楊得志 潘運(yùn)迎 覃興善 陳柳紅 黃曙院

【摘要】 目的：探討程序死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其臨床意義。方法：收集2015年3月-2019年3月本院行根治手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者86例的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)癌組織及癌旁組織MMP2和PD-L1蛋白的表達(dá)水平，分析MMP2和PD-L1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果：MMP2和PD-L1蛋白均表達(dá)于目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。結(jié)直腸癌組織中MMP2和PD-L1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于癌旁組織（P<0.05）。不同分化程度與pTNM分期的結(jié)直腸癌組織MMP2與PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且不同腫瘤最大徑和CEA表達(dá)情況的結(jié)直腸癌組織MMP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PD-L1和MMP2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌具有相關(guān)性（rs=0.246，P=0.028）。結(jié)論：PD-L1和MMP2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌組織具有相關(guān)性，其高表達(dá)率可能與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌 細(xì)胞程序死亡配體1 基質(zhì)金屬蛋白酶-2

Expressions of PD-L1 and MMP2 in Colorectal Cancer and Its Clinical Significances/YANG Dezhi， PAN Yunying， QIN Xingshan， CHEN Liuhong， HUANG Shuyuan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： 019-023

[Abstract] Objective： To investigate the expression of programmed death ligand 1 （PD-L1） and matrix metalloproteinase 2 （MMP2） in colorectal cancer and its clinical significance. Method： Cancer tissue and tissue adjacent to the tumour specimens were collected from 86 patients with colorectal cancer underwent radical surgical treatment in our hospital from March 2015 to March 2019. The expression of MMP2 and PD-L1 protein in cancer tissues and paracancer tissues were detected by immunohistochemistry. The relationship between the expression of MMP2 and PD-L1 and the clinicopathological characteristics of colorectal cancer were analyzed. Result： MMP2 and PD-L1 were expressed in the cytoplasm and membrane of the target cell. The positive rates of MMP2 and PD-L1 protein expression in colorectal cancer tissue were significantly higher than those in tissue adjacent to the tumour （P<0.05）. The positive expression rates of MMP2 and PD-L1 proteins in colorectal cancer tissues with different differentiation degrees and pTNM stages were compared， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the positive expression rate of MMP2 protein in colorectal cancer tissues with different tumor maximum diametral and CEA expression were compared， the differences were statistically significant （P<0.05）. The positive expression of PD-L1 and MMP2 were correlated with colorectal cancer （rs=0.246， P=0.028）. Conclusion： The expression of PD-L1 and MMP2 proteins is correlated with colorectal cancer tissues， and the high expression rate may be related to the development of colorectal cancer.

[Key words] Coloretcal cancer Programmed death ligand 1 Matrix metalloproteinase-2

First-authors address： Traditional Chinese Medical Hospital of Liuzhou， Liuzhou 545001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.005

隨著生活習(xí)慣方式等因素的改變，結(jié)直腸癌已經(jīng)成為危害我國(guó)人民生命健康的主要腫瘤之一。然而特別令人遺憾的是結(jié)直腸癌的預(yù)后一直不佳，因此全國(guó)的相關(guān)研究人員長(zhǎng)期從多方面努力尋求突破。值得關(guān)注的是近年來(lái)有科學(xué)家證實(shí)人體的免疫反應(yīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程及多種治療方式的反應(yīng)中都具有至關(guān)重要的意義[1-2]。正常生理情況下，人體通過(guò)免疫負(fù)反饋方式調(diào)控炎癥的合理反應(yīng)程度，避免過(guò)度反應(yīng)，從而達(dá)到保持健康的狀態(tài);而在病理情況下，狡猾的腫瘤細(xì)胞則能夠通過(guò)模擬這些負(fù)反饋調(diào)控通路上的重要分子或促進(jìn)機(jī)體表達(dá)這些重要分子來(lái)逃避免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)腫瘤的生存和發(fā)展[3]。Bertucci等[4]研究表明，PD-L1在乳腺癌等多種腫瘤組織和免疫細(xì)胞中均可高表達(dá)。PD-L1可以通過(guò)與其配體PD-1相結(jié)合而發(fā)生作用，即形成所謂的PD-1/PD-L1調(diào)節(jié)通路。該通路能夠通過(guò)調(diào)節(jié)T和B淋巴細(xì)胞的活化與增殖，來(lái)抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的攻擊，即所謂的腫瘤免疫逃逸[5]。在機(jī)體中，阻斷PD-1/PD-L1通路可恢復(fù)或增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能，從而使腫瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)和被攻擊，保持甚至增強(qiáng)機(jī)體正常的免疫監(jiān)視和防御功能[6]。但是，PD-1/PD-L1通路具體通過(guò)何種下游通路的級(jí)聯(lián)效應(yīng)來(lái)實(shí)施腫瘤免疫逃逸功能尚不十分清楚。因此本研究期望通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌和癌旁組織中PD-L1與MMP2蛋白表達(dá)情況，分析此兩種蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征之間是否具有相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 收集2015年3月-2019年3月于本院行根治手術(shù)治療的86例結(jié)直腸腺癌患者的癌組織和癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受化療和放療，術(shù)后常規(guī)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理相關(guān)基本信息不完整者。其中男50例，女36例;年齡28歲～79歲，平均（62±12）歲，其中<60歲35例，≥60歲51例;腫瘤發(fā)生部位：結(jié)腸42例，直腸44例;腫瘤最大徑：<5.0 cm 56例，≥5.0 cm 30例;組織學(xué)分化程度：高分化12例，中分化25例，低分化49例;pTNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期27例，Ⅲ期29例，Ⅳ期20例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移31例，無(wú)轉(zhuǎn)移

