陳 琳，周經(jīng)霞，曾超勝

0 引言

血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知最強的促血管生成因子，可以保護神經(jīng)細胞、促進神經(jīng)軸突再生，幫助缺血性腦組織恢復血供，是一個很有前景的治療缺血性腦卒中的生物因子[1]。然而，VEGF在發(fā)揮治療缺血性腦卒的作用時，會加重血腦屏障完整性的破壞，導致腦水腫等嚴重不良反應，阻礙VEGF的臨床應用[2-3]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控核因子-κB(NF-κB)通路是重要的炎性細胞因子調(diào)節(jié)通路，在腦卒中時處于激活狀態(tài)，P65蛋白是NF-κB通路的核心蛋白，激活后入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)節(jié)一系列基因的表達[4]。血清類黏蛋白(Orosomucoid，ORM)對于維持多個組織和器官毛細血管的通透性有重要作用，外源性給予ORM可以顯著增強血腦屏障，其中ORM1占ORM的75%以上[5]。本研究觀察VEGF 對血管內(nèi)皮細胞ORM1表達的影響，并探討NF-κB通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人真皮微血管內(nèi)皮細胞 (HDMEC)購自上海細胞生物研究所，內(nèi)皮細胞生長補充因子(ECGS)、VEGF、DAPI和NF-κB通路抑制劑(PDTC)購于美國Sigma公司，Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國英韋創(chuàng)津公司、熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，ORM1和內(nèi)參β-actin 引物由深圳華大基因公司設(shè)計和合成，見表1。細胞蛋白裂解液和細胞核蛋白提取試劑盒購自北京碧云天公司，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(ECM)和胎牛血清購于美國 Gibco 公司，ORM1、P65以及內(nèi)參GAPDH、Histone抗體購自美國Abcam公司，MCO-20AIC型CO2培養(yǎng)箱購自日本 SANYO 公司，ABI 7500 型Real-time PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，Multiskan Spectrum酶標儀購自美國Thermo公司。

表1 引物序列表

1.2 細胞培養(yǎng)和傳代 HDMEC細胞培養(yǎng)于5%胎牛血清、1%ECGS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的ECM培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃ 細胞培養(yǎng)箱，待細胞達到80%融合(對數(shù)生長期)時傳代進行試驗。

1.3 ORM1基因表達的Real-time PCR定量檢測 取對數(shù)生長的HDMEC細胞接種于6孔板，分為對照組、低劑量VEGF (20 μmol/L)組、高劑量VEGF (40 μmol/L)組和PDTC(5 μg/L)組，共4組。培養(yǎng)12 h細胞貼壁后，加入相關(guān)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后加入Trizol裂解細胞，提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄出cDNA第1鏈，取1 μg cDNA，按照Real-time PCR試劑盒說明書操作，檢測ORM1基因的相對表達量，反應條件為：94 ℃ 3 min；而后進行35個循環(huán)(94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s)；72.5 min。對照內(nèi)參β-actin，用2-△△Ct表示ORM1的相對表達水平。

1.4 P65蛋白免疫熒光分析 按“1.3”項方法進行細胞分組，制作細胞爬片，培養(yǎng)12 h細胞貼壁后，加入相關(guān)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，室溫下用4%多聚甲醛固定10 min后，含0.5%Triton X-100的PBS中滲透15 min，含0.3% H2O2的0.01 mol/L Tris緩沖液中30 min，加入P65一抗4 ℃下孵育過夜，APC標記二抗(紅色熒光)孵育2 h，細胞核染料DAPI(藍色熒光)復染30 min，熒光顯微鏡分析圖像。

