馬銀花，鄒芝英，祝璟琳，喻 杰，肖 煒，李大宇，楊 弘，胡平各，陳炳霖

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081)

絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)將細(xì)胞外的刺激信號(hào)帶入細(xì)胞核內(nèi)[1]。p38MAPK是MAPK家族中的重要組成部分，位于細(xì)胞眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中樞位置，在炎癥反應(yīng)[2]、細(xì)胞應(yīng)激、凋亡[3]、細(xì)胞周期[4]和生長(zhǎng)等生理、病理過(guò)程中起重要作用。

p38MAPK基因包括四種亞型：p38α、p38β、p38γ、p38δ，其中p38α和p38β幾乎存在所有組織中，p38γ和p38δ只在肌肉、胰腺、腸和腎等組織中表達(dá)[1]。此外，p38MAPK家族的所有成員均具有Thr-Gly-Tyr(TGY)雙磷酸化位點(diǎn)、Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)底物結(jié)合位點(diǎn)。在MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，MAPK激酶(MAPKK)可以通過(guò)磷酸化TGY位點(diǎn)，從而活化p38MAPK，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]。研究表明，p38MAPK能被多種細(xì)胞外刺激所激活，如炎癥細(xì)胞因子、環(huán)境脅迫、病原體感染等。當(dāng)其被激活時(shí)，能介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子，參與機(jī)體免疫反應(yīng)[6]，幫助機(jī)體抵御病害威脅。Barruet等[7]曾用脂多糖(LPS)刺激CD14+原代單核細(xì)胞，結(jié)果顯示p38MAPK表達(dá)量上調(diào)，細(xì)胞因子、趨化因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)分泌增加。可見(jiàn)，p38MAPK在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。目前在大西洋鮭[8]、斑馬魚(yú)[9]、鯉[10]、文昌魚(yú)[11]等水產(chǎn)動(dòng)物中都克隆出p38MAPK基因，但關(guān)于羅非魚(yú)p38MAPK的研究很有限。

羅非魚(yú)(Oreochromisspp.)作為聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)重點(diǎn)推廣的養(yǎng)殖對(duì)象，被譽(yù)為未來(lái)動(dòng)物性蛋白質(zhì)主要來(lái)源之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12]。然而近年來(lái)羅非魚(yú)鏈球菌病頻繁暴發(fā)，使羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失日趨嚴(yán)重。其中，無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是主要致病菌，能造成羅非魚(yú)全身性組織炎癥反應(yīng)和器官損害，尤其是肝臟、脾臟、腎臟和腦等重要器官功能障礙和衰竭，嚴(yán)重時(shí)甚至引起魚(yú)類(lèi)的急性死亡[13]。因此，為了研究p38MAPK與羅非魚(yú)的免疫相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)克隆獲得尼羅羅非魚(yú)p38MAPK基因(ntp38MAPK)cDNA序列，初步分析了其在尼羅羅非魚(yú)不同組織以及感染無(wú)乳鏈球菌后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化規(guī)律，以期能為應(yīng)對(duì)鏈球菌刺激后的調(diào)控機(jī)理提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為羅非魚(yú)的疾病綜合防控提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為羅非魚(yú)養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的尼羅羅非魚(yú)埃及品系NE來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部羅非魚(yú)遺傳育種中心。實(shí)驗(yàn)用魚(yú)在水溫28 ℃的循環(huán)水箱中暫養(yǎng)一周后使用。

無(wú)乳鏈球菌(LB110808-2)保存于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱[14]。該病原菌已經(jīng)通過(guò)API20 Strep快速鑒定及16S rDNA分子鑒定確定為無(wú)乳鏈球菌，回歸感染證明其具有較強(qiáng)毒力。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

總RNA的提取采用Trizol 試劑(Invitrogen)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計(jì)確定其完整性及質(zhì)量。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，利用SMARTTM RACE Amplification 試劑盒(Clontech)合成3′RACE和5′RACE cDNA第一條鏈。

1.2.2 尼羅羅非魚(yú)p38MAPK基因的cDNA克隆

根據(jù)NCBI中羅非魚(yú)p38MAPK轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)序列(XM_003441527)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，將引物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。

以羅非魚(yú)肝臟組織 cDNA為模板進(jìn)行中間片段PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μL):rTaq 0.2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture 2 μL，5 μmol/L的p38-F1引物1.6 μL，5 μmol/L的p38-R1引物1.6 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free Water添加至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增后使用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR目的片段產(chǎn)物的大小。將目的片段與pMD19-T載體(TaKaRa)連接，轉(zhuǎn)入到E.coil感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa)中，鋪板于氨芐-LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌落，送至生工生物(上海)工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，確定p38MAPK基因片段。結(jié)合RACE技術(shù)獲得p38MAPK基因的cDNA全長(zhǎng)，具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。所用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 The primers used in this study

