喬雁冰，李世順，崔文博，左然濤，常亞青

(大連海洋大學，農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、爬行亞目(Reptantia)、螯蝦科(Cambaridae)、原螯蝦屬[1](Procambarus)，俗稱小龍蝦、紅螯蝦、淡水小龍蝦及紅色沼澤螯蝦等。克氏原螯蝦的原產地是美國南部和墨西哥北部[2-3]等。在20世紀30年代作為外來物種從日本引進到中國南京，因其適應性強、生長快、繁殖周期短和成活率高等特點，如今已經廣泛分布在中國江蘇、湖北和安徽等省市[4-9]。據《2019年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》數據顯示[10]，2018年克氏原螯蝦產量為1 638 662 t，比2017年增長45.05%，表明克氏原螯蝦已經成為中國重要的水產經濟蝦類。

近年來，甲殼動物在全國范圍內的產業(yè)推廣和人工養(yǎng)殖方面取得了較大的發(fā)展[11]，養(yǎng)殖面積不斷擴大，同時也面臨著嚴峻的病害問題，制約著水產養(yǎng)殖業(yè)的產業(yè)經濟發(fā)展[12-13]。在甲殼動物人工養(yǎng)殖過程中，相關疾病的暴發(fā)是由各種原因綜合形成的，環(huán)境因子作為甲殼動物疾病暴發(fā)的主要原因之一[14]，與機體的免疫防御息息相關，已引起了學者的廣泛關注。鹽度是一種重要的環(huán)境生態(tài)因子，水體鹽度的變化對甲殼動物的生存、生長、生活習性和生理過程都有顯著的影響[15-16]。在養(yǎng)殖過程中，鹽度急劇變化會破壞甲殼動物的滲透壓平衡，引起機體產生一系列生理生化反應，在此過程中免疫機能會顯著降低，嚴重時會導致生物較高的死亡率[17]。國內外已有大量關于環(huán)境因子對甲殼動物免疫防御能力影響的研究[14,18-21]，但滲透環(huán)境對甲殼動物的影響是近幾年隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展和養(yǎng)殖環(huán)境的改變才得到了關注。鹽度對蝦蟹類的呼吸代謝、生長存活和免疫都具有顯著的影響。研究發(fā)現高鹽和低鹽脅迫對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的非特異性免疫會產生顯著影響并產生比較強的應激反應[22]；在對中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的研究中發(fā)現，高鹽脅迫會激活免疫因子進而影響其免疫防御能力[23]。

隨著市場需求的增加，克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積不斷擴大，近年來國內開始嘗試鹽堿地養(yǎng)殖，但是該養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦的產量和成活率都較低，亟需探明鹽度脅迫對克氏原螯蝦生理指標的影響規(guī)律，用以指導生產實踐，減少經濟損失。張龍崗等[24]研究發(fā)現低鹽度可激活克氏原螯蝦肝胰腺中抗氧化酶活性，金彩霞等[25]研究發(fā)現鹽度脅迫對克氏原螯蝦血淋巴滲透壓、Na+/K+-ATPase酶和生物胺活性具有顯著影響，劉國興[26]發(fā)現鹽度變化會顯著影響克氏原螯蝦攝食量、攝食時間和運動比率。本研究通過急性鹽度脅迫實驗，探究克氏原螯蝦在不同鹽度條件下血淋巴中抗氧化能力和非特異性免疫響應，以期為開展鹽堿地養(yǎng)殖克氏原螯蝦提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計和樣品采集

實驗所用克氏原螯蝦購買自大連市長興水產品交易市場，選擇結構完整、體色鮮明、活力較好、大小均勻，體重為(11.05±0.12)g的克氏原螯蝦用于實驗。在實驗室條件下玻璃鋼水槽(1 000 L)中暫養(yǎng)一周，暫養(yǎng)期間，每天換水1/2，按體重的3%投喂商業(yè)人工配合飼料(粗蛋白28%、粗脂肪6%和灰分≤15%)2次，投喂2 h后吸出殘餌和糞便。實驗期間，水溫18～20 ℃，溶解氧保持6 mg/L以上，pH在7.8～8.2之間。

實驗用淡水均為經過徹底曝氣并存放一周的無氯淡水，用提前準備的無氯淡水和經過砂濾處理的自然海水調配鹽度(15‰和30‰)，并以無氯淡水組(0‰)作為對照。在實驗開始前一天暫停餌料投喂，選取暫養(yǎng)池中活力較好的360只克氏原螯蝦進行隨機分組試驗，每個處理3個重復組，每個重復隨機投放40只大小均勻的克氏原螯蝦。實驗采用自然光照，水槽中投放庇護物，防止打架和互殘，實驗期間一切管理措施和暫養(yǎng)期間一致。實驗開始后，從脅迫開始計時，在15 min、24 h和48 h時隨機取樣，每次取樣時每個水槽迅速撈出4只蝦，用1 mL無菌注射器從每一只擦拭干凈的蝦的頭胸甲2/3處插入，在心臟中抽取血淋巴液于2 mL離心管中，此過程在碎冰上進行，每組平行中克氏原螯蝦的血淋巴樣品為一個單獨樣本，4 ℃條件下過夜，之后取出凝固的血淋巴并搗碎，于4 ℃條件下8 000 g離心20 min[27]，將上清液轉移到1.5 mL離心管中，放置在-80 ℃冷凍保存，待檢。

