張慧會，周 琦，郭力宇，祝遵凌，c

（南京林業(yè)大學(xué) a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.風(fēng)景園林學(xué)院；c.藝術(shù)設(shè)計學(xué)院，江蘇 南京 210037）

香水蓮花Nymphaea hybrid系睡蓮屬Nymphaea多年生水生花卉，其花朵碩大，色澤艷麗，是良好的水面綠化和庭院觀賞花卉。我國目前培育有9 種色系的香水蓮花，故又名“九品香水蓮”。其功能廣泛，既可用于水湖造景和觀賞切花，其花又能泡茶和藥用，同時對大氣、水體和土壤污染等也有一定的凈化作用[1-2]，具有較高的觀賞、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值。9 種品系香水蓮花的花期基本一致，在南京的開花期為6—11月初，夏季6、7、8月份的高溫季節(jié)，香水蓮花單花花期3 ～5 d，秋季9—11月，單花花期5 ～10 d 之久。在開花1 d 時，香水蓮花花藥不開裂或外層花藥少量開裂，散出花粉；開花2 d 時，雄蕊群開裂散出大量的花粉?；ǚ凼侵参镞z傳、繁殖育種與種質(zhì)資源研究工作所必需的材料，也是植物種質(zhì)的形式之一，花粉的活力大小直接決定著雜交育種效率的高低和成敗。目前，人工雜交育種依然是培育睡蓮新品種的有效手段，選擇最佳采粉期以保證較高的花粉活力是保持雜交育種成功率的關(guān)鍵。在睡蓮雜交育種工作中，如果親本自然花期不遇或者涉及到異地雜交問題時，需要對其花粉進(jìn)行保存和運(yùn)輸。因此，研究花粉的貯藏條件對雜交育種和種質(zhì)資源保存具有重要的理論價值和實踐意義。

目前，對香水蓮花的研究主要集中在化學(xué)成分和生物活性等方面[3-5]，而有關(guān)花粉活力變化規(guī)律和貯藏特性的研究尚未見報道。鑒于此，本研究以黃、粉、紫3 種不同花色的香水蓮花品系為材料，對其不同開花天數(shù)的花粉活力、同一天不同時間段花粉活力、不同干燥方法和不同貯藏方法下花粉活力進(jìn)行了研究，旨在探索香水蓮花花粉的最佳采集期、干燥和貯藏的適宜方法，為今后開展香水蓮花雜交育種研究和睡蓮的種質(zhì)資源創(chuàng)新工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以3 個應(yīng)用較廣、花色不同的香水蓮花品系為試材：‘紫花型’香水蓮花（紫色）、‘黃花型’香水蓮花（黃色）和‘粉花型’香水蓮花（粉色），均種植于南京江浦藝蓮苑同一種植池內(nèi)，種植密度為40 cm×40 cm，水深30 ～40 cm，進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉活力的測定

試驗于9月的晴天進(jìn)行，測定前期每天選擇次日將開放（花苞略有松動）的香水蓮花花朵進(jìn)行標(biāo)記。早上10:00—11:00，一次性采集開花1、2、3、4、5 d 的3 種品系的香水蓮花各6 朵，帶回實驗室，從每朵花中選擇3 枚成熟的花藥，將其花粉均勻抖落在干燥培養(yǎng)皿中并混合均勻，采用花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基法測定其花粉活力。具體步驟為：配置前期篩選出的最適培養(yǎng)基（0.001%硼酸+5%蔗糖+1% 瓊脂+20 mg/LCaCl2），取待測花粉播于培養(yǎng)基上，置于30 ℃遮光培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，于顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉的發(fā)芽率，每處理重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察5 個視野，每個視野內(nèi)花粉數(shù)應(yīng)大于100。統(tǒng)計時，萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)是花粉管長度≥花粉粒的直徑?；ǚ勖劝l(fā)率計算公式如下：