1.2.3 序列分析

利用Emboss(http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/showorf)軟件預(yù)測(cè)氨基酸序列；ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)軟件對(duì)推導(dǎo)出的蛋白序列進(jìn)行蛋白理化特性預(yù)測(cè)；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)軟件；用NCBI中的Blast程序搜索用于p38MAPK基因同源性分析與系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建的氨基酸序列；采用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用GOR方法(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin gor4)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.4ntp38MAPK基因的組織表達(dá)分析

選6尾二齡的健康尼羅羅非魚(yú)，選取肝、脾、頭腎、體腎、腦、血液、肌肉、鰓、腸、精巢、心臟等11種組織，放入Trizol中，保存在液氮中，用于ntp38MAPK基因的組織表達(dá)分析。

根據(jù)ntp38MAPK基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物p38-F4、p38-R4(表1)，以β-actin為內(nèi)參基因(表1)，不同組織cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系20 μL，包括SYBR?Green PCR Master Mix (TOYOBO)10 μL，0.8 μL 引物(5 μmol/L)，2 μL cDNA模板(1 μg)，RNase-free Water 補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線分析。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔΔct法進(jìn)行分析。

1.2.5ntp38MAPK基因鏈球菌感染后的表達(dá)分析

將經(jīng)鑒定的無(wú)乳鏈球菌原種接種并復(fù)壯，劃線培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將菌種接種于腦心浸液液體培養(yǎng)基(BHI)中，210 r/min、29 ℃的條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌的8.5 g/L NaCl溶液洗滌后配置成濃度為6.9×108cfu/mL的菌懸液原液[14]。感染濃度通過(guò)連續(xù)10倍稀釋后涂布于腦心浸液瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h后，計(jì)數(shù)單克隆菌落倒推計(jì)算所得。

選取尼羅羅非魚(yú)埃及品系(NE)90尾，體質(zhì)量(182±30)g，于循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)適應(yīng)一周，每天適當(dāng)提高溫度，實(shí)驗(yàn)前使水溫達(dá)到(33±1)℃。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)腹腔注射濃度為1.4×105cfu/mL的無(wú)乳鏈球菌，每尾0.3 mL，分別于攻毒后0、2、4、8、12、24、48、72 h共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣(0 h設(shè)為對(duì)照組)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6尾魚(yú)，每尾魚(yú)取頭腎、肝、脾組織，保存于液氮中用于RNA的提取。人工感染3 d后隨機(jī)取瀕死的羅非魚(yú)解剖,無(wú)菌操作取腦和腎臟組織在血平板上分離、純化病原菌,并用梅里埃API 20 Strep試劑條(Biomerieox)進(jìn)行快速鑒定。

按照前述方法提取攻毒后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)尼羅羅非魚(yú)肝、脾、頭腎組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系、反應(yīng)程序以及數(shù)據(jù)處理方法同上組織表達(dá)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0的單因素方差(ANOVA)分析和Duncan′s多重比較進(jìn)行組間比較分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ntp38MAPK基因cDNA的克隆及序列分析

通過(guò)RACE技術(shù)克隆得到尼羅羅非魚(yú)p38MAPK基因cDNA全長(zhǎng)序列，命名為ntp38MAPK(GenBank登錄號(hào)：MN478475)。ntp38MAPK的cDNA全長(zhǎng)1 789 bp，ORF長(zhǎng)1 086 bp，5′UTR長(zhǎng)342 bp，3′UTR為361 bp。3′端含有polyA尾，不含多聚腺苷酸AATAA加尾信號(hào)。ORF可編碼361個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為41.598 kD，理論等電點(diǎn)為5.1。本序列包括35個(gè)磷酸化位點(diǎn)(其中絲氨酸位點(diǎn)14個(gè)，蘇氨酸位點(diǎn)13個(gè)，酪氨酸位點(diǎn)8個(gè))，同時(shí)含有p38家族典型的Thr-Gly-Tyr(TGY)雙磷酸化位點(diǎn)、緊密相連的底物結(jié)合位點(diǎn)Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)以及CD結(jié)構(gòu)域(圖1)。利用GOR法對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，整條氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)有 α 螺旋、延伸鏈以及無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中α螺旋占37.95%，延伸鏈占14.40%，無(wú)規(guī)則卷曲比列最大占47.65%。

