費(fèi)越越，南星羽，余 路，羅 揚(yáng)，高鐘元，許 丹,3

( 1.上海海洋大學(xué)，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，國(guó)家漁業(yè)科學(xué)教育示范中心，上海 201306 )

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)是一種實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的定量方法，因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前已在基因表達(dá)檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[1]。在常用的相對(duì)定量PCR試驗(yàn)中，為準(zhǔn)確獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)量，通常引入合適的內(nèi)參基因來(lái)校正RNA質(zhì)量和反應(yīng)條件等存在的誤差。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同組織、不同發(fā)育階段和不同處理?xiàng)l件下均保持相對(duì)恒定的表達(dá)水平[2]。試驗(yàn)中常選擇管家基因作為內(nèi)參基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、18S核糖體RNA(18S rRNA)和延伸因子(EF-1α)。然而，有研究報(bào)道稱，絕對(duì)穩(wěn)定的基因并不存在，管家基因也只是在特定條件下表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)[3]，如鱖魚(yú)(Sinipercachuasti)胚胎發(fā)育階段β-actin、18S rRNA和GAPDH基因的穩(wěn)定性研究表明，18S rRNA在不同發(fā)育階段表達(dá)水平有顯著差異[4]。達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)14種不同組織中EF-1α、β-actin和GAPDH基因的表達(dá)量研究表明，GAPDH基因表達(dá)有顯著差異[5]。因此，即便是管家基因也要在特定條件下進(jìn)行特定分析。為了提高qRT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確性，通常需要根據(jù)試驗(yàn)處理?xiàng)l件選擇合適的內(nèi)參基因。

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是以興國(guó)紅鯉(Cyprinuscarpiovar.singuonensis)為父本，天然雌核發(fā)育的方正銀鯽(C.auratusgibelio)為母本，經(jīng)人工授精和異精雌核發(fā)育而獲得的子代，因其生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美且易于養(yǎng)殖，頗受人們喜愛(ài)[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前，我國(guó)養(yǎng)殖的異育銀鯽產(chǎn)量超過(guò)3.0×107t，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有非常重要的地位[7-8]。但是近幾年來(lái)，大規(guī)模的集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致其病害問(wèn)題日益嚴(yán)重[9]。其中由鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ，CyHV-2)引發(fā)的造血器官壞死癥導(dǎo)致異育銀鯽大規(guī)模死亡，這給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。目前，針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型引發(fā)異育銀鯽大規(guī)模死亡的致病機(jī)理還不是十分清楚。Lu等[11]為研究鯉皰疹病毒Ⅱ型的致病機(jī)理選取感染后的腎臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證并分析基因的表達(dá)情況；Xia等[12]為探究干擾素對(duì)造血器官壞死癥的防治作用，利用qRT-PCR技術(shù)研究干擾素相關(guān)基因的表達(dá)情況。然而利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行異育銀鯽內(nèi)參基因系統(tǒng)篩選的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。在生物體中各組織均有其獨(dú)特的生理機(jī)能，研究基因在不同組織中的不同表達(dá)量，可為研究基因的功能提供參考[13]。據(jù)報(bào)道，異育銀鯽的腎臟和脾臟是鯉皰疹病毒Ⅱ型病毒富集最主要的組織，篩選出感染腎臟和脾臟在不同時(shí)間點(diǎn)均較穩(wěn)定的內(nèi)參基因可以為研究病毒致病機(jī)理獲得最準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果[14]。魚(yú)類細(xì)胞系的構(gòu)建為魚(yú)類疾病的研究等提供強(qiáng)有力的基礎(chǔ)材料[15]。細(xì)胞水平qRT-PCR內(nèi)參基因的研究將為確?；虮磉_(dá)分析的準(zhǔn)確性提供依據(jù)，從而為細(xì)胞水平探究致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