1.2 樣本檢測

抗氧化酶和非特異性免疫酶酶活性測試均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，所有檢測步驟嚴格按照試劑盒上的說明書操作。采用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；采用分光光度計比色法測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活性；采用分光光度計測定酚氧化酶(phenoloxidase，POX)活性；采用TBA顯色法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；采用磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性；采用可見分光光度法測定酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性和采用比色法測定溶菌酶(lysozyme，LZM)活性。

1.3 數據分析

所有實驗數據采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件進行數據分析，采用單因素方差進行數據處理，比較不同處理組或者不同取樣時間之間的均值差異采用Turkey方法進行多重比較，以P<0.05作為不同處理組之間差異顯著標準。數據以“平均值±標準差”(mean±SD，n=3)表示。

2 結果

2.1 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中SOD和CAT活性的影響

如表1所示，與對照組相比，鹽度15‰和30‰組在脅迫下，克氏原螯蝦血淋巴中SOD活性變化顯著，48 h之內均呈現出先升高后降低的趨勢(P<0.05)，并都在24 h達到最大值。在同一時間點上，隨著鹽度的升高SOD活力也出現了顯著的變化，與對照組比較，在15 min和24 h時，鹽度15‰和30‰組顯著高于對照組(P<0.05)，脅迫48 h時，3個實驗組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

如表2所示，鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中CAT活性具有顯著影響(P<0.05)，24 h時鹽度15‰組的CAT活力顯著高于對照組和鹽度30‰組(P<0.05)，而對照組和鹽度30‰組之間沒有顯著變化(P>0.05)；鹽度15‰組的CAT活性在24 h時顯著高于脅迫15 min和48 h(P<0.05)，在其它時間點上則沒有差異(P>0.05)。

表1 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中SOD活性的影響Tab.1 Effects of salinity on SOD activity of haemolymph in Procambarus clarkii U·mL-1, n=3

注：同列數據肩標中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同行數據肩標中不同大寫字母表示顯著差異(P<0.05)。下同。

表2 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中CAT活性的影響Tab.2 Effects of salinity on CAT activity of haemolymph in Procambarus clarkii U·mL-1，n=3

2.2 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中POX活性的影響

如表3所示，鹽度脅迫對克氏原螯蝦血淋巴中POX活性具有顯著影響(P<0.05)。鹽度30‰組的POX的活性隨著時間的推移呈現降低趨勢，且在脅迫15 min時顯著高于脅迫24 h和48 h(P<0.05)，在其它實驗組則沒有顯著性差異(P>0.05)；在脅迫15 min時，鹽度30‰組的POX的活性顯著高于對照組(P<0.05)，在其它時間點則沒有顯著性差異(P>0.05)。

表3 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中POX活性的影響Tab.3 Effects of salinity on POX activity of haemolymph in Procambarus clarkii ng·mL-1，n=3

2.3 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中MDA含量的影響

如表4所示，鹽度脅迫對克氏原螯蝦血淋巴中MDA含量具有顯著影響(P<0.05)，隨著鹽度的升高呈現增加的趨勢，在鹽度30‰組15 min時MDA含量最高。在15 min和48 h時，鹽度30‰組的MDA含量顯著高于其他2個組(P<0.05)，在24 h時各實驗組之間沒有顯著性變化(P>0.05)；在鹽度30‰組中，MDA含量在脅迫15 min時顯著高于24 h和48 h時間點(P<0.05)。

表4 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中MDA含量的影響Tab.4 Effects of salinity on MDA content of haemolymph in Procambarus clarkii nmol·mL-1，n=3

2.4 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中LZM活性的影響

如表5所示，在對照組中，克氏原螯蝦血淋巴中LZM的活性在15 min時顯著高于48 h(P<0.05)，在鹽度15‰和30‰條件下，LZM活性未受脅迫處理時間的顯著影響(P>0.05)；在48 h時，鹽度15‰的LZM活性顯著高于對照組(P<0.05)，而鹽度15‰和30‰組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

表5 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中LZM活性的影響Tab.5 Effects of salinity on LZM activity of haemolymph in Procambarus clarkii U·mL-1，n=3

