任家勤，黃桔，沈妍秋，梁東，夏惠

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都，611130)

世界上大多數(shù)葡萄品種來源于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(VitisL.)真葡萄亞屬(Euvitis)的歐洲葡萄(V.vinifera)、美洲種(V.Labrusca)或歐美雜交等。圓葉葡萄(VitisrotundifoliaMichx)在分類學(xué)上歸為另一個亞屬——圓葉葡萄亞屬(MuscadiniaPlanch)。圓葉葡萄起源于美國東南部，是當(dāng)?shù)氐闹髟云咸?，栽培歷史超過400年，目前已培育出100多個品種[1]。與廣泛栽培的真葡萄亞屬品種不同，圓葉葡萄的染色體數(shù)目更多(n=40)，而真葡萄染色體數(shù)為n=38[2]。圓葉葡萄果實具有獨特的香氣，既可鮮食，又可加工成果汁、果脯、果醬等，其濃郁的香氣使釀制的葡萄酒風(fēng)味獨特，產(chǎn)品價值高[3]。圓葉葡萄果皮呈現(xiàn)出綠色、銅色、紅色、黑色等，表面還帶有特殊的金屬光澤。此外，圓葉葡萄還具有優(yōu)良的抗病蟲能力，是世界公認(rèn)抗病性最強(qiáng)的葡萄[4]，對霜霉病、炭疽病、根瘤蚜、劍形根結(jié)線蟲等多種病蟲害具有高抗性，甚至免疫性[5]。

國內(nèi)對于圓葉葡萄的研究較少，大多集中于各地區(qū)圓葉葡萄的引種表現(xiàn)[6-7]，漿果揮發(fā)性成分的研究[8]，以及種子發(fā)育過程中多酚積累特性[9]，但鮮有對不同品種品質(zhì)特性尤其是有機(jī)酸和多酚的研究。課題組于2015年從廣西省農(nóng)科院引進(jìn)5個圓葉葡萄品種在四川成都地區(qū)試種，其中4個品種‘Noble’、‘Alachua’、‘Carlos’和‘GV’對四川平原地區(qū)的濕熱氣候條件表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性，長勢良好[10]，并于2017年開花結(jié)果。本試驗對引種的4個圓葉葡萄品種進(jìn)行果實品質(zhì)、有機(jī)酸和多酚類物質(zhì)含量進(jìn)行比較分析，旨在篩選出高營養(yǎng)價值的品種，為四川地區(qū)葡萄品種選優(yōu)、加工利用以及良種繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑及儀器

試驗材料：2015年引進(jìn)的4個圓葉葡萄品種‘Noble’、‘Alachua’、‘Carlos’和‘GV’的果實。果實均采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)避雨葡萄園3年生葡萄樹，棚寬6 m，高1.8 m，架式采用單干雙臂式。于2018年8～9月果實成熟期，采集TSS>14%的成熟果實。每個品種采集大小一致的成熟果30～50粒，立即帶回實驗室，將果皮、果肉和種子分離，液氮速凍后保存于-80 ℃冷藏箱中備用。

試劑：原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、對香豆酸、槲皮苷、香草酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸(HLPC≥98%)，北京索萊寶科技有限公司；甲醇、甲酸為色譜純；水為Millipore超純水。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀(Agilent 1260)，配置DAD檢測器和紫外檢測器，Agilent；色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Comatex；FB15060超聲波清洗器，F(xiàn)isher Scientific；SORVALL ST16R高速冷凍離心機(jī),Thermo Fisher； BSA224S電子天平,賽多利斯公司；Milli-Q Integral 10超純水儀,Millipore。

1.2 測定果實品質(zhì)基礎(chǔ)指標(biāo)

橫縱徑用游標(biāo)卡尺測定；電子天平(0.01 g)稱量果實的單果重；室溫下用PAL-1型手持袖珍折射儀測果實的TSS含量；可滴定酸含量采用NaOH滴定法測定，以酒石酸含量計；果形指數(shù)=縱徑/橫徑；固酸比為TSS含量和可滴定酸含量的比值。