式中：K為花粉萌發(fā)率；M為觀測花粉總數(shù)；M1為已萌發(fā)的花粉數(shù)目。

在測定3 種品系香水蓮花開花1 ～5 d 的花粉活力并確定其最佳采粉日后，分別在3 種品系香水蓮花的最佳采粉日，測其一天之內(nèi)不同時間段的花粉活力。從7:30—17:30 每隔1 h 采一次花藥，選擇3 種品系的香水蓮花各5 朵，從每朵花中選擇3 枚成熟的花藥，置于離心管中，帶回實驗室后進(jìn)行花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)，統(tǒng)計發(fā)芽率，分析其花粉活力的日變化規(guī)律，以確定3 種品系香水蓮花花粉的最佳采粉時間。

1.2.2 花粉干燥

在上述試驗篩選出的最佳采粉時間內(nèi)采集3種品系的香水蓮花各5 朵，迅速帶回實驗室后收集花粉。每種品系的香水蓮花花粉分別分成4 份，1 份用于測定新鮮花粉活力，另外3 份采用室內(nèi)通風(fēng)自然干燥法、烘箱干燥法和硅膠干燥法進(jìn)行干燥處理，并采用花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基法對干燥完成后的花粉活力進(jìn)行測定，以篩選花粉適宜的干燥方法。室內(nèi)通風(fēng)自然干燥法是將花粉平鋪于硫酸紙上，置于室內(nèi)通風(fēng)處自然干燥24 h。烘箱干燥法是將花粉置于37 ℃烘箱中干燥24 h。硅膠干燥法是將花粉置于硅膠干燥器中干燥24 h。每隔2 h 觀察一次，并測定花粉含水率。花粉干燥方法參考姚春潮等[6]、吳子龍等人[7]的研究方法，并通過預(yù)實驗做相應(yīng)的改動，當(dāng)花粉含水率為4.5%～6.5%時，即干燥完成，用固體培養(yǎng)基法測定其花粉萌發(fā)率?；ǚ酆矢鶕?jù)以下公式計算：

式中：W為花粉含水率；Gs為新鮮花粉質(zhì)量；Ggo為干燥后的花粉質(zhì)量。

1.2.3 花粉貯藏

在上述試驗篩選出的最佳采粉時間內(nèi)采集3種品系的香水蓮花各10 朵，帶回實驗室后收集花粉。用篩選出的最佳干燥方式干燥花粉，干燥完成后將每種品系的香水蓮花花粉分裝于離心管中，用醫(yī)用注射器抽真空，分別儲存在室溫 （20 ℃）、低溫貯藏（4 ℃）、低溫冷凍貯藏 （-20 ℃）、超低溫冷凍貯藏（-80 ℃）等4 種不同貯藏條件下，分別于5、10、30、50、70、90、120、180 d 后測定各個貯藏條件下的花粉萌發(fā)率，以確定香水蓮花花粉的最佳貯藏條件。低溫貯藏過的花粉先經(jīng)過37 ℃水浴解凍30 min，然后再采用花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基法進(jìn)行花粉活力的測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和圖表制作，用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析以及多重比較（Duncan）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同開花天數(shù)的花粉活力變化

不同開花天數(shù)的香水蓮花花粉活力檢測結(jié)果如圖1 所示。在開花后5 d 內(nèi)，3 種品系香水蓮花的花粉活力均隨時間推移呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。香水蓮花在開花1 d 時，花藥少量散粉，花粉活力較低。開花2 d 時，香水蓮花花藥大量開裂散粉，花粉活力也迅速升高，達(dá)到最高值。在3 個品系中，‘黃花型’香水蓮花的花粉萌發(fā)率最高，為60.32%；‘紫花型’香水蓮花的花粉萌發(fā)率最低，為48.25%。開花3 d 時，花粉萌發(fā)率均呈下降趨勢；到開花5 d 時，花粉萌發(fā)率降至21.67%～28.20%，花粉活力較低。

