng)用。此外，釀酒酵母遺傳背景清晰，適合進行多種遺傳修飾。

釀酒酵母作為真核模式微生物，經(jīng)過多年的研究，已成為理解高等生物代謝調(diào)控機理的主要模式生物之一[9]。然而，釀酒酵母中芳香族氨基酸代謝部分基因功能和部分調(diào)控機理依然缺乏，無法有效指導(dǎo)芳香族氨基酸及其高價值衍生物(柚皮素、白藜蘆醇和苯乙烯等)的工業(yè)生產(chǎn)。因此，后基因組時代對釀酒酵母芳香族氨基酸代謝網(wǎng)絡(luò)的注釋就顯得極其重要。

在釀酒酵母中，L-苯丙氨酸合成途徑可分為3部分：中心碳代謝、莽草酸和分支酸途徑(圖1)。研究表明，敲除5-磷酸葡萄糖脫氫酶基因(ZWF1)并過量表達轉(zhuǎn)酮醇酶基因(TKL1)，有助于平衡前體物質(zhì)磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)和赤蘚糖-4-磷酸(erythritol-4-phosphate,E4P)的比例，同時增加E4P進入莽草酸途徑的流量[10]。在莽草酸途徑中，通過抗反饋亞型Aro4K229L和Aro7G141S取代天然的DAHP合酶同工酶Aro4和分支酸變位酶Aro7，可解除L-酪氨酸對Aro4和Aro7的反饋抑制用以促進芳香族化合物的合成[11]，而目前尚無關(guān)于抗反饋亞型DAHP合酶同工酶Aro3的確切報道。此外，弱化苯丙酮酸脫羧酶基因ARO10和PDC5，可以減少艾氏途徑對L-苯丙氨酸的消耗[12-13]。另一方面，由TYR1基因編碼的預(yù)苯酸脫氫酶催化碳代謝流向L-酪氨酸合成分支[14]。

圖1 釀酒酵母中芳香族氨基酸的生物合成和分解代謝途徑Fig.1 The biosynthesis and catabolism of aromatic amino acids in S. cerevisiae注：在本研究菌株代謝改造中，過量表達或定點突變的酶用藍色字體標(biāo)記；利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除的酶用灰色方框表示

L-苯丙氨酸合成途徑是釀酒酵母細胞內(nèi)最為復(fù)雜的代謝途徑之一， 在野生型細胞中其合成主要用于菌體生長和蛋白質(zhì)合成等。本研究以釀酒酵母S288c為出發(fā)菌株，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)分別對中心代謝途徑、莽草酸途徑、艾氏途徑及競爭性L-酪氨酸合成途徑進行重構(gòu)。首先，通過優(yōu)化中心代謝途徑和莽草酸途徑，獲得1株初步積累L-苯丙氨酸的菌株；在此基礎(chǔ)上，弱化艾氏途徑，減少L-苯丙氨酸胞內(nèi)的消耗；最后，阻斷競爭性L-酪氨酸合成途徑，使更多的碳流向L-苯丙氨酸合成分支。本實驗結(jié)果為繼續(xù)利用釀酒酵母解析芳香族氨基酸代謝途徑的調(diào)控機制，生產(chǎn)芳香族氨基酸及其高價值衍生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

表1列出了本研究中使用的菌株和質(zhì)粒。大腸桿菌菌株JM109用于質(zhì)粒的亞克隆。

表1 本研究所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

注：糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌生長所用SOB(super optimal broth)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉5，NaCl 0.5, KCl 0.186, MgSO4·7H2O 2.203。配制固體SOB時加入20 g/L瓊脂粉。

釀酒酵母種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡糖糖20。配制固體時加入20 g/L瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): 酵母氮源(含(NH4)2SO45 g/L) 7，葡糖糖50，蛋氨酸(Met) 0.03。用NaH2PO4和Na2HPO4調(diào)節(jié)pH至6.5。

1.1.3 主要主要工具酶及試劑

2×TaqPCR Master Mix、2×PfuPCR Master Mix，杭州寶賽公司；Fast DigestedTM快速限制性內(nèi)切酶，美國Thermo公司；T4DNA連接酶和pMD19T-simple，大連TaKaRa公司；L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、氨芐青霉素、G418、諾爾絲菌素、潮霉素，Sigma-Aldrich公司(上海)；質(zhì)粒DNA小劑量提取試劑盒、DNA 純化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，北京博大泰克生物有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，OXOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。在菌株構(gòu)建和搖瓶發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中添加的氨芐青霉素、諾爾絲菌素、潮霉素終質(zhì)粒濃度分別為100、100、500 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)