2.2 同源性分析

經(jīng)NCBI中BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚(yú)p38MAPK蛋白與其他物種的具有較高的相似性。利用Clustal-X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果表明：該序列與大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea:XP_010754403.1)、鱸(Dicentrarchuslabrax:CBN8089 3.1)的相似性最高，達(dá)到97%。與其他脊索動(dòng)物的相似性：與斑馬魚(yú)(Daniorerio:AAQ91248.1)的相似性為94%；大西洋鮭(Salmosalar:XP_013991178.1)的相似性為93%；與牙鲆(Paralichthysolivaceus:XP_019942433.1)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss:XP_021472540.1)以及牦牛(Bosmutus:QAB47435.1)的相似性都為92%；與人(Homosapiens:NP_002742.3)和小鼠(Musmusculus:AAH12235.1)的相似性都為90%。此外與其他節(jié)肢動(dòng)物的相似性也很高，與擬穴青蟹(Scyllaparamamosain:AHH29322.1)的相似性為76%；與蠅蛹金小蜂(Nasoniavitripennis:NP_001136337.1)的相似性為75%；與家蠶(Bombyxmori:NP_001036996.1)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera:AHL46461.1)的相似性都為73%(圖1)。

利用MEGA 6.0軟件，采用NJ法構(gòu)建了MAPK系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，尼羅羅非魚(yú)的p38MAPK與脊索動(dòng)物大黃魚(yú)、鱸的p38MAPK聚為一支，后與大西洋鮭、虹鱒聚為一支，最后與其他節(jié)肢動(dòng)物聚合。

圖1 ntp38MAPK的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Comparison of amino acid sequence of ntp38MAPK with multiple amino acid sequences of other species雙磷酸化位點(diǎn)TGY、底物結(jié)合位點(diǎn)ATRW和CD結(jié)構(gòu)域用方框標(biāo)出

圖2 利用MEGA5.05軟件構(gòu)建的基于ntp38MAPK氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 NJ phylogenetic tree based on ntp38MAPK amino acid sequence constructed with MEGA5.05 software尼羅羅非魚(yú)ntp38MAPK用星號(hào)標(biāo)出

2.3 ntp38MAPK基因的組織表達(dá)分析

如圖3所示，ntp38MAPK在心臟、肝臟、脾、頭腎、體腎、腦、肌肉、腸、鰓、血液以及精巢中都有表達(dá)，且存在明顯的組織差異性。其中肌肉組織中表達(dá)量最高(為頭腎中相對(duì)表達(dá)量的6.9倍)，隨后是心臟、肝臟、血液以及腦，精巢、鰓、體腎、脾臟、腸的表達(dá)量相對(duì)較低，頭腎中最低。

圖3 尼羅羅非魚(yú)ntp38MAPK在各組織表達(dá)情況Fig.3 Expression of ntp38MAPK in O.niloticus in various tissues1.肝臟，2.脾臟，3.頭腎，4.體腎，5.鰓，6.腸，7.肌肉，8.腦，9.心臟，10.血液，11.精巢。小寫(xiě)字母不同表示差異性顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)

2.4 無(wú)乳鏈球菌感染后ntp38MAPK表達(dá)分析

無(wú)乳鏈球菌感染后ntp38MAPK在肝臟中的表達(dá)變化情況如圖4。結(jié)果顯示，感染2 h，表達(dá)量逐漸上調(diào)，在4 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.1倍。8 h下調(diào)為對(duì)照組的0.8倍，與對(duì)照組差異不顯著。感染12 h表達(dá)量上調(diào)到又一峰值，為對(duì)照組的3.9倍。24～72 h表達(dá)量趨于對(duì)照組水平。

圖4 無(wú)乳鏈球菌感染后肝臟中ntp38MAPK的表達(dá)情況Fig.4 Expression of ntp38MAPK in liver after streptococcal infection小寫(xiě)字母不同表示差異性顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。下圖同。

在無(wú)乳鏈球菌感染的過(guò)程中，ntp38MAPK在脾臟中的表達(dá)量在感染后2 h明顯上調(diào)，為對(duì)照組的1.6倍。之后表達(dá)量開(kāi)始下調(diào)，8 h表達(dá)量下降到最低，為對(duì)照組的0.06倍。12 h表達(dá)量有所回升但顯著低于對(duì)照組，為對(duì)照組的0.5倍。24～72 h，表達(dá)量趨于平穩(wěn)，但顯著低于對(duì)照組 (圖5)。

