李明遠 巫相宏 閉奇 文偉明 鄭鵬飛 吳成 竇慧 陳基源

【摘要】目的 探討磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的特異性抑制劑（LY294002，LY）通過Toll樣受體4（TLR4）相關的PI3K信號通路對脂多糖主要活性成分Kdo2 -lipid A（KLA）誘導人冠狀動脈內皮細胞（HCAEC）中TLR4、PI3K及縫隙連接蛋白43（Cx43）mRNA表達的影響及其可能的機制。方法 體外培養(yǎng)HCAEC，將HCAEC隨機分為Con組（空白對照組）、KLA組（0.05 mg/L）、LY組（2.5 ?M）、LY+KLA組（LY 2.5 ?M+KLA 0.05 mg/L），用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測以上分組中TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表達量改變。結果 與Con組相比，KLA組TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），LY組PI3K mRNA表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與KLA組相比，KLA+LY組TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 KLA刺激促進HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表達增加，LY294002通過部分或全部抑制由TLR4/PI3K信號通路減少KLA刺激的HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表達，保護Cx43的正常生理功能發(fā)揮抗炎作用抵抗動脈粥樣硬化。

【關鍵詞】Toll樣受體4;磷脂酰肌醇3-激酶;縫隙連接蛋白43;人冠狀動脈內皮細胞

【中圖分類號】R543.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.4..02

THE regulation of TLR4/PI3K signaling pathway on KLA-mediated

Connexins43 expression in human coronary endothelial cells

LI? Ming-yuam， WU? Xiang-hong*， BI? Qi， WEN? Wei-ming，

ZHENG? Peng-fei， WU? Cheng， DOU? Hui， CHEN? Ji-yuan

（Department of cardiovascular medicine， the First Affiliated Hospital

of Guangxi Medical University，Guangxi Nanning 530021，China）

【Abstract】Objective To investigate the role of LY294002 in Kdo2 -lipid A（KLA）-mediated TLR4、PI3K、Cx43 expression in human coronary endothelial cells（HACEC）.Methods TLR4、PI3K and Cx43 expression was detected by RT-PCR in HCAEC after 24h treatment.Results Compared with the control group，the expression of TLR4、PI3K and Cx43 was up-regulated in the KLA group（P<0.05），while PI3K was down-regulated in the LY group（P<0.05）.Furthermore，Compared with the KLA group， the expression of TLR4、PI3K and Cx43 was significant down-regulated when co-treatment with LY and KLA（P<0.05）.Conclusion LY294002 protected the normal physiological functions of Cx43 and exerting anti-inflammatory effects to fight atherosclerosis.

【Key words】Toll-like Receptor4;Phosphoinositide3-Kinase;Connexins43;Human Coronary Artery Endothelial Cell

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是威脅人類健康的多種心血管疾病共同的病理生理基礎，其特點是以內皮細胞功能障礙和炎癥因子等不斷在動脈壁造成損傷的慢性炎癥反應。人的心臟組織中存在TLR4受體，TLR4受體激活使胞外信號得以轉導到胞內，TLR4受體與機體應激、炎癥、損傷、壞死密切相關[1] KLA是脂多糖（LPS）的主要活性部位，是一種強烈的炎癥啟動因子，可通過TLR4受體導致炎癥反應的發(fā)生。PI3K信號通路對細胞生存、增殖、分化、凋亡的功能起到非常重要的調控作用[2]。Cx43是介導細胞間小分子物質和信號的傳遞的主要蛋白，Cx43對內皮細胞的正常生理功能有重要調控作用。鑒于此，本實驗旨在觀察PI3K特異性抑制劑LY294002對KLA刺激的HCAEC 中TLR4、PI3K及CX43 mRNA表達量的影響，探討LY294002對冠狀動脈內皮細胞縫隙連接蛋白功能的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及材料

HCAEC細胞株、內皮細胞培養(yǎng)基（ECM）購自美國Sciencell公司，KLA購自美國Avanti Polar Lipids公司，LY294002購自美國CST公司， RNA提取試劑盒購自日本TAKARA公司，引物由上海生工生物股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將HCAEC種植于含4mLECM完全培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶內，置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，新植入的冠脈內皮細胞隔天換液，視生長情況以后48～72 h換液，待培養(yǎng)瓶中細胞生長至90%密度左右即可傳代。