1.3 酚類物質(zhì)含量測定

酚類物質(zhì)提?。悍謩e稱取果皮0.3 g、果肉0.5 g、種子0.2 g，加2 mL提取液研磨。提取液為V(甲醇)∶V(甲酸)∶V(無水乙醇)=70∶ 2∶ 28。研磨后轉(zhuǎn)移到離心管中，再加2 mL提取液沖洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管，定容至5 mL。超聲浸提30 min，10 000×g離心10 min，取上清液用0.45 μm的濾膜過濾后待用。

總酚(total phenolic content, TPC)、總黃酮(total flavones of choeropondias, TFC)和總黃烷醇(total flavones alkane content, TFAC)的含量測定參考汪曉謙[11]的方法，TPC用沒食子酸當(dāng)量表示，即mgGAE/g，TFC用蘆丁當(dāng)量表示，即mgRE/g，TFAC用兒茶素當(dāng)量表示，即mgCE/g表示。單寧的測定參考王哲等[12]的方法，以兒茶素當(dāng)量表示，即mgCE/g表示。

黃酮醇的測定：取100 μL提取液與100 μL AlCl3(0.3 mol/L)、300 μL乙酸鈉(1.64 g NaAc用蒸餾水定容至100 mL)混勻，25 ℃存放2.5 h，440 nm下測定吸光度，以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)，即mgRE/g。

1.4 測定有機(jī)酸含量

有機(jī)酸提取參考高金娃等[13]的方法，有所改動。取葡萄果肉0.5 g，超純水冰浴研磨，定容至3 mL，混勻，靜置過夜或超聲30 min，10 000×g離心10 min，0.45 μm過濾，備用。采用HPLC法測定有機(jī)酸含量，條件為：3%甲醇水溶液(用磷酸調(diào)pH至2.6)作為流動相,柱溫設(shè)定為25 ℃，進(jìn)樣量設(shè)為10 μL，流速設(shè)為0.8 mL/min，檢測波長為210 nm。

1.5 HPLC法測定單體酚含量

提取方法參考朱葉梅等[14]的方法：稱取樣品2 g，加3 mL提取液研磨，提取液為體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液(含體積分?jǐn)?shù)2%的甲酸)。研磨液在30 ℃下超聲30 min，以充分提取。10 000×g離心10 min，上清液用0.45 μm膜過濾后上機(jī)。采用HPLC法測定單體酚含量，使用高效液相色譜儀，配置二極管檢測器：色譜柱為Comatex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相A為體積分?jǐn)?shù)2%乙酸溶液；流動相B為體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸)；梯度洗脫程序如下：0～50 min，流動相A為90%～55%；50～60 min，流動相A為55%～0；60～65 min，流動相A為0～90%；分別在260、270、280、320、330、360 nm波長下進(jìn)行檢測；柱溫設(shè)定為30 ℃；進(jìn)樣量設(shè)為20 μL；流速設(shè)為1 mL/min。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)基本處理，用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀性狀比較

4個圓葉葡萄品種果實外觀形態(tài)差異明顯(圖1)，其中‘GV’和‘Carlos’果皮呈古銅綠色，果粒較大，單粒質(zhì)量>5 g，近圓形；‘Alachua’和‘Noble’果皮呈紫黑色，果粒偏小，單粒質(zhì)量僅2.2～3.5 g，近圓形(表1)。

圖1 四個圓葉葡萄品種成熟果實Fig.1 Images of four muscadine grape cultivars

表1 圓葉葡萄外觀性狀Table 1 Appearances of different muscadine grapecultivars

2.2 圓葉葡萄基本理化性質(zhì)比較

由表2可以看出，4個品種果實TSS含量差異顯著，范圍在15%～18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)；可滴定酸含量在0.36%～0.52%，‘Alachua’的含量最高為0.52%，而‘Noble’的含量最低，為0.36%?！瓽V’的固酸比最高，而‘Alachua’最低。

表2 圓葉葡萄基本理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of differentmuscadine grape cultivars