筆者選用GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4個(gè)管家基因，利用內(nèi)參基因評(píng)估軟件geNorm[16]、Norm Finder[17]、Best Keeper[18]、Delta Ct[19]以及RefFinder[20]對(duì)這4個(gè)內(nèi)參基因分別在健康異育銀鯽的不同組織、鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟、脾臟以及尾鰭細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析，并從異育銀鯽腎臟組織cDNA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選出差異表達(dá)的基因PIN1[21]在腎臟組織不同感染時(shí)間點(diǎn)，對(duì)4個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。最終自4個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選出在健康異育銀鯽的不同組織、鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟、脾臟以及尾鰭細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)均適用的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康異育銀鯽 [體長(zhǎng)(10.1±0.2) cm，質(zhì)量(90.2±0.12) g] 購(gòu)于江蘇四大家魚(yú)原種場(chǎng)，在上海海洋大學(xué)動(dòng)物房(23±0.5) ℃暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間每日投喂顆粒飼料1次(投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的3%)。經(jīng)過(guò)7 d的暫養(yǎng)，隨機(jī)分為5組進(jìn)行腹腔注射鯉皰疹病毒Ⅱ型病毒懸液(每組注射量為7×103.9±0.22pfu/mL)[22]，對(duì)照組注射1 mL磷酸緩沖鹽溶液。注射后，分別在0、6、12、24 h和120 h時(shí)間點(diǎn)取6尾魚(yú)，解剖取腦、脾臟、腎臟、肌肉、鰓、腸、肝臟和心臟組織塊，迅速放置于液氮中速凍后暫存于-80 ℃冰箱中。

本試驗(yàn)的尾鰭細(xì)胞[22]和鯉皰疹病毒Ⅱ型由國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)實(shí)驗(yàn)室保存[23]。尾鰭細(xì)胞用規(guī)格為T(mén)75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)18瓶，傳代48 h(細(xì)胞融合度至80%～90%)，棄除原來(lái)培養(yǎng)基(10%FBS，M199培養(yǎng)基)，加入2 mL鯉皰疹病毒Ⅱ型病懸液(7×103.9±0.22pfu/mL)[22]，對(duì)照組加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液孵育2 h之后，注入8 mL新鮮培養(yǎng)基(2%FBS，M199培養(yǎng)基)，放置27 ℃培養(yǎng)箱。分別在0、1、2、3、4 d和5 d各時(shí)間點(diǎn)收集3瓶細(xì)胞，放置冰箱-80 ℃保存。

1.2 總RNA的提取和cDNA 的合成

健康異育銀鯽的不同組織、鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟、脾臟以及細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的總RNA均使用試劑盒TRIzol?Reagent (Thermo Scientific, 美國(guó))提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。使用NanoDrop?2000c核酸分析儀(Thermo Scientific, 美國(guó))檢測(cè)RNA的含量及純度，稀釋后保持其質(zhì)量濃度為500～1000 ng/μL。分別從不同處理?xiàng)l件下的樣品中取2 μg RNA，使用Recombinant DNase Ⅰ(RNase-free) (TaKaRa)操作進(jìn)行去DNA處理，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，存儲(chǔ)于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物來(lái)源

自異育銀鯽腎臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得GAPDH基因的部分序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物用于qRT-PCR(表1)。另外β-actin[24]、18S rRNA[25]、EF-1α[26]、PIN1[21]基因的引物序列來(lái)源于已發(fā)表的文章。

表1 4種候選內(nèi)參基因的引物信息

1.4 qRT-PCR試驗(yàn)

qRT-PCR使用 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)按說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)在BIO RAD CFX96TMReal-Time System定量PCR儀完成，25 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系: TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (2×) 12.5 μL，cDNA (<100 ng) 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，PCR Forward/Reverse Primer(10 μmol/L) 1 μL，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)選用geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct對(duì)qRT-PCR產(chǎn)生的原始Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用Ref Finder對(duì)4種軟件的分析結(jié)果進(jìn)行綜合排名，最終給出一個(gè)穩(wěn)定性排名。

1.6 內(nèi)參基因的驗(yàn)證

取感染鯉皰疹病毒Ⅱ型病毒的異育銀鯽在0、6 h和72 h時(shí)的腎臟組織提取RNA(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，為使研究更能區(qū)分內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，選取已驗(yàn)證在病毒感染不同時(shí)間點(diǎn)的腎臟組織表達(dá)差異較大的PIN1[21]基因?yàn)槟康幕?，分別以EF-1α、β-actin、18S rRNA和GAPDH為內(nèi)參基因，按照1.3中qRT-PCR試驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，引物見(jiàn)表1。內(nèi)參基因驗(yàn)證的相對(duì)表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，使用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 引物的特異性評(píng)估

cDNA初始模板質(zhì)量濃度控制在200 ng/μL，以10倍梯度稀釋的對(duì)數(shù)函數(shù)與循環(huán)閾值(Ct值)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算擴(kuò)增效率，r2變化為0.993～0.997。所有基因的溶解曲線均為明顯單一峰(圖1)，且樣品PCR重復(fù)性較好，表明引物特異性較好，不存在引物二聚體。