2.5 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中AKP和ACP活性的影響

如表6所示，鹽度組ACP活性均隨著處理時間延長呈降低趨勢(P<0.05)，鹽度30‰組在15 min時ACP活力最高。在鹽度15‰組中，隨著時間的延長ACP活性顯著降低，其中處理48 h時顯著低于15 min時(P<0.05)，而15 min和24 h之間ACP活性沒有顯著變化(P>0.05)；在鹽度30‰組中，隨著時間的延長ACP活性也呈現顯著降低的趨勢，在48 h時顯著低于15 min和24 h(P<0.05)，而24 h時ACP活性也顯著低于15 min(P<0.05)。在15 min時，鹽度15‰和30‰組顯著高于對照組(P<0.05)；在24 h時，鹽度15‰組酶活力最高，顯著高于鹽度30‰和對照組(P<0.05)，鹽度30‰組也顯著高于對照組(P<0.05)。

鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中AKP活性的影響如表7所示。鹽度15‰和30‰組AKP活性均隨著時間的延長均呈降低的趨勢(P<0.05)。隨著時間的延長，鹽度15‰組AKP活性在各時間點之間具有顯著差異(P<0.05)，隨著時間的推移顯著降低，在48 h時AKP活性顯著低于15 min和24 h(P<0.05)；在鹽度30‰組中AKP活性也具有顯著性差異，在15 min和24 h時顯著高于48 h(P<0.05)，而在15 min時也顯著高于24 h處理組(P<0.05)。在同一時間點不同鹽度之間也呈現逐漸升高的趨勢，在15 min時各鹽度組顯著高于對照組(P<0.05)，而鹽度15‰和30‰組之間沒有顯著變化(P>0.05)；在24 h時出現了相似的顯著性變化趨勢，鹽度15‰和30‰組顯著高于對照組(P<0.05)。

表6 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中ACP活性的影響Tab.6 Effects of salinity on ACP activity of haemolymph inProcambarus clarkii 金氏單位·(100mL)-1，n=3

表7 鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中AKP活性的影響Tab.7 Effects of salinity on AKP activity of haemolymph inProcambarus clarkii 金氏單位·(100mL)-1，n=3

3 討論

鹽度是水體中無機鹽含量的指標，甲殼動物對鹽度的適應主要是通過機體滲透壓的調節(jié)，當水體鹽度突變后機體需要進行動態(tài)的滲透調節(jié)，從而達到可以適應外界環(huán)境的新的平衡狀態(tài)，若鹽度突變幅度過大或者超過了機體的調節(jié)能力將造成不可逆的滲透調節(jié)，導致死亡[28]。本研究中，48 h內未見克氏原螯蝦死亡，這說明克氏原螯蝦具有較強的鹽度調節(jié)和適應能力。

生物體內部清除過多自由基的系統(tǒng)包括非酶系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)。其中抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(清除超氧陰離子)、過氧化氫酶(清理過氧化氫)、谷胱甘肽過氧化物酶及谷胱甘肽-硫-轉移酶(清除脂質氫過氧化物)等[29]。本研究中，克氏原螯蝦處理組的血淋巴中超氧化物歧化酶(SOD)活性隨著時間的推移(0～48 h)呈現出先升高后降低的趨勢。在急性鹽度脅迫短時間內(15 min～24 h)克氏原螯蝦血淋巴中SOD活力升高，這與陳宇鋒等[30]的研究成果相似，該研究發(fā)現鹽度脅迫導致鋸緣青蟹(Scyllaserrata)SOD活性在24 h內顯著升高。蘇詩娟[31]研究發(fā)現東方對蝦(Penaeusorientalis)在高鹽度30‰時SOD活性顯著升高。這說明急性鹽度脅迫能夠激活克氏原螯蝦機體的SOD酶，從而增強機體抵抗鹽度脅迫的能力，然而當脅迫時間超出一定耐受范圍后，SOD酶活性也會受到抑制，克氏原螯蝦抗氧化能力顯著下降。本研究發(fā)現，在低鹽條件下，隨著時間的延長，CAT活性呈先升高后降低的趨勢，分析認為低鹽度脅迫會激活克氏原螯蝦機體的抗氧化酶系統(tǒng)，隨之增加機體對鹽度脅迫的抵抗能力，以維持機體的機能，而在高鹽條件下，機體的抗氧化酶活性受到抑制，導致抗氧化能力降低。李娜等[32]研究認為鹽度30‰條件下凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)血淋巴中SOD活性會出現峰值，而血淋巴中CAT活性總體呈現先升高后降低的趨勢，與本研究結果類似。