2.3 圓葉葡萄有機(jī)酸含量的比較分析

有機(jī)酸組成和含量是決定果實風(fēng)味和品質(zhì)的重要因素之一[15]。檸檬酸和蘋果酸廣泛存在于水果中，而酒石酸是葡萄中的特征酸[16]。本研究利用HPLC檢測了圓葉葡萄果肉中7種有機(jī)酸含量，由圖2可知，酒石酸、蘋果酸是圓葉葡萄果實中的主要有機(jī)酸，其中紫色品種中的2種有機(jī)酸占總有機(jī)酸含量的90%左右，綠色品種這2種酸占總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的75%左右。琥珀酸和檸檬酸含量相對突出，而奎寧酸、馬來酸和富馬酸含量極低。果肉中酒石酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是3.98～8.17 mg/g，紫色品種酒石酸含量均為綠色品種含量的2倍。蘋果酸和檸檬酸的含量差異均不顯著，其中蘋果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是1.17～1.22 mg/g。‘Carlos’的琥珀酸含量最高，為1.17 mg/g，而‘Noble’含量最低，為0.28 mg/g，綠色品種的含量均高于紫色品種。而奎寧酸、馬來酸和富馬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.007 mg/g以下，‘GV’的馬來酸含量最高，為0.006 7 mg/g。

圖2 圓葉葡萄有機(jī)酸含量Fig.2 Organic acids content in muscadine grape cultivars注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05(下同)

有機(jī)酸的含量對葡萄酒的味感、穩(wěn)定性的形成和陳釀特性具有重要作用。果肉中所測定的7種有機(jī)酸在有機(jī)酸總量中所占比例表現(xiàn)為：酒石酸>蘋果酸>琥珀酸>檸檬酸>馬來酸>奎寧酸>富馬酸?！甆oble’中2個主要的有機(jī)酸酒石酸和蘋果酸含量最高，但琥珀酸含量最低；‘GV’的檸檬酸和馬來酸含量最高，但酒石酸、蘋果酸和富馬酸含量最低。本研究中的2個果皮顏色相同的品種有機(jī)酸總量相近，且紫色品種的有機(jī)酸總量大于綠色品種。

2.4 不同葡萄品種中酚類物質(zhì)含量比較

葡萄中酚類物質(zhì)主要由黃酮類化合物、花色苷、酚酸和單寧組成，是重要的次生代謝產(chǎn)物。大量研究證明，酚類物質(zhì)具有清除自由基、抗脂化氧化、延緩衰老和抗癌等生理功能[17-18]。本試驗分別測定了4個圓葉葡萄果皮、果肉和籽中酚類物質(zhì)含量。不同果實組織中酚類物質(zhì)含量為葡萄籽>果皮>果肉。

如表3所示，果皮中，4個圓葉葡萄總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.86～3.35 mg/g，含量由高到低依次：‘Noble’>‘Alachua’>‘GV’>‘Carlos’。說明紫色品種總酚含量明顯高于綠色品種。4個品種總黃烷醇含量差異顯著，‘Carlos’最高，‘Noble’最低。總黃酮的含量范圍為0.78～2.17 mg/g，其中‘Noble’總黃酮含量與‘Carlos’差異顯著，‘Alachua’和‘GV’差異極顯著。4個品種之間黃酮醇含量差異顯著，含量由高到低依次：‘Noble’>‘Carlos’>‘Alachua’>‘GV’，綠色品種的總黃酮含量大于紫色品種。單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍是0.46～3.90 mg/g，其中‘Noble’最高。

果肉中，紫色品種的總酚含量高于綠色品種，其中‘Alachua’顯著高于其他3個品種。紫色品種中的‘Alachua’和‘Noble’的總黃酮和黃酮醇含量均大于綠色品種‘GV’和‘Carlos’，并且‘Alachua’的含量最高，而‘GV’的含量最低?！瓵lachua’與‘Noble’和‘GV’之間單寧含量差異不顯著，其中‘Noble’的含量最高，與‘GV’含量差異顯著，‘Noble’的含量是‘GV’的1.63倍。

種子中，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在9.395～12.64 mg/g，高低依次為‘GV’>‘Alachua’>‘Noble’>‘Carlos’?！甆oble’和‘Carlos’之間的總黃烷醇含量差異不顯著，其含量顯著高于‘Alachua’，顯著低于‘GV’?？傸S酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是26.06～70.96 mg/g，紫色品種高于綠色品種，其中‘Noble’含量最高，分別是‘GV’、‘Carlos’含量的2.72和1.68倍?！瓵lachua’、‘Noble’和‘GV’種子中黃酮醇含量差異不顯著，但顯著高于‘Carlos’。種子中單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是8.78～20.65 mg/g，含量高低依次為‘Alachua’>‘GV’>‘Noble’>‘Carlos’，‘Alachua’的含量是‘Carlos’的2.35倍。