圖1 4對(duì)引物的熔解曲線

2.2 健康的異育銀鯽不同組織候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估

檢測(cè)健康異育銀鯽8種組織(腦、脾臟、腎臟、肌肉、鰓、腸、肝臟和心臟)中4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)量，所得Ct值分布見(jiàn)圖2。不同組織中4個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值為7.45～26.27，其中GAPDH表達(dá)水平受組織影響差異較大，最大值和最小值相差10.17個(gè)循環(huán)。18S rRNA的Ct值變化較小，最大值和最小值相差2.18個(gè)循環(huán)。18S rRNA的表達(dá)Ct值過(guò)小，這可能是因?yàn)?8S rRNA是一種核糖體RNA，約占RNA總量的80%，呈現(xiàn)高豐度表達(dá)[27-28]。EF-1α和β-actin在這8種組織中穩(wěn)定性較好，均穩(wěn)定在17～18個(gè)循環(huán)。

圖2 健康異育銀鯽的不同組織候選內(nèi)參基因Ct值分布

健康異育銀鯽的不同組織內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序結(jié)果顯示，Delta Ct不需要限定起始的總RNA的含量，可直接對(duì)同一處理?xiàng)l件下不同基因進(jìn)行Ct值兩兩比較，獲得更精確的結(jié)果。Delta Ct對(duì)異育銀鯽的不同組織4個(gè)候選內(nèi)參基因的評(píng)估結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性排序?yàn)镋F-1α>β-actin>18S rRNA>GAPDH。

BestKeepe主要通過(guò)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因表達(dá)量的配對(duì)相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)確定內(nèi)參基因。其分析結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性排序?yàn)棣?actin>EF-1α>GAPDH>18S rRNA。

Normfinder通過(guò)一個(gè)群體計(jì)算不同候選基因得到穩(wěn)定值，這個(gè)數(shù)值越小基因則越穩(wěn)定。Normfinder的分析結(jié)果與Delta Ct和BestKeeper的分析結(jié)果幾乎相同，與Delta Ct的分析結(jié)果完全一致，各基因穩(wěn)定性排序?yàn)镋F-1α>β-actin>18S rRNA>GAPDH。

geNorm與Normfinder算法類似，不同的是geNorm對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行兩兩比對(duì)計(jì)算得到各基因geNorm穩(wěn)定值(亦稱M值)，并通過(guò)geNorm穩(wěn)定值對(duì)基因穩(wěn)定性進(jìn)行排序，geNorm穩(wěn)定值越小，表達(dá)越穩(wěn)定。其分析結(jié)果表明，EF-1α 和β-actin在異育銀鯽的不同組織中的表達(dá)同樣較穩(wěn)定。由圖3可見(jiàn)，EF-1α和β-actin的geNorm穩(wěn)定值均為0.304。

Ref Finder是一種綜合分析的軟件可以根據(jù)每個(gè)軟件的排名分配適當(dāng)?shù)臋?quán)重并計(jì)算其權(quán)重的幾何平均值為最終的總排名。其分析結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性排序?yàn)镋F-1α>β-actin>18S rRNA>GAPDH。

綜合4種軟件(Ref Finder)分析結(jié)果，結(jié)合geNorm穩(wěn)定值以及4個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)量Ct值，確定EF-1α和β-actin為健康異育銀鯽的不同組織穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

表2 健康異育銀鯽的不同組織內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序

圖3 健康異育銀鯽的不同組織geNorm穩(wěn)定值

2.3 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織在不同時(shí)間點(diǎn)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估

檢測(cè)鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織在不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24、48 h和120 h)4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)Ct值分布見(jiàn)圖4。4個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值為8.79～24.58，其中GAPDH表達(dá)水平受感染時(shí)間影響差異較大，最大值和最小值相差3.21個(gè)循環(huán)。18S rRNA的Ct值變化較小，最大值和最小值相差1.53個(gè)循環(huán)。18S rRNA在不同感染時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量都過(guò)高，GAPDH在不同感染時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量都較β-actin和EF-1α的表達(dá)量低。相對(duì)而言，β-actin和EF-1α在4個(gè)候選內(nèi)參基因中表達(dá)量較穩(wěn)定。