2.2 花粉活力的日變化規(guī)律

由3 種花色香水蓮花花粉活力高峰期的日活力變化曲線（圖2）可見，一天之中不同時間段香水蓮花花粉活力差異較大，花粉活力呈現(xiàn)單峰曲線趨勢?！S花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉活力的最高值均出現(xiàn)在10:30，分別為60.74%、57.24%、49.54%；11:30 花粉活力次高，分別為54.65%、50.27%、46.89%；其中，9:30—11:30 為3 種花色香水蓮花的最佳采粉時間段。隨著時間的推移，3 種花色香水蓮花花粉萌發(fā)率均逐漸下降，到17:30 花粉萌發(fā)率均降至最低，分別為16.29%、17.73%、7.12%。3 個品系中，‘粉花型’香水蓮花花粉萌發(fā)率的日變幅最大，‘黃花型’次之，‘紫花型’日變幅最小。

圖1 不同采粉期對不同品系香水蓮花花粉活力的影響Fig.1 Effect of different flowering days on pollen viability of yellow, pink and purple N.hybrid

圖2 香水蓮花花粉活力的日變化Fig.2 The diurnal variation of pollen viability of N.hybrid

2.3 不同香水蓮花品系間花粉的活力

在香水蓮花最佳采粉期采集3 種品系香水蓮花花粉，并分別測定其新鮮花粉活力，結(jié)果如表1 所示。3 種品系香水蓮花新鮮花粉活力均在45%以上，不同品系間花粉活力有一定的差異，其中‘黃花型’香水蓮花的花粉活力最高，達(dá)60.61%；其次為‘粉花型’香水蓮花；‘紫花型’香水蓮花花粉活力最低，為48.15%。

2.4 不同干燥方式下香水蓮花花粉的活力變化

3 種花色的香水蓮花新鮮花粉分別經(jīng)室內(nèi)通風(fēng)自然干燥、烘箱干燥和硅膠干燥等3 種處理后，花粉萌發(fā)率見圖3。硅膠干燥法處理過的 3 個品系的香水蓮花花粉萌發(fā)率均顯著高于其他處理（P＜0.05），萌發(fā)率分別為58.31%、54.11%、46.88%，與新鮮花粉相比，花粉仍然具有較高活力；烘箱干燥效果次之；室內(nèi)通風(fēng)自然干燥效果最差。因此，硅膠干燥是3 個香水蓮花品系花粉干燥的最佳方式，并且能較好地保持香水蓮花花粉的活力。

表1 ‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花新鮮花粉的活力Table 1 Determination of pollen viability of yellow,pink and purple N.hybrid

圖3 干燥方法對不同品系香水蓮花花粉萌發(fā)率的影響Fig.3 Effects of drying methods on pollen germination rate of yellow, pink and purple N.hybrid

2.5 不同貯藏條件對香水蓮花花粉萌發(fā)的影響

將3 種花色的香水蓮花花粉分別貯藏在4 種不同的溫度條件下，其花粉活力的變化情況如圖4 ～6 所示。對不同貯藏條件下3 種花色香水蓮花的花粉萌發(fā)率進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果見表2 與表3。

由圖4 ～6 可以看出，在不同貯藏條件下，3 種花色的香水蓮花花粉活力在貯藏期間的變化趨勢基本一致，均隨貯藏時間的延長而呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢。方差分析表明，貯藏溫度、貯藏時間對3 種花色香水蓮花花粉活力的影響均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），貯藏溫度與貯藏時間之間具有極顯著的交互作用 （P＜0.01）（表2）。

圖4 不同貯藏方式及貯藏時間對‘黃花型’香水蓮花花粉活力的影響Fig.4 Variation of yellow N.hybrid pollen vitality with different storage methods and time

圖5 不同貯藏方式及貯藏時間對‘粉花型’香水蓮花花粉活力的影響Fig.5 Variation of pink N.hybridpollen vitality with different storage methods and time

圖6 不同貯藏方式及貯藏時間對‘紫花型’香水蓮花花粉活力的影響Fig.6 Variation of purple N.hybridpollen vitality with different storage methods and time

室溫下貯藏的香水蓮花花粉活力下降速度最快，貯藏5 d 后，‘黃花型’‘粉花型’香水蓮花花粉已完全喪失活力，‘紫花型’香水蓮花在保存10 d 后活力下降為0，說明香水蓮花花粉不耐室溫貯藏。