此方法為本實驗室開發(fā)。采用雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其中一個為含有Cas9編碼基因的pHCas9質(zhì)粒，另一個為含有打靶目的基因sgRNA的pYES2質(zhì)粒。將pYES2質(zhì)粒和目的基因上下游同源臂通過CH3COOLi轉(zhuǎn)化法[15]導(dǎo)入含有pHCas9質(zhì)粒的細胞中，可以達到敲除目的基因的目的。pYES2質(zhì)粒產(chǎn)生靶向目的基因sgRNA，與pYES2質(zhì)粒產(chǎn)生的Cas9蛋白結(jié)合, sgRNA 20 bp的N20序列與目的基因堿基配對成功后Cas9蛋白會剪短目的基因雙鏈，同時導(dǎo)入酵母的線性同源臂在切口兩側(cè)發(fā)生同源重組，完成敲除過程。質(zhì)粒的丟失通過在釀酒酵母無抗性培養(yǎng)基傳代完成。本研究所用引物及同源臂見表2。

1.2.2 培養(yǎng)方法

大腸桿菌在補充有100 μg/mL氨芐青霉素的50 mL SOB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。釀酒酵母在裝有20 mL YPD種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至指數(shù)期，用做菌株的轉(zhuǎn)化和發(fā)酵前的預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物經(jīng)無菌水洗滌后以初始OD600=0.2接種至裝有50 mL YNB發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，定時取樣用于測定芳香族氨基酸及其衍生物。添加L-酪氨酸用于補充營養(yǎng)缺陷型菌株RPC的需求。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers and oligonucleotides used in this study

注：在質(zhì)粒構(gòu)建引物中，帶下劃線部分表示sgRNA N20序列；在供體DNA引物中,帶下劃線和框格部分分別表示ZWF1同源延伸和堿基突變；產(chǎn)生的限制性位點用粗體標(biāo)記并在引物名稱中表示

1.2.3 菌體生長和碳源代謝物的測定

用722s型分光光度計測定發(fā)酵樣品的菌體濃度(OD600)。離心收集上清液樣品，并保存在-20 ℃直至用于分析。用于碳源代謝(葡糖糖、甘油、乙醇)分析的樣品在終體積分數(shù)為5%的三氯乙酸(TCA)中沉淀蛋白，4 ℃離心后通過HPLC進行分析。

HPLC條件：色譜柱為Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，示差檢測器，流動相為5 mol/L H2SO4，流速為0.8 mL/min，柱溫60 ℃，進樣量20 μL。

1.2.4 芳香族氨基酸衍生物苯乙酸(PAA)和苯乙醇(PET)的測定

將乙腈添加到樣品中至終體積分數(shù)為20%用于HPLC分析。色譜柱為Waters C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，紫外檢測器檢測波長為215 nm，以流動相A(8 mmol/L KH2PO4, pH 2.4)和流動相B(純乙腈)按照參考文獻[16]的方法進行梯度洗脫分析樣品。

1.2.5 OPA柱前衍生法測定芳香族氨基酸

將體積分數(shù)10%TCA添加到樣品中至終體積分數(shù)為5%用于HPLC分析。色譜柱為Thermo Fisher Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，柱溫40 ℃，紫外檢測器檢測波長為338 nm，20 μL。流動相A(pH 7.2)∶60 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)；流動相B(pH 7.2)∶60 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈(體積比為1∶2∶2)。采用梯度洗脫，流速1.0 mL/min，洗脫程序為：0 min, 8% B; 17 min, 50% B; 20.1 min, 100% B; 24.0 min, 8% B。氨基酸以外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建

利用引物ZWF1-sgRNA-F、sgRNA-R和sgRNA-F、ZWF1-sgRNA-R分別以質(zhì)粒pYES2-gRNA-Hyg為模板構(gòu)建質(zhì)粒pYES2-sgRNA(ZWF1)-Hyg，用引物sgRNA-v-F和sgRNA-v-R進行菌落PCR驗證(圖3-A)，得到大小為600 bp左右的條帶，證明質(zhì)粒pYES2-sgRNA(ZWF1)-Hyg構(gòu)建成功。用同樣的方法構(gòu)建了質(zhì)粒pYES2-sgRNA(ARO4)-Hyg、pYES2-sgRNA(ARO7)-Hyg、pYES2-sgRNA(ARO10)-Hyg、pYES2-sgRNA(PDC5)-Hyg、pYES2-sgRNA(TYR1)-Hyg并進行驗證。