圖4 CyHV-2感染異育銀鯽腎臟組織不同時(shí)間點(diǎn)候選內(nèi)參基因Ct值分布

Delta Ct的分析結(jié)果與Normfinder的分析結(jié)果一致，為β-actin>18S rRNA>GAPDH>EF-1α。BestKeeper的分析結(jié)果與前者略有不同，為EF-1α>18S rRNA>β-actin>GAPDH。geNorm的分析結(jié)果表明，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織不同時(shí)間點(diǎn)18S rRNA和β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性一致(表3)。18S rRNA和β-actin的geNorm穩(wěn)定值均為0.535(圖5)。由于18S rRNA的Ct值過(guò)小，容易在試驗(yàn)中造成誤差[29]，所以綜合4種軟件分析結(jié)果，結(jié)合geNorm穩(wěn)定值以及4個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)Ct值，最終確定β-actin最穩(wěn)定。

表3 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序

圖5 CyHV-2感染異育銀鯽腎臟組織不同時(shí)間點(diǎn)geNorm穩(wěn)定值

2.4 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織在不同時(shí)間點(diǎn)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估

檢測(cè)鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織在不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24、48 h和120 h)候選內(nèi)參基因的表達(dá)量Ct值分布見(jiàn)圖6。4個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值為9.63～31.34，其中18S rRNA表達(dá)水平受感染時(shí)間影響差異較大，最大值和最小值相差21.71個(gè)循環(huán)。GAPDH的Ct值變化較小，最大值和最小值相差6.04個(gè)循環(huán)，但GAPDH的表達(dá)量都較EF-1α和β-actin的表達(dá)低。而EF-1α和β-actin的表達(dá)量均穩(wěn)定在15～23。

圖6 CyHV-2感染異育銀鯽脾臟組織不同時(shí)間點(diǎn)候選內(nèi)參基因Ct值分布

Delta Ct的分析結(jié)果與geNorm的分析結(jié)果幾乎一致，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織不同時(shí)間點(diǎn)EF-1α和β-actin穩(wěn)定性較好。其中g(shù)eNorm的穩(wěn)定值結(jié)果顯示，EF-1α和β-actin的穩(wěn)定性相差不大(圖7)。與Delta Ct 和geNorm的分析結(jié)果不同，BestKeeper與Normfinder的分析結(jié)果表明，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織中EF-1α和GAPDH的表達(dá)相對(duì)較穩(wěn)定(表4)。綜合4種軟件分析結(jié)果，結(jié)合geNorm穩(wěn)定值以及4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)Ct值，最終確定，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織不同時(shí)間點(diǎn)EF-1α相對(duì)比較穩(wěn)定。

圖7 CyHV-2感染異育銀鯽脾臟組織不同時(shí)間點(diǎn)geNorm穩(wěn)定值

表4 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序

2.5 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽尾鰭細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估

檢測(cè)鯉皰疹病毒Ⅱ型感染尾鰭細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、3、4 d和5 d)，4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)量Ct值分布見(jiàn)圖8。4個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值為7.39～36.54，其中GAPDH表達(dá)水平受感染時(shí)間影響差異較大，最大值和最小值相差4.67個(gè)循環(huán)。18S rRNA的Ct值變化較小，最大值和最小值相差2.98個(gè)循環(huán)。β-actin和EF-1α在細(xì)胞感染不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量Ct值均相對(duì)穩(wěn)定(圖9，表5)。

2.6 內(nèi)參基因的驗(yàn)證

研究表明，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織過(guò)程中，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，病毒拷貝數(shù)逐漸升高，PIN1基因的mRNA表達(dá)量顯著下降[21]。為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，本次定量驗(yàn)證中添加6 h的試驗(yàn)組。經(jīng)過(guò)SPSS 19.0分析，試驗(yàn)結(jié)果和腎臟組織轉(zhuǎn)錄組cDNA的測(cè)序結(jié)果(TPM值)見(jiàn)圖10。PIN1基因以GAPDH為內(nèi)參基因時(shí)，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0 h和72 h時(shí)的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果不符；PIN1基因以18S rRNA為內(nèi)參基因，目的基因表達(dá)在0 h和72 h沒(méi)有顯著差異。相反，以β-actin和EF-1α為內(nèi)參基因時(shí)，PIN1基因在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0 h和72 h時(shí)的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，且差異極顯著(P<0.01)。隨著感染時(shí)間的增加，PIN1基因以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參分別在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0、6 h和72 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)。而PIN1基因以EF-1α基因?yàn)閮?nèi)參在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0 h和72 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)(圖11)，但在PIN1基因以EF-1α為內(nèi)參在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織6 h和72 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量無(wú)極顯著差異(P>0.01)。因此，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟組織中β-actin為其最佳的內(nèi)參基因。