1.2.2 實驗分組

將HCAEC分為以下4組：空白對照組（Con組）、KLA組（0.01 mg/L）、LY組（2.5 ?M）、LY+KLA組（LY2.5 ?M+KLA0.01 mg/L）。

1.3 RT-PCR法檢測

采用PCR法檢測各組HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA表達水平，應用ABI Prism 7500序列檢測系統(tǒng)進行PCR反應。以各組GADPH擴增產物為內參照，用2△△CT法計算各組TLR4、PI3K、Cx43 mRNA相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，其中兩組間的比較采用SNK檢驗，當P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

RT-PCR法檢測各組冠狀動脈內皮細胞中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA相對表達量：結果顯示，與Con組比較，KLA組TLR4、PI3k、Cx43 的mRNA表達量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），LY組PI3K表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與KLA組比較，KLA+LY組TLR4、PI3k、Cx43 的mRNA表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

3 討 論

動脈粥樣硬化的形成與血管內皮損傷、平滑肌遷移、脂質浸潤及血管持續(xù)性的慢性臨床炎癥反應息息相關[3]，抗炎的失衡可能是動脈粥樣硬化發(fā)生與進展的關鍵所在。TLR4信號通路通過多個途徑參與動脈粥樣硬化的起始和進展及一系列AS相關的細胞因子、炎癥因子的合成與釋放等環(huán)節(jié)[4]。PI3K通過影響血管內皮細胞、血管平滑肌細胞等進而影響動脈粥樣硬化的發(fā)展。在炎癥反應的進程中，PI3K信號通路的激活可使細胞產生大量的炎性因子[2]。Kang Q等[5]的研究發(fā)現抑制PI3K、AKT、TNF-a的mRNA表達對高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE基因敲除的小鼠具有抗動脈粥樣硬化的作用。Cx43在細胞膜形成縫隙連接起到細胞間的通訊作用。在開放狀態(tài)下，炎癥因子可從縫隙連接中通過使CX蛋白羧基端磷酸化，蛋白構象發(fā)揮變化，進而調節(jié)縫隙連接的功能。CHEN等[6]發(fā)現動脈粥樣硬化的冠心病患者Cx43和Cx46的表達顯著上調，細胞縫隙連接功能紊亂可能是動脈粥樣硬化性疾病發(fā)病的原因之一。

本研究采用KLA誘導人冠狀動脈內皮細胞炎性損傷構建內皮早期動脈硬化模型，采用PI3K特異性阻滯劑LY進行干預。本研究從細胞水平證實KLA可能通過激活TLR4/PI3K信號傳導通路及其下游信號傳導，上調TLR4、PI3K、Cx43蛋白和mRNA表達，進而調節(jié)促炎細胞因子表達，參與AS的炎癥反應。使用PI3K信號通路特異抑制劑LY294002可以下調KLA誘導的TLR4、PI3K、cx43蛋白和mRNA的表達，進而減少AS炎癥反應形成。為控制AS炎癥反應提供更充足的實驗依據。我們的這些發(fā)現也許能夠冠狀動脈粥樣硬化的基礎研究和臨床治療提供新的思路。

參考文獻

[1] LIN J，KAKKAR V，LU X.Essential Roles of Toll-Like Receptors in Atherosclerosis[J].Curr Med Chem，2016，23（5）：431-454.

[2] FRUMAN D A，CHIU H，HOPKINS B D， et al. The PI3K Pathway in Human Disease[J].Cell，2017，170（4）：605-635.

[3] KOBIYAMA K，LEY K.Atherosclerosis[J].Circ Res，2018，123（10）：1118-1120.

[4] ROSHAN M H，TAMBO A，PACE N P.The Role of TLR2，TLR4，and TLR9 in the Pathogenesis of Atherosclerosis[J].Int J Inflam，2016，2016：1532832.

[5] KANG Q，WEIHONG L，HONGXU L，et al.Effect of Compound Chuanxiong Capsule on Inflammatory Reaction and PI3K/Akt/NF-kB Signaling Pathway in Atherosclerosis[J].Evidence-Based Complementary Alternative Medicine，2015：1-9.

[6] CHEN，CHEN，GE，et al.Monocytic cell junction proteins serve important roles in atherosclerosis via the endoglin pathway[J].Molecular Medicine Reports，2017.