55例;常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物血生化檢測(cè)：癌胚抗原（CEA）陽(yáng)性40例，陰性46例;糖類抗原19-9（CA19-9）陽(yáng)性15例，陰性71例。以上所有病理材料送檢之前已與患者或代理人簽訂送檢組織滿足診斷后允許進(jìn)行科研的同意書，并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 MMP2鼠抗人單克隆抗體（克隆號(hào)：Clone OTI4A11，貨號(hào)：TA806846）、PD-L1鼠抗人單克隆抗體（克隆號(hào)：MRQ-22，貨號(hào)：ZM-0381）和免疫組織化學(xué)二抗（SP法）試劑盒均購(gòu)自中杉金橋（北京）生物公司。

1.3 方法 檢測(cè)MMP2和PD-L1蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程按免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行并且設(shè)立了標(biāo)準(zhǔn)的外部對(duì)照：常規(guī)制作4 μm厚石蠟切片，然后烤片脫蠟至水并抗原修復(fù)后，再滴加一抗冰箱孵育過(guò)夜，最后鏡下觀察滴加DAB顯色、蘇木素復(fù)染和封片。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 所有切片結(jié)果的判定由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行觀察評(píng)估。PD-L1蛋白以細(xì)胞漿/質(zhì)出現(xiàn)黃色或者棕色顆粒者為蛋白表達(dá)陽(yáng)性，并結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，采用半定量積分法綜合判定。（1）根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞的顯色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)染色者記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。（2）目標(biāo)細(xì)胞的占比：25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，≥76%記4分。PD-L1蛋白染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：目標(biāo)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和占比兩項(xiàng)積分相乘，其中0～2分為表達(dá)陰性，≥3分為表達(dá)陽(yáng)性[7]。MMP2蛋白以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿成棕黃色或者黃褐色者染色為陽(yáng)性染色細(xì)胞，然后高倍鏡（200×）下評(píng)估陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的面積與整張切片中腫瘤面積的比例，≥10%者為陽(yáng)性，<10%者為陰性[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);MMP2和PD-L1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP2和PD-L1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況 MMP2

和PD-L1蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，兩種蛋白均表達(dá)于目標(biāo)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，見(jiàn)圖1。癌組織中MMP2和PD-L1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)直腸癌組織中MMP2與PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 不同分化程度與pTNM分期的結(jié)直腸癌組織MMP2與PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，不同腫瘤最大徑和CEA表達(dá)情況的結(jié)直腸癌組織MMP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 MMP2和PD-L1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 PD-L1和MMP2蛋白在結(jié)直腸癌組織中同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性為43例。PD-L1和MMP2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌具有相關(guān)性（rs=0.246，P=0.028）。