圖8 CyHV-2感染GiCF細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)候選內(nèi)參基因Ct值分布

圖9 CyHV-2感染GiCF細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)geNorm 穩(wěn)定值

表5 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)參基因的穩(wěn)定排名情況

圖10 PIN1基因分別以4個(gè)候選內(nèi)參基因?yàn)閮?nèi)參在腎臟中的表達(dá)量

圖11 PIN1在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序中的表達(dá)量

3 討 論

3.1 內(nèi)參基因在不同組織中穩(wěn)定性分析

為了使基因在qRT-PCR試驗(yàn)中的相對(duì)表達(dá)結(jié)果更可靠，篩選最佳的內(nèi)參(管家)基因是必不可少的。研究水產(chǎn)動(dòng)物常用的管家基因很多，18S rRNA、GAPDH、EF-1α和β-actin是4個(gè)較為常用的內(nèi)參基因。其中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是一種參與糖酵解和糖異生等循環(huán)過(guò)程的關(guān)鍵酶[30]；延伸因子(EF-1α)是參與蛋白質(zhì)翻譯的重要因子[31]；18S核糖體RNA(18S rRNA)是一類編碼核糖體小亞基RNA[32]；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分之一。然而不同物種、不同組織、不同發(fā)育時(shí)期以及不同處理?xiàng)l件，管家基因的穩(wěn)定性并不是一成不變的，如在褐牙鲆胚胎不同發(fā)育時(shí)期18S rRNA是其最合適的內(nèi)參基因[33]；鱖魚(yú)的不同組織中GAPDH為其內(nèi)參基因[34]。因此只有篩選出合適的內(nèi)參基因才能保證qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本試驗(yàn)選取健康異育銀鯽的8種不同組織為研究對(duì)象，選擇EF-1α、GAPDH、18S rRNA和β-actin 4個(gè)候選管家基因，結(jié)合4種內(nèi)參基因分析軟件，geNorm穩(wěn)定值以及4個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)量Ct值，最終分析結(jié)果表明，β-actin和EF-1α基因?yàn)榻】诞愑y鯽的不同組織中最穩(wěn)定的基因。董捷[26]研究草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)不同組織基因表達(dá)豐度時(shí)，發(fā)現(xiàn)18S rRNA和β-actin是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；Olsvik等[35-36]比較了大西洋鮭(Salmosalar)不同組織中β-actin、RPS20和EF-1α的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)EF-1α基因的表達(dá)最穩(wěn)定；茅華華等[37]發(fā)現(xiàn)斑鱧(Channamaculata)在成魚(yú)不同組織中β-actin基因最穩(wěn)定。健康異育銀鯽的不同組織內(nèi)參基因β-actin和EF-1α的穩(wěn)定性與上述研究都有相似之處。這可能因?yàn)椴煌奈锓N中管家基因的轉(zhuǎn)錄水平不同，但是其在特定組織的穩(wěn)定性可能存在一致性。在脊椎動(dòng)物魚(yú)類和無(wú)脊椎動(dòng)物貝類中，雖然不同的物種中β-actin和EF-1α基因表達(dá)量不同，如草魚(yú)[26]、鱸鯉(Percocyprispingi)[38]、鱖魚(yú)[4]、建鯉 (Cyprinuscarpiovar.jian)[39]、皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannai)[40]、合浦珠母貝(Pinctadafucata)[41]和三角帆蚌 (Hypriopsiscumingii)[42]，但是其仍然具有良好的穩(wěn)定性，這與本試驗(yàn)中的結(jié)果一致，表明β-actin和EF-1α基因同樣可以作為魚(yú)類與海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的內(nèi)參基因。