4 ℃貯藏條件下，3 種品系的香水蓮花花粉活力均隨貯藏時間推移而逐漸降低，但與室溫貯藏相比，花粉的貯藏期限明顯延長。4 ℃貯藏10 d后，‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉活力下降較慢，分別下降了24.37%、33.06%、22.66%。貯藏30 d 后，‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉活力下降幅度較大，分別下降了51.17%、60.58%、57.62%。貯藏至50 d 左右所試‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉完全失去活力，‘黃花型’香水蓮花花粉仍有活力，貯藏90 d后發(fā)芽力喪失。因此，低溫（4 ℃）適于香水蓮花花粉的短期貯存，其貯藏期限以不超過30 d 為宜。

表2 不同貯藏條件下‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉萌發(fā)率的方差分析?Table 2 Variance analysis of pollen germination rate of yellow, pink and purple N.hybrid under different storage conditions

表3 ‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉萌發(fā)率的多重比較結(jié)果?Table 3 Multiple comparisons of pollen germination rate of yellow, pink and purple N.hybridin different treatments

貯藏于-20 ℃和-80 ℃溫度條件下的香水蓮花花粉，其花粉活力的變化趨勢較為一致，但于 -20 ℃溫度條件下貯藏的香水蓮花花粉活力下降速度更大。-20 ℃條件下貯藏30 d 后，‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉活力下降幅度分別為24.28%、16.98%、20.22%，‘黃花型’香水蓮花花粉活力下降幅度最大，從58.31%下降到44.15%?！胺刍ㄐ汀毕闼徎ɑǚ刍盍ψ畹停?4.11%降至44.92%。-80 ℃貯藏條件下的下降幅度分別為14.39%、11.66%、9.34%，‘黃花型’香水蓮花花粉活力下降最顯著，從58.31%降至49.92%?！匣ㄐ汀闼徎ɑǚ刍盍ο陆捣茸钚?，為54.11%～42.5%。-20 ℃條件下貯藏 90 d 后，‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花花粉活力的下降幅度為25.13%～34.15%； -80 ℃貯藏條件下的下降幅度為13.57%～18.8%。 -20 ℃條件下貯藏180 d 后，‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花的花粉活力分別為34.04%、30.51%、28.28%，均還可用于授粉；-80 ℃貯藏條件下貯藏180 d 后，‘黃花型’‘粉花型’‘紫花型’香水蓮花的花粉活力分別為44.66%、41.36%、38.48%，均高于-20 ℃貯藏條件下保存的花粉活力，完全可以用來人工授粉。所以需要長期保存香水蓮花花粉時，以低溫（-20 ℃）冷凍保存或者超低溫（-80 ℃）冷凍保存效果最好。

3 結(jié)論與討論

確定花粉的最佳采集期，以保證花粉最高水平的成熟度，是決定貯藏后花粉活力能否保持較高水平以及后續(xù)雜交育種能否成功的關(guān)鍵[8]。本試驗中，3 種品系香水蓮花花粉活力在開花前2 d 升高幅度均較大；開花3 d，花粉活力均呈下降趨勢。造成香水蓮花花粉活力這一變化趨勢的可能原因是：香水蓮花花粉發(fā)育時間不同步，差別較大，隨著時間推移，香水蓮花花粉總體成熟水平達(dá)到最大，由未成熟發(fā)育至成熟的花粉數(shù)量越來越少，同時伴有大量花粉死亡，導(dǎo)致萌發(fā)率的下降。與劉瑩等[8]研究有關(guān)鐵線蓮品種花粉活力變化趨勢的結(jié)論一致，張亞利等[9]在梅花花粉萌發(fā)率的研究中也有類似結(jié)論。通過對香水蓮花開花后2 d 內(nèi)不同時間段花粉活力的觀測發(fā)現(xiàn)，一天之中不同時間點3 個品系香水蓮花花粉活力差異均較大，花粉活力呈現(xiàn)單峰曲線趨勢，3 種花色香水蓮花花粉活力的最高值均出現(xiàn)在10:30，9:30—11:30 為香水蓮花花粉的最佳采集時間。因此，以香水蓮花為父本進(jìn)行授粉工作時應(yīng)采集第2 天開花散粉的香水蓮花花粉為宜，并選擇在花粉活力較高的9:30—11:30 進(jìn)行為好，避免過早或過遲采集花粉以影響雜交成功率。本試驗中，3 種品系香水蓮花的新鮮花粉活力存在一定的差異，這可能與株體的生長程度、營養(yǎng)狀況、花芽發(fā)育情況等自身因素以及溫度、光照等外部環(huán)境有關(guān)，但具體原因還有待后續(xù)深入研究。