圖5 無(wú)乳鏈球菌感染后脾臟中ntp38MAPK的表達(dá)情況Fig.5 Expression of ntp38MAPK in spleen after streptococcal infection

在頭腎中的表達(dá)量變化趨勢(shì)與肝臟有些類(lèi)似，均呈現(xiàn)上調(diào)與下調(diào)波動(dòng)性往復(fù)變化。無(wú)乳鏈球菌感染后2 h，表達(dá)量上調(diào)到對(duì)照組的1.9倍。之后開(kāi)始下降，8 h達(dá)到最低值，為對(duì)照組的0.3倍。12 h表達(dá)量又回升，為對(duì)照組的1.4倍。24～72 h趨于對(duì)照組水平(圖6)。

圖6 無(wú)乳鏈球菌感染后頭腎中ntp38MAPK的表達(dá)情況Fig.6 Expression of ntp38MAPK in head kidney after streptococcal infection

3 討論

p38MAPK在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過(guò)程中具有重要作用[5]。為了深入研究尼羅羅非魚(yú)p38MAPK在抗菌免疫方面的作用，本實(shí)驗(yàn)克隆了尼羅羅非魚(yú)埃及品系p38MAPK全長(zhǎng)序列。該基因編碼的氨基酸序列含有p38家族典型保守的Thr-Gly-Tyr(TGY)雙磷酸化位點(diǎn)、緊密相連的底物結(jié)合位點(diǎn)Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)，以及CD結(jié)構(gòu)域。經(jīng)序列比對(duì)以及同源性分析發(fā)現(xiàn)，ntp38MAPK與其他物種的相似性都在70%以上，可見(jiàn)p38MAPK在進(jìn)化中十分保守。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，尼羅羅非魚(yú)p38MAPK與同為鱸形目的大黃魚(yú)、鱸親緣關(guān)系最近，這與傳統(tǒng)的分類(lèi)系統(tǒng)相一致。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)克隆得到的是尼羅羅非魚(yú)埃及品系的p38MAPK基因。

組織測(cè)定結(jié)果顯示ntp38MAPK在尼羅羅非魚(yú)各組織均廣泛表達(dá)。類(lèi)似地，在斑馬魚(yú)[9]、文昌魚(yú)[11]等水生生物中，p38MAPK在各組織中均有表達(dá)，這與p38MAPK在不同組織參與不同的生理功能有關(guān)[15]。但是在不同的物種中，p38MAPK在不同組織中的mRNA豐度并不相同。本實(shí)驗(yàn)中，ntp38MAPK在肌肉中的表達(dá)量最高，哺乳動(dòng)物中的研究表明p38MAPK主要在骨骼肌中表達(dá)，并參與肌肉的分化調(diào)控[16]。然而，擬穴青蟹[17]中p38MAPK表達(dá)量最高的組織是血細(xì)胞、腸道，而肌肉中的表達(dá)量最低；這可能與p38MAPK在不同生物組織中功能的多樣性有關(guān)[15]。

諸多研究表明，p38MAPK參與調(diào)控多種生物的免疫過(guò)程，尤其在調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)方面[2]。Jiu等[11]發(fā)現(xiàn)在文昌魚(yú)中脂多糖(LPS)刺激能引起p38MAPK表達(dá)量變化。Yan等[18]證實(shí)p38MAPK在調(diào)控中國(guó)對(duì)蝦抵抗病毒細(xì)菌感染、清除病原、提高存活率過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)乳鏈球菌刺激后，尼羅羅非魚(yú)肝臟、脾臟和頭腎等免疫組織中ntp38MAPK的表達(dá)量顯著變化，推測(cè)ntp38MAPK參與了羅非魚(yú)抗菌免疫過(guò)程。