以釀酒酵母S288c染色體為DNA模板，用引物TKL1-EcoRI-F和TKL1-SalI-R擴增獲得1條2.0 kb左右的片段，雙酶切純化后連接pY26-URA3載體，用引物pY26-v-F和 pY26-v-R進行菌落PCR(圖3-B)，得到大小為2 100 bp左右的條帶，證明質(zhì)粒pY26-URA3-TKL1構(gòu)建成功。用引物PGAP-TKL1-F和TKL1-TTEF1-R以構(gòu)建的質(zhì)粒pY26-URA3-TKL1為模板，擴增獲得帶有ZWF1上下游同源臂的TKL1序列，純化后連接pMD19-T載體送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證，得到無堿基突變的序列。

如圖2所示，將質(zhì)粒pYES2-sgRNA(ZWF1)-Hyg及線性化載體pMD19T-TKL1轉(zhuǎn)化到含有質(zhì)粒pHCas9-Nours的釀酒酵母S288c細胞，在諾爾絲菌素和潮霉素雙抗性YPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子，用引物ZWF1-v-F和ZWF1-v-R進行菌落PCR驗證(圖3-C)，得到大小為1 300 bp左右的條帶，樣品測序和核酸序列比對一致，證明基因ZWF1被成功敲除，并且在敲除位點成功整合TKL1表達盒。

圖2 重組菌株構(gòu)建流程圖Fig.2 The construction flow chart of the recombinant strains

A-pYES2-sgRNA(ZWF1)-Hyg質(zhì)粒的驗證；B-pY26-URA3-TKL1質(zhì)粒的驗證；C-將TKL1插入ZWF1站點的驗證；D-ARO10基因缺失的驗證；E-PDC5基因缺失的驗證；F-TYR1基因缺失的驗證圖3 菌落或基因組PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of colony and genome PCR

由此，成功構(gòu)建菌株S288c(Δzwf1∶∶TKL1)。將質(zhì)粒pYES2-sgRNA(ARO4)-Hyg和帶有堿基位點突變的90 bp Donor DNA寡核苷酸片段導(dǎo)入菌株S288c(Δzwf1∶∶TKL1)，以ARO4-v-F和ARO4-v-R為驗證引物經(jīng)PCR獲得帶突變位點的目的片段，經(jīng)測序比對篩選得到菌株S288c(Δzwf1∶∶TKL1, Aro4K229L)。以同樣的方法及相應(yīng)的驗證引物構(gòu)建和驗證菌株RPA、S288c(Δzwf1∶∶TKL1, Aro4K229L, Aro7G141S, Δaro10)、RPB及RPC (如表1所示)。菌落或基因組PCR驗證如圖3-D、3-E、3-F所示。

2.2 L-苯丙氨酸合成途徑的強化

通過將TKL1整合在ZWF1位點，并定點突變ARO4和ARO7，得到菌株RPA。已有研究表明蛋氨酸補充對于ZWF1缺失的釀酒酵母生長是必需的，可能是蛋氨酸的生物合成需要戊糖磷酸途徑釋放的碳水化合物[17]。對菌株RPA和出發(fā)菌S288c進行了搖瓶發(fā)酵比較。如圖4-A所示，對照菌S288c胞外L-苯丙氨酸凈積累幾乎為零，而在菌株RPA胞外檢測到2.49 mg/L的L-苯丙氨酸；同時，菌株RPA胞外檢測到6.53 mg/L的L-酪氨酸 (圖4-B)。在苯乙醇/苯乙酸(PET/PAA)合成方面，菌株RPA胞外苯乙醇/苯乙酸最高產(chǎn)量為30.12 mg/L，而對照菌S288c基本維持本底質(zhì)粒濃度1.87 mg/L(圖4-C)。此外，菌株RPA的最高OD600為8.52，與對照菌S288c相比，降低了37%(圖4-D、圖4-E)。以上結(jié)果表明，中心代謝途徑和莽草酸途徑的代謝調(diào)控同時強化了L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的合成；同時，代謝途徑的改造影響了菌株生長和對碳源的利用速率(圖4-D、圖4-E)，由于菌株的生長涉及一系列復(fù)雜的調(diào)控，其原因有待進一步探究。此外，加強L-苯丙氨酸合成帶來了苯乙醇/苯乙酸積累的問題。

A-S288c和RPA中細胞外L-苯丙氨酸的產(chǎn)量；B-S288c和RPA中細胞外L-酪氨酸的產(chǎn)量;C-S288c和RPA中胞外PET/PAA的產(chǎn)量;D-S288c中碳源的消耗與菌體生長;E-RPA中碳源的消耗和RPA的增長圖4 重組菌株RPA的搖瓶發(fā)酵Fig.4 Shake flask fermentation of the recombinant strain RPA