果皮和種子中總酚占整個果實總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的90%以上，這與酚類物質(zhì)主要分布在葉片、種子和果皮中，果肉中含量很少[19-21]的結(jié)果一致。

表3 圓葉葡萄品種酚類物質(zhì)含量Table 3 Phenolic substance content in 4 muscadine grapes

注：同一列不同小寫字母表示差異顯著(P=0.05)

2.5 圓葉葡萄果實單體酚種類和含量分析

葡萄中酚類物質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，利用HPLC檢測了4種圓葉葡萄果皮和籽中單體酚類物質(zhì)含量，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 圓葉葡萄果皮中酚類物質(zhì)含量Fig.3 Contents of individual phenolic compounds in muscadine grape skin

圖4 圓葉葡萄籽中單體酚含量Fig.4 Contents of individual phenolic compounds in muscadine grape seed

果皮中各單體酚含量差異顯著。其中阿魏酸含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是3～13 mg/g，4個品種含量高低依次為是‘Carlos’>‘GV’>‘Noble’>‘Alachua’。紫色品種的阿魏酸含量顯著低于綠色品種?？Х人岬馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5～3 mg/g，其中‘Alachua’、‘GV’和‘Carlos’含量相差不大，而‘Noble’的含量最低。2個紫色品種果皮的原兒茶酸含量高于2個綠色品種，‘Noble’質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為1.67 mg/g，是‘Carlos’的2.61倍。槲皮苷的含量范圍是0.1～1.0 mg/g，‘Noble’含量明顯高于其他3個品種。香草酸和表兒茶素的含量規(guī)律一致，均為‘Carlos’最高，‘Alachua’最低；香草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是0.3～2.2 mg/g，表兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是0.1～0.7 mg/g。綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍是0.1～0.5 mg/g，‘Noble’含量最低，‘Alachua’、‘GV’、‘Carlos’含量分別是‘Noble’4.54、2.27、1.71倍。對香豆酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是0.05～0.42 mg/g，含量高低次序為‘Carlos’>‘GV’>‘Alachua’>‘Noble’?！瓵lachua’的對羥基苯甲酸含量最高，‘Carlos’含量最低。

從圖4可見，圓葉葡萄種子中對羥基苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是0.90～5.09 mg/g，‘GV’含量極顯著的高于其他品種，‘Noble’和‘Carlos’含量最低，并且差異不顯著。阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是2.49～4.61 mg/g，含量高低依次是‘Noble’、‘GV’、‘Alachua’、‘Carlos’。紫色品種中‘Noble’種子的咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為2.57 mg/g，是‘Alachua’的8.86倍，‘Noble’和‘Carlos’的含量差異不明顯。紫色品種的綠原酸含量顯著高于綠色品種，含量大小依次為‘Noble’>‘Alachua’>‘GV’>‘Carlos’，‘Noble’含量是‘Carlos’含量的32.42倍。‘Carlos’種子香草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為2.83 mg/g，‘Alachua’質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為1.39 mg/g。種子中原兒茶酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是0.44～2.46 mg/g，綠色品種原兒茶酸的含量高于紫色品種。表兒茶素的含量高低依次為‘Alachua’、‘GV’、‘Carlos’、‘Noble’。對香豆酸和槲皮苷的含量均為‘Noble’含量最高，‘Carlos’含量最低，而‘Alachua’和‘Carlos’差異不明顯；對香豆酸的含量范圍是0.20～0.97 mg/g，槲皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是0.91～1.96 mg/g。

3 討論

對從美國引進(jìn)的4個圓葉葡萄品種的果實品質(zhì)進(jìn)行綜合比較分析，綠色品種‘Carlos’和‘GV’的單果重和橫縱徑明顯大于紫色品種‘Noble’和‘Alachua’，果實形狀均偏圓形。從基本理化性質(zhì)來看，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%～18%，可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.35%～0.55%，固酸比通常用來評價葡萄果實風(fēng)味及成熟程度，比值愈高，風(fēng)味愈佳，固酸比值大小依次為 ‘GV’、‘Noble’、‘Carlos’、‘Alachua’，‘GV’更適宜鮮食。