腹腔注射無(wú)乳鏈球菌后，尼羅羅非魚(yú)脾臟中ntp38MAPK快速響應(yīng)，在感染后2 h表達(dá)量上調(diào)到對(duì)照組的1.6倍；肝臟中ntp38MAPK在4 h開(kāi)始響應(yīng)，12 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的3.9倍，推測(cè)可能與無(wú)乳鏈球菌對(duì)組織感染入侵途徑有關(guān)。利用免疫組織化學(xué)定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)，腹腔注射無(wú)乳鏈球菌后病原菌陽(yáng)性信號(hào)首先出現(xiàn)在脾臟，之后是肝臟[19]。脾臟是羅非魚(yú)的主要免疫器官，同時(shí)是無(wú)乳鏈球菌的主要攻擊對(duì)象[20]。而肝臟是魚(yú)類(lèi)的代謝器官，同時(shí)具有一定解毒和防御功能。無(wú)乳鏈球菌侵入魚(yú)體內(nèi)后，少量病菌入侵肝臟，肝臟內(nèi)吞噬細(xì)胞即可吞噬清除病原菌，但隨著病原菌在體內(nèi)大量繁殖，其毒力因子累積增多，機(jī)體需逐漸擴(kuò)大炎癥反應(yīng)來(lái)抵抗病原菌[21]，因此肝臟中的反應(yīng)稍有滯后。同時(shí)，不同種類(lèi)致病菌引起p38MAPK變化時(shí)間也有差異。石斑魚(yú)感染海豚鏈球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)、遲鈍愛(ài)德華氏菌(革蘭氏陰性菌)和巨細(xì)胞病毒(病毒)后，p38MAPK的表達(dá)量分別在感染3 h、12 h和48 h達(dá)到峰值[22]；凡納濱對(duì)蝦[18]感染革蘭氏陰性菌后，血細(xì)胞、鰓中p38MAPK的表達(dá)量分別在8 h、12 h達(dá)到峰值，感染革蘭氏陽(yáng)性菌后，鰓中p38MAPK的表達(dá)量在8 h即達(dá)到最大值，血細(xì)胞中在12 h才達(dá)到峰值。另外，頭腎是魚(yú)類(lèi)重要的淋巴組織，在免疫應(yīng)答過(guò)程中起主要作用[21]，在感染后的2 h檢測(cè)到頭腎中ntp38MAPK表達(dá)量顯著上調(diào)。感染8 h后肝臟、脾臟和頭腎中p38MAPK的表達(dá)量均有下調(diào)，推測(cè)與機(jī)體自身免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。類(lèi)似的，海參[23]、對(duì)蝦[24]感染弧菌后，p38MAPK表達(dá)量分別在8 h、4 h明顯下調(diào)。

尼羅羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌感染24 h后，肝臟、頭腎中ntp38MAPK表達(dá)量恢復(fù)至對(duì)照組水平。同樣地，Yu等[17]用金黃色葡萄球菌感染擬穴青蟹，24 h后血細(xì)胞中p38MAPK基因表達(dá)量恢復(fù)到對(duì)照組水平。已有研究表明，p38MAPK在免疫過(guò)程中具有雙重調(diào)節(jié)作用。當(dāng)炎癥反應(yīng)到達(dá)一定程度后，p38MAPK能通過(guò)雙特異性磷酸酶(DUSP)介導(dǎo)的MAPK去磷酸化來(lái)形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)以降低免疫反應(yīng)對(duì)組織帶來(lái)的損傷[25]。Keranen等[26]發(fā)現(xiàn)增加雙特異性磷酸酶MKP-1的表達(dá)，能夠抑制p38MAPK信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)，使機(jī)體達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。然而，本實(shí)驗(yàn)中脾臟中ntp38MAPK表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。推測(cè)可能是由于無(wú)乳鏈球菌的長(zhǎng)時(shí)間感染造成了脾臟組織功能和結(jié)構(gòu)的損壞。病理形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)乳鏈球菌感染能造成脾臟內(nèi)紅細(xì)胞大量破壞，進(jìn)而導(dǎo)致貧血，免疫功能降低[14]。另外，賀揚(yáng)[20]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Toll樣受體 (TLR5)在無(wú)乳鏈球菌感染4～72 h表達(dá)量顯著上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)促炎因子的大量表達(dá)，這可能是導(dǎo)致脾臟過(guò)度炎癥，出現(xiàn)脾臟急性壞死的主要原因。ntp38MAPK在尼羅羅非魚(yú)免疫組織中表達(dá)量的變化，說(shuō)明ntp38MAPK參與了機(jī)體抗菌免疫反應(yīng)，在先天免疫反應(yīng)中具有重要作用，然而具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)首次成功克隆獲得尼羅羅非魚(yú)的ntp38MAPK全長(zhǎng)序列，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ntp38MAPK的組織表達(dá)情況，分析了無(wú)乳鏈球菌感染過(guò)程中尼羅羅非魚(yú)肝臟、脾臟、頭腎中ntp38MAPK相對(duì)表達(dá)量的變化，推斷p38MAPK基因在尼羅羅非魚(yú)抵抗細(xì)菌侵染中起重要作用，為深入研究尼羅羅非魚(yú)p38MAPK信號(hào)通路的作用機(jī)制以及調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。