2.3 L-苯丙氨酸消耗途徑的弱化

艾氏途徑消耗了細胞合成的L-苯丙氨酸，其途徑的脫羧反應(yīng)為關(guān)鍵調(diào)控位點。研究表明，釀酒酵母脫羧酶基因涉及PDC1、PDC5、PDC6、ARO10[18]。PDC1、PDC5、PDC6基因編碼3種丙酮酸脫羧酶(Pdc)同工酶。而在以L-苯丙氨酸為氮源的培養(yǎng)基中只有Aro10和Pdc5顯示出苯丙酮酸脫羧酶活性，且Aro10 活性更高[13]。因此，在菌株RPA的基礎(chǔ)上，敲除ARO10和PDC5，構(gòu)建菌株RPB，可以減少艾氏途徑對L-苯丙氨酸的利用。

為了考察ARO10和PDC5缺失對L-苯丙氨酸及其降解產(chǎn)物苯乙醇/苯乙酸積累的影響，發(fā)酵120 h的結(jié)果如圖5-A所示。

A-RPB中胞外芳香化合物的產(chǎn)量;B-RPB中碳源的消耗與RPB增長圖5 重組菌株RPB的搖瓶發(fā)酵Fig.5 Shake flask fermentation of the recombinant strain RPB

菌株RPB胞外L-苯丙氨酸最高產(chǎn)量為5.16 mg/L，是菌株RPA的2.07倍，與此同時，胞外L-酪氨酸最高產(chǎn)量為10.58 mg/L，是菌株RPA的1.62倍；胞外苯乙醇/苯乙酸最高產(chǎn)量為20.53 mg/L，與菌株RPA相比，減少了31.83%。此外，菌株RPB最高OD600為7.75(圖5-B)，與菌株RPA相比，降低了9.03%。

以上結(jié)果表明，ARO10和PDC5的缺失可以提高L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的積累，與已有的研究結(jié)果：缺失ARO10和PDC5增加芳香族氨基酸衍生物香豆酸的積累是一致的[19]。此外，雖然目前艾氏途徑代謝機制已有研究[20]，但各種酸脫羧酶的苯丙酮酸脫羧能力未得到充分的探究[13, 18]，苯丙酮酸脫羧酶酶活力調(diào)控機制依然模糊，ARO10和PDC5的缺失未能完全阻斷苯乙醇/苯乙酸的積累，具體機制仍需進一步研究。

2.4 L-酪氨酸合成分支途徑的阻斷

由于L-苯丙氨酸和L-酪氨酸擁有共同前體預(yù)苯酸，L-苯丙氨酸合成途徑的強化同樣增強了L-酪氨酸的合成。此前，研究人員在大腸桿菌中敲除分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶(tyrA)基因阻斷L-酪氨酸合成[21]，從而抑制碳向競爭途徑的流失[22]。因此，本實驗在菌株RPB的基礎(chǔ)上，敲除通向L-酪氨酸合成的關(guān)鍵酶——預(yù)苯酸脫氫酶基因TYR1[23]，構(gòu)建菌株RPC。

預(yù)苯酸脫氫酶Tyr1的缺失，導(dǎo)致菌株RPCL-酪氨酸營養(yǎng)缺陷。本實驗在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100 mg/L的L-酪氨酸以回補L-酪氨酸營養(yǎng)缺陷進行搖瓶發(fā)酵,如圖6-A所示。

A-RPB和RPC中細胞外L-苯丙氨酸的產(chǎn)量;B-RPB和RPC中細胞外L-酪氨酸的產(chǎn)量;C-RPB和RPC中細胞外PET/PAA的產(chǎn)量;D-RPB中碳源的消耗與RPB增長;E-RPC中碳源的消耗與菌體生長圖6 重組菌株RPC的搖瓶發(fā)酵Fig.6 Shake flask fermentation of the Recombinant strain RPC

菌株RPC胞外L-苯丙氨酸最高產(chǎn)量為45.40 mg/L，是添加L-酪氨酸發(fā)酵的菌株RPB的6.94倍；0～24 h菌株L-酪氨酸消耗速率最高，且由于L-酪氨酸合成途徑的阻斷，菌株RPC對L-酪氨酸的需求更大，導(dǎo)致L-酪氨酸消耗速率高于RPB。因為菌株RPBL-酪氨酸合成途徑并未阻斷，所以最終菌株RPBL-酪氨酸殘留量大于RPC(圖6-B)。