3 討論

隨著腫瘤治療的三大傳統(tǒng)治療方式（手術(shù)、放療、化療）技術(shù)水平的不斷提高，患者的生存獲益也得到了極大的提升，但是目前的治療似乎也到達(dá)了一個(gè)新的“天花板”。值得期待的是近年來(lái)臨床在腫瘤免疫治療方面有了不小的新進(jìn)展，特別是針對(duì)免疫檢查點(diǎn)設(shè)計(jì)抑制劑的相關(guān)研究正迅速成為一種治療惡性腫瘤極具前途的新方法[9]。有科研工作者已經(jīng)證實(shí)能夠通過(guò)抑制免疫檢查點(diǎn)來(lái)恢復(fù)人體對(duì)腫瘤組織的免疫應(yīng)答，從而有效的控制腫瘤[10]。運(yùn)用相關(guān)原理和方法雖然在對(duì)晚期腫瘤的治療方面獲得了不小的突破，但是治療的總體有效率仍然比較低[11]。例如在晚期腎癌治療方面，有研究顯示，針對(duì)PD-1/PD-L1通路的免疫檢查點(diǎn)所設(shè)計(jì)的抑制劑，其有效率僅為25%[12]。但如果同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用其他傳統(tǒng)治療藥物則可提高治療的有效率，這也反映了腫瘤免疫逃逸機(jī)制的復(fù)雜性[13]。因此，任何探究結(jié)直腸癌免疫監(jiān)視與逃逸機(jī)制相關(guān)的研究均有可能為最終改善治療甚至攻克該腫瘤做出貢獻(xiàn)。

PD-L1（亦稱為B7-H1）是由中國(guó)學(xué)者于1999年率先報(bào)道[13]。PD-1包括PD-L1和PD-L2兩種配體，其中PD-L1主要參與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)方面。腫瘤組織自身能夠產(chǎn)生PD-L1蛋白，該蛋白能與其在T淋巴細(xì)胞上的PD-1配體相結(jié)合，來(lái)引起T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視功能障礙而不清除腫瘤，最終達(dá)到保護(hù)自身免受影響，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[14]。新近研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在包括非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、腎癌等多種腫瘤中均可高表達(dá)，且其表達(dá)水平的高低有助于判斷腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，同時(shí)也可作為判斷預(yù)后的重要參考依據(jù)[15]。Uruga等[16]在關(guān)于肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1蛋白高表達(dá)與腫瘤的高pTNM分期、腫瘤的組織學(xué)類型、脈管侵犯等臨床病理學(xué)特征密切相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。本研究中，PD-L1雖然在結(jié)直腸癌及癌旁組織中均有表達(dá)，但癌組織中PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為53.49%明顯高于癌旁組織的22.09%（P<0.05），這提示PD-L1可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌的分化程度和pTNM分期有關(guān)，即隨著分化程度降低或pTNM分期升高PD-L1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率反而越高，這亦提示PD-L1可能在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過(guò)程中也起著重要作用?？傊?，PD-L1蛋白結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平的高低可能幫助醫(yī)生判斷預(yù)后。

MMP2（又名明膠酶A）目前已被很多學(xué)者證實(shí)在腫瘤組織中高表達(dá)，并且其在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Han等[17]研究表明MMP2的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的組織學(xué)分級(jí)和pTNM分期具有相關(guān)性。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A可能通過(guò)激活PI3K/AKT/NF-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)MMP2蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移和侵襲力的提高[18]。

本研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中MMP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為73.25%高于癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率的30.23%（P<0.05），并且MMP2蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌的組織學(xué)分化程度、pTNM分期、腫瘤最大徑及CEA血生化陽(yáng)性均具有相關(guān)性，這提示MMP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)行為密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PD-L1和MMP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌組織具有相關(guān)性（rs=0.246，P=0.028），且兩者陽(yáng)性表達(dá)率均與腫瘤的分化程度和pTNM分期密切相關(guān)。這提示PD-L1和MMP2可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在協(xié)同作用。此外已有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1與PD-1結(jié)合激活PI3K/AKT通路，亦有研究提示MMP2可被PI3K/AKT通路調(diào)控[19-20]。這些研究結(jié)果和本研究結(jié)果均提示，PD-L1可能通過(guò)PI3K/AKT通路和MMP2蛋白等因子發(fā)生相互作用來(lái)共同影響結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，PD-L1和MMP2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的異常高表達(dá)提示它們可能與結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。但是，它們之間的具體相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探究，也許在不久的將來(lái)在該通路上的一些重要因子會(huì)成為結(jié)直腸癌免疫治療方面的新靶點(diǎn)也尚未可知。

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（收稿日期：2019-08-28） （本文編輯：田婧）