貯藏條件對于花粉生活力的保持具有顯著作用，一般認(rèn)為貯藏溫度和相對濕度是影響花粉活力的關(guān)鍵因素[10]。許多植物的花粉，若先經(jīng)干燥處理后再低溫貯藏，則花粉的保存效果更好，也就是說，在花粉儲存期間，應(yīng)盡可能保持較低的相對濕度[11]。不同植物花粉貯藏時所需的最適含水量不同[12-13]，史鋒厚等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)垂絲海棠的花粉含水量為10.35%時，其在合適的貯藏條件下仍然能長時間地保持較高的花粉萌發(fā)率；高芬等[15]認(rèn)為當(dāng)南京椴花粉貯藏時的含水量低于8.99%時，其花粉活力下降速率較快；李富生等[16]研究了不同無性系蔗茅花粉的貯藏條件，研究發(fā)現(xiàn)蔗茅貯藏時的花粉含水量適宜降至10%以下。本試驗采用的3 種干燥方式中，硅膠干燥法對3 種品系的香水蓮花花粉的干燥效果最佳，并且能較好地保持香水蓮花花粉活力。但本研究只是在香水蓮花花粉貯藏前進(jìn)行了干燥方式的篩選，香水蓮花花粉含水量對萌發(fā)的影響還有待進(jìn)一步研究。

本試驗對3 種品系香水蓮花貯藏特性的研究結(jié)果表明，在4 種貯藏溫度環(huán)境中，3 種品系香水蓮花花粉活力均隨著貯藏時間的推移而逐漸降低，貯藏溫度、貯藏時間對花粉活力的保持具有極顯著影響，貯存溫度與貯存時間之間具有極顯著的交互作用。3 種品系香水蓮花花粉貯藏能力的排序均為：室溫＜4 ℃＜-20 ℃＜-80 ℃，這一結(jié)果表明溫度越低，越有利于香水蓮花花粉活力的保持，花粉的貯藏能力越好，有關(guān)垂絲海棠[14]、茶樹[17]、桃樹[18]的研究中也有類似結(jié)論。3 種品系香水蓮花花粉均不耐室溫貯藏，花粉存放5 ～10 d 即失去活力，這與前人的結(jié)果基本一致[19-21]，可能是因為較高的室內(nèi)溫度增強(qiáng)了花粉的呼吸作用，營養(yǎng)消耗殆盡，同時由于外界環(huán)境的影響使花粉粒脫水死亡。4 ℃適于3 種花色香水蓮花花粉的短期貯藏，貯藏30 d 時花粉萌發(fā)率均在19%以上。而 -20 ℃、-80 ℃的低溫條件適于香水蓮花花粉的長期貯藏，且-80 ℃下花粉的耐貯藏能力最好，貯藏180 d 后3 種品系香水蓮花花粉活力仍在38%以上，說明貯藏溫度是影響香水蓮花花粉壽命的關(guān)鍵因子之一，且貯藏溫度越低，香水蓮花花粉的貯藏壽命越長，主要原因是低溫使花粉細(xì)胞內(nèi)的水分變成固態(tài)而無法被利用，抑制了物質(zhì)代謝，降低了花粉呼吸強(qiáng)度與酶活性，因此延長了花粉的貯藏時間[22]。至于更低溫度條件（-196 ℃）液氮貯藏對香水蓮花花粉的貯藏情況尚待進(jìn)一步研究。