菌株RPC胞外苯乙醇/苯乙酸的最高含量為50.26 mg/L(圖6-C)，是添加L-酪氨酸發(fā)酵的菌株RPB的2.06倍。此外，雖然菌株RPC補充了L-酪氨酸，但TYR1的缺失仍然對菌體生長造成一定影響，最高OD600為7.3，與添加L-酪氨酸發(fā)酵的菌株RPB相比，降低了11.83%(圖6-D、圖6-E)。以上結(jié)果表明，TYR1的缺失阻斷了L-酪氨酸合成途徑及以L-酪氨酸為前體物質(zhì)的代謝途徑(如蛋白質(zhì)的合成)[24]，從而使用于這些代謝途徑的碳流向L-苯丙氨酸合成途徑，極大促進了L-苯丙氨酸的積累及胞外分泌；同時L-苯丙氨酸的積累也促進了艾氏途徑對它的消耗，苯乙醇/苯乙酸產(chǎn)量隨之提高。

3 結(jié)果與討論

芳香族氨基酸的生物合成途徑在大腸桿菌中已得到廣泛的研究。大腸桿菌要消耗芳香族氨基酸合成前體物質(zhì)PEP的50%參與磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)用于葡萄糖的吸收[25]，使得芳香族氨基酸的合成效率在30%以下。相比于大腸桿菌，釀酒酵母通過己糖轉(zhuǎn)運酶(HXT)采用促進擴散的方式吸收葡萄糖[26]，不需要消耗前體PEP，理論上可使芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)化率提高近1倍。然而，事實上目前尚無利用釀酒酵母大量積累芳香族氨基酸的先例。包括L-苯丙氨酸在內(nèi)的芳香族氨基酸的合成途徑是釀酒酵母細胞內(nèi)最為復(fù)雜的代謝途徑之一。以L-苯丙氨酸為例，其合成需要借助莽草酸途徑，后經(jīng)10步反應(yīng)完成；與之相關(guān)的代謝囊括了糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、葡糖糖吸收和檸檬酸循環(huán)等。然而，已有的釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)模型(Iff708, Ind750) in silico預(yù)測準(zhǔn)確率不足85%[27-28]，芳香族氨基酸代謝途徑部分調(diào)控基因及調(diào)控機制仍十分模糊，無法合理高效指導(dǎo)代謝工程的研究和改造。因此，在后基因組時代對釀酒酵母芳香族氨基酸代謝網(wǎng)絡(luò)的研究和注釋顯得尤其重要。

本研究以釀酒酵母模式菌株S288c為研究對象，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，通過代謝工程技術(shù)手段，對L-苯丙氨酸合成相關(guān)途徑進行了初步探究，為釀酒酵母芳香族氨基酸代謝途徑的分子調(diào)控圖譜的繪制和細胞代謝途徑及其遺傳修飾的合理人工設(shè)計提供參考。首先，代謝改造中心代謝途徑和莽草酸途徑，獲得能初步積累L-苯丙氨酸的菌株RPA；而后針對菌株RPA苯乙醇/苯乙酸的積累問題，弱化艾氏途徑，減少L-苯丙氨酸胞內(nèi)的消耗；最后，阻斷L-酪氨酸合成途徑，成功減少L-酪氨酸的分流，菌株RPC胞外L-苯丙氨酸最高含量為45.40 mg/L。此外，為了降低TYR1的缺失對菌體生長的影響，同時不影響L-苯丙氨酸合成分支的流量，可以參考大腸桿菌中降低分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶(TyrA)酶活力的思路[29]，在釀酒酵母基因TYR1位置添加蛋白酶水解標(biāo)簽，增加預(yù)苯酸脫氫酶Tyr1對蛋白水解的敏感性，以此降低Tyr1的總體酶活力。本研究通過對L-苯丙氨酸合成相關(guān)途徑的探究，增加了對釀酒酵母芳香族氨基酸代謝調(diào)控機制的認識，為后續(xù)研究釀酒酵母芳香族氨基酸代謝調(diào)控提供重要參考價值。

后續(xù)將通過深入挖掘釀酒酵母芳香族氨基酸合成及轉(zhuǎn)運機制，從基因和轉(zhuǎn)錄水平上闡明芳香族氨基酸合成和轉(zhuǎn)運途徑的內(nèi)在調(diào)控機制，以此繪制釀酒酵母芳香族氨基酸代謝途徑的分子調(diào)控圖譜，從而為代謝改造釀酒酵母進行芳香族氨基酸及其高價值衍生物的工業(yè)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。