酚氧化酶及其因子構成了一個復雜的酶級聯反應系統(tǒng)，即酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase-activated system, proPO-As)，POX是酚氧化酶原激活系統(tǒng)的產物，在識別異物、釋放調理素促進血細胞的吞噬和包囊以及產生殺滅和排除異物的凝集素和溶菌酶等免疫功能方面發(fā)揮重要的作用，因此與機體的免疫功能有直接關系[31]。一些學者認為在外界刺激和脅迫下，機體會迅速激活血淋巴PO系統(tǒng)，酚氧化酶活力升高，并產生一定程度的免疫反應[33-35]。本研究結果表明，在高鹽度30‰脅迫初期15 min時POX活性最高，隨著時間的延長呈現降低的趨勢，這一結果驗證了上述說法。另陳宇鋒等[30]研究發(fā)現鋸緣青蟹在鹽度脅迫后會顯著影響血淋巴中PO活性，并伴隨時間的延長而減低，本研究結果與之相似。

機體內的脂質氫過氧化物在分解時經常會產生醛類，脂質過氧化產生較多的醛類之一就是丙二醛[36-37]。而機體MDA含量主要反映脂質過氧化程度，從而間接的反映細胞損傷的程度。趙玉超等[38]研究認為鹽度能顯著影響凡納濱對蝦仔蝦體內的MDA含量，并造成機體免疫功能降低。在本研究中，隨著鹽度的升高MDA含量也顯著升高，機體脂質過氧化程度增加，說明外界鹽度條件會導致機體的細胞出現氧化損傷，造成機體免疫能力下降。

溶菌酶(LZM)具有溶菌活性，作為非特異性免疫生物防御因子對某些細菌發(fā)揮著先天抵抗作用，并可以誘導其他免疫因子的合成和分泌[39]。本研究中，在不同鹽度組和不同時間點上，LZM活性差異不大，說明鹽度脅迫對克氏原螯蝦血淋巴中活性影響較小，分析認為鹽度脅迫對克氏原螯蝦體內的LZM活性也影響較小。趙玉超等[38]發(fā)現高鹽度脅迫對凡納濱對蝦血淋巴中溶菌酶活性沒有顯著影響，本實驗結果與之一致。對照組中LZM活性隨時間的延長呈現降低的趨勢，分析認為是在實驗開始前進行了一天的饑餓處理導致克氏原螯蝦機體的LZM活性增加，之后出現了降低，這與蘆光宇等[40]研究結果一致，該研究認為饑餓會影響克氏原螯蝦抗氧化系統(tǒng)，導致抗氧化酶活性隨著饑餓時間的延長呈現先升高后降低的變化趨勢。

在甲殼動物的免疫防御體系中，酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)直接參與磷酸基團的轉移和代謝，可以加速機體物質的攝取和轉運，能形成水解酶體系，破壞和消除侵入體內的異物，對維持蝦、蟹類的生存和生長有特別重要的意義[41]。同時ACP會伴隨血細胞進行吞噬和包囊反應過程而被釋放[42-43]。因此通過分析AKP和ACP活性變化，有助于了解鹽度脅迫對機體營養(yǎng)物質消化吸收、物質運輸及生物體抗氧化系統(tǒng)的影響。劉存歧[44]分析金屬離子對中國對蝦幼體AKP的影響，認為磷酸酶活性的高低可以作為判斷機體免疫能力的指標。譚樹華等[45]研究高濃度Zn2+對克氏原螯蝦幾種免疫學相關指標的影響，認為其可通過磷酸酶活性的增加抵御惡劣環(huán)境，清除體內產生的異物。在本實驗中，隨著鹽度的升高AKP和ACP活性顯著增加，分析認為隨著鹽度的升高，機體為進行滲透調節(jié)維持機體穩(wěn)態(tài)而大量消耗ATP，而合成ATP必需的無機磷酸需要ACP和AKP催化水解磷酸脂類物質產生，進而導致AKP和ACP活性增加，從而增強機體免疫活性，在高鹽脅迫對凡納濱對蝦免疫相關酶的研究中也發(fā)現了相似的結論[32]。當脅迫時間延長，AKP和ACP活性顯著降低，體內這2種酶的活性受到了明顯抑制，說明隨著時間的延長，鹽度脅迫會影響機體的免疫系統(tǒng)，進而降低機體的抗病能力，這與趙艷飛等[46]的研究結果相似，認為環(huán)境因子會影響機體內的AKP和ACP活性，進一步導致抗病能力下降。

綜上，本研究以抗氧化酶和非特異性免疫酶活性作為評價克氏原螯蝦應對急性鹽度脅迫的免疫指標，證明在急性鹽度脅迫短時間內(15 min～24 h)即能激活克氏原螯蝦的抗氧化系統(tǒng)和非特異性免疫系統(tǒng)來抵御外界環(huán)境，48 h后各項生理指標可恢復至正常水平，從而實現對環(huán)境的適應，為開發(fā)鹽堿地養(yǎng)殖克氏原螯蝦模式的可行性提供了理論參考。