1.5 ORM1和P65蛋白表達的Western blot檢測 按“1.3”項方法進行細胞分組。培養(yǎng)12 h細胞貼壁后，加入相關(guān)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，每組細胞分為2份，提取細胞總蛋白和細胞核蛋白，所有蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，孵育ORM1和P65抗體(1∶1 000)過夜，細胞總蛋白內(nèi)參使用β-actin抗體(1∶5 000)，細胞核內(nèi)參使用Histone抗體(1∶5 000)，HRP標記二抗孵育2 h，加入化學發(fā)光劑，曝光后Total Lab Quant v11.5 軟件掃描目的條帶，以內(nèi)參為對照計算各條帶的相對灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用 LSD法分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF對ORM1基因表達的影響 Real-time PCR定量檢測顯示，對照組、低劑量VEGF組、高劑量VEGF組和PDTC組ORM1基因的2-△△Ct值為0.324±0.053、0.252±0.042、0.192±0.034、0.166±0.027，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 VEGF對P65蛋白表達的影響 免疫熒光染色顯示，低劑量VEGF組、高劑量VEGF組和PDTC組P65蛋白表達低于對照組。見圖1。

圖1 P65蛋白的免疫熒光染色結(jié)果(200×)

Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、低劑量VEGF組、高劑量VEGF組和PDTC組P65蛋白表達的相對灰度值分別為0.527±0.114、0.316±0.065、0.242±0.038、0.105±0.012，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 細胞核P65蛋白的Western blot檢測結(jié)果

2.3 VEGF對ORM1蛋白表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、低劑量VEGF組、高劑量VEGF組和PDTC組ORM1蛋白表達的相對灰度值分別為0.874±0.142、0.462±0.083、0.305±0.047、0.126±0.014，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 ORM1蛋白的Western blot檢測結(jié)果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在腦卒中發(fā)生時表達升高[6]，而且在損傷的脊髓處注入VEGF后可顯著減少凋亡細胞的數(shù)量。VEGF除了可以促進內(nèi)皮細胞分裂血管生成外，還可以保護神經(jīng)細胞。研究顯示，VEGF在發(fā)揮腦損傷后修復作用的同時，也可導致腦水腫的不良反應，研究VEGF致腦水腫的機制將會為克服VEGF的不良反應帶來新的作用靶點[7]。

ORM是內(nèi)皮細胞中主要的連接糖蛋白，是已明確的血腦屏障通透性相關(guān)基因[8]，Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ORM參與了VEGF導致的血腦屏障損傷過程。本研究顯示，VEGF可以顯著抑制內(nèi)皮細胞ORM1基因和蛋白的表達。韓雨薇等[10]的研究顯示，抑制VEGF誘導的血管內(nèi)皮緊密連接損傷，可以對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型發(fā)揮治療作用。NF-κB是體內(nèi)一個重要的信號調(diào)控通路，其通過P65蛋白入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)控一系列下游基因的表達，如產(chǎn)生炎癥因子增加腦卒中患者的腦損傷，或者上調(diào)一氧化氮合酶表達生成大量一氧化氮誘導神經(jīng)元細胞凋亡[11]。本研究顯示，VEGF可以顯著抑制NF-κB通路中的P65蛋白入核。VEGF對腦卒中的治療作用可能與抑制NF-κB通路相關(guān)[12]，但是P65蛋白入核減少后，ORM1基因和蛋白表達也出現(xiàn)了顯著減少，并且本研究中，使用NF-κB通路特異性抑制劑PDTC后，ORM1基因和蛋白的表達下降，提示NF-κB通路調(diào)控ORM1表達，其具體調(diào)控機制還有待進一步的研究闡明。阻斷NF-κB通路對ORM1的調(diào)控作用，將會為克服VEGF致腦水腫提供一個新的研究方向。臨床研究顯示，腦缺血再灌注損傷患者會出現(xiàn)VEGF一過性的升高，但很少出現(xiàn)腦水腫，只表現(xiàn)為視乳頭水腫、皮下水腫、漿膜腔積液，是否是因為VEGF治療時血液濃度大量快速的增加，或者血液中VEGF達到一定水平才會引起腦水腫的發(fā)生，有待進一步的研究來探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，VEGF通過抑制NF-κB通路下調(diào)了ORM1基因和蛋白表達，這可能是VEGF致腦水腫的作用機制。