3.2 內(nèi)參基因在病毒刺激下穩(wěn)定性分析

生物體通常都有自我保護(hù)的意識(shí)，在病毒刺激下會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為研究病毒刺激下免疫基因的表達(dá)提供理論基礎(chǔ)。

Jorgensen等[43]用傳染性鮭魚(yú)貧血病毒(Infectioussalmonanemiavirus, ISAV)感染大西洋鮭和腎細(xì)胞發(fā)現(xiàn)感染不同時(shí)間點(diǎn)組織水平18S rRNA和EF-1α最穩(wěn)定，而細(xì)胞水平僅有18S rRNA最穩(wěn)定。與上述試驗(yàn)結(jié)果類似的是本試驗(yàn)用鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的脾臟組織不同時(shí)間點(diǎn)，EF-1α為其穩(wěn)定的內(nèi)參基因。不同的是本試驗(yàn)選用鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟和尾鰭細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)β-actin為其最穩(wěn)定的基因。這與Julin等[44]用傳染性胰腺壞死病毒(Infectiouspancrieaticnecrosisvirus, IPNV)感染大西洋鮭不同時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)EF-1α和β-actin的穩(wěn)定性最高的結(jié)論相似。有研究表明，異育銀鯽的腎臟是鯉皰疹病毒Ⅱ型的主要復(fù)制點(diǎn)，脾臟是淋巴細(xì)胞移居和接受抗原刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所[9]。所以在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟、脾臟不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性不同，這可能與病毒刺激條件下，基因在組織間的選擇性表達(dá)有關(guān)。此外本試驗(yàn)由于18S rRNA的表達(dá)過(guò)于豐富，可能會(huì)比目的基因的表達(dá)還要高，容易在試驗(yàn)過(guò)程中和數(shù)據(jù)分析時(shí)造成誤差，且有研究表明，18S rRNA的轉(zhuǎn)錄容易受到生物因素和藥物因素影響[29]。EF-1α是真核生物的延伸因子，其在組織中穩(wěn)定性已經(jīng)被大量的學(xué)者研究證明，如大鯢(Andriasdavidianus)在細(xì)菌的感染下組織的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)顯示，EF-1α是穩(wěn)定的內(nèi)參基因[45]。本試驗(yàn)的結(jié)果分析也表明，EF-1α可作為病毒刺激下穩(wěn)定的內(nèi)參基因。β-actin是一種微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，在抵御某些病毒和病原微生物的入侵時(shí)，β-actin的分泌穩(wěn)定，可以用作為內(nèi)參基因?qū)ζ渌虻臉?biāo)準(zhǔn)化處理[46]。因此，在病毒刺激下，β-actin較適合作為異育銀鯽腎臟組織和細(xì)胞水平qRT-PCR的內(nèi)參基因。

PIN1是一種高度保守的特異的多肽脯氨酰基順?lè)串悩?gòu)酶具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能[47]。數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序結(jié)果顯示，PIN1基因表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，本試驗(yàn)的qRT-PCR結(jié)果也顯示，以β-actin為內(nèi)參時(shí)PIN1基因表達(dá)量符合測(cè)序結(jié)果。Lu等[22]在異育銀鯽腎臟組織的cDNA文庫(kù)測(cè)序過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，PIN1基因表達(dá)量在感染魚(yú)體過(guò)程中呈現(xiàn)組織水平的下調(diào)趨勢(shì)與本試驗(yàn)結(jié)果相符合，這可能在病毒的刺激下PIN1基因的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖的功能受阻。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，篩選出異育銀鯽組織水平和細(xì)胞水平中均較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。試驗(yàn)結(jié)果表明，在健康異育銀鯽的不同組織中β-actin和EF-1α均可作為其內(nèi)參基因。在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟以及細(xì)胞系不同時(shí)間點(diǎn)，β-actin為其內(nèi)參基因；脾臟組織中，EF-1α為其內(nèi)參基因。通過(guò)在異育銀鯽腎臟組織不同感染時(shí)間點(diǎn)，PIN1基因的表達(dá)分析也進(jìn)一步驗(yàn)證了其內(nèi)參基因的適用性，本研究將為探究異育銀鯽基因的qRT-PCR提供理論依據(jù)，為深入查明異育銀鯽體內(nèi)及體外宿主的基因表達(dá)與病毒相互作用奠定基礎(chǔ)。