本研究利用高效液相檢測了圓葉葡萄果肉中7種有機(jī)酸含量，酒石酸、蘋果酸是圓葉葡萄果實中的主要有機(jī)酸，其中紫色品種中2種有機(jī)酸占總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的90%左右，綠色品種這2種有機(jī)酸占總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的75%左右；琥珀酸和檸檬酸含量相對突出，而奎寧酸、馬來酸和富馬酸含量極低。酒石酸是葡萄酒酸味的主要來源，不僅參與了葡萄酒味感的平衡，還維持了葡萄酒的低pH值[22]，紫色品種‘Alachua’和‘Noble’ 酒石酸含量均為綠色品種‘GV’和‘Carlos’含量的2倍。琥珀酸是酒精發(fā)酵的一種副產(chǎn)物，能參與酒味的形成，而綠色品種的‘Carlos’和‘GV’琥珀酸含量高于紫色品種‘Alachua’和‘Noble’?！甆oble’中2個主要的有機(jī)酸酒石酸和蘋果酸含量最高，但琥珀酸含量最低；‘GV’的檸檬酸和馬來酸含量最高，但酒石酸、蘋果酸和富馬酸含量最低。研究中的2個果皮顏色相同的品種有機(jī)酸總量相近，且紫色品種的有機(jī)酸總量大于綠色品種。

4個圓葉葡萄品種酚類物質(zhì)的種類含量差異顯著，前人研究結(jié)果表明，葡萄果實中的多酚主要分布在果皮和種子中，果肉中含量較少[20-21]，與本試驗結(jié)果一致。‘Noble’果皮中含量最高的是總酚、總黃酮、黃酮醇和單寧，其中總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是0.86～3.35 mg/g，單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.46～3.90 mg/g之間。單寧是一類小分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多元酚類化合物，具有澀味和收斂性[23]，能使葡萄酒色澤更加鮮艷，在葡萄酒陳釀的過程中產(chǎn)生芬芳的香氣。紫色品種的果皮中總酚、單寧和黃酮醇含量均高于綠色品種，與前人的研究結(jié)果一致[24]。‘Alachua’果肉中TPC、TFC和黃酮醇的含量均為最高，單寧含量較高，其中TFC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.11～0.82 mg/g?！瓽V’種子中TPC、TFAC和黃酮醇的含量均為最高，而總黃酮含量最低。種子中TFC質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是26.06～70.97 mg/g。根據(jù)4個圓葉葡萄品種中果皮、果肉、種子酚類物質(zhì)的特點，為滿足不同加工特性需要的品種選擇提供依據(jù)。圓葉葡萄果皮中較為突出的單體酚是阿魏酸，阿魏酸有抗氧化和美白的功效，在美容化妝品領(lǐng)域有較多的應(yīng)用。而葡萄籽中各種單體酚含量差異顯著，‘Noble’中的綠原酸含量突出，綠原酸的抗氧化能力強(qiáng)于咖啡酸、阿魏酸等。綜合來看，紫色品種‘Noble’和‘Alachua’的綜合指標(biāo)要高于綠色品種‘Carlos’和‘GV’，其中以‘Noble’的指標(biāo)含量更加突出，抗氧化活性更高。

4 結(jié)論

通過對4個圓葉葡萄品種的果實品質(zhì)及有機(jī)酸、酚類物質(zhì)和單體酚等營養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行測定和分析比較，揭示了它們的營養(yǎng)特點。綠色品種‘Carlos’和‘GV’的單粒重明顯大于紫色品種‘Noble’和‘Alachua’；其中‘GV’和‘Noble’固酸較高，鮮食口感佳。酒石酸、蘋果酸、琥珀酸和檸檬酸是圓葉葡萄果實中的主要有機(jī)酸，它們在紫色品種的總量大于綠色品種。4個圓葉葡萄品種酚類物質(zhì)含量差異顯著，‘Noble’果皮的總酚含量最高，‘Alachua’果肉中總酚含量最高，‘GV’種子中總酚含量最高。采用HPLC法測定了7種單體酚，果皮中阿魏酸、咖啡酸和香草酸的含量較為突出，并且綠色品種含量高于紫色品種；種子中，‘Alachua’和‘GV’的對羥基苯甲酸含量，‘Noble’的綠原酸含量突出。綜合比較，紫色品種‘Noble’和‘Alachua’具有更高抗氧化活性和更佳的口感，適合鮮食推廣。