張一佳，傅風華，曹燕卿，邵 帥，譚 博，蘇瑞斌

（1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

鎮(zhèn)靜劑是一類通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)使機體活動減少的藥物。臨床代表藥物有芬太尼、右美托咪定、咪達唑侖和丙泊酚等[1]，常用于治療失眠及圍手術(shù)期誘導麻醉。前期研究表明，鎮(zhèn)靜劑主要通過作用于中樞抑制性受體或抑制性配體門控離子通道發(fā)揮藥效[2]，這些受體和離子通道主要由蛋白質(zhì)組成。但目前對鎮(zhèn)靜過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)研究甚少，缺乏對介導鎮(zhèn)靜作用相關(guān)靶標分子的確證，極大地限制了新型鎮(zhèn)靜藥物的研發(fā)。因此有必要對參與調(diào)控藥物鎮(zhèn)靜作用的蛋白質(zhì)展開研究。

近年來，以磷酸化蛋白質(zhì)為研究對象的磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)快速發(fā)展，已成為發(fā)現(xiàn)藥物靶標、揭示疾病發(fā)生機制的新手段[3-4]。單個或多個特定位點快速、高效的磷酸化修飾往往是蛋白質(zhì)功能的開關(guān)[5-7]。一項睡眠需求分子底物定量磷酸化蛋白質(zhì)組學研究表明，長時間清醒會導致腦內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)過度磷酸化，而睡眠則會促進腦內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的去磷酸化[8]。提示與睡眠過程類似的鎮(zhèn)靜過程極有可能與腦內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化、去磷酸化水平密切相關(guān)。磷酸化蛋白質(zhì)組學將為闡述鎮(zhèn)靜藥物的作用機制提供新思路。

酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是一種存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非血紅素鐵酶，可催化酪氨酸的羥基化反應(yīng)，從而形成L-3，4-二羥基苯丙氨酸，是兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)生物合成中的限速步驟[9]。兒茶酚胺包括多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素，其既可作為中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)，又可作為內(nèi)分泌系統(tǒng)激素發(fā)揮作用。兒茶酚胺在腦內(nèi)可調(diào)節(jié)谷氨酸或γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等神經(jīng)遞質(zhì)的作用[10]。丙泊酚是GABAA受體變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，因其起效快、代謝快和毒副作用低等藥理學優(yōu)點成為最受歡迎的“麻醉乳”[11-13]。在丙泊酚發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用的同時常伴發(fā)意識喪失，其機制與丘腦參與神經(jīng)環(huán)路的調(diào)控密切相關(guān)。丘腦由上部、下部、腹側(cè)和背側(cè)4部分組成，是位于2大腦半球之間的復合體[14]，功能性腦成像研究證實，丘腦是介導藥物鎮(zhèn)靜和麻醉作用的關(guān)鍵腦區(qū)[15-19]。

本研究通過觀察丙泊酚誘導動物鎮(zhèn)靜后丘腦磷酸化蛋白質(zhì)表達水平及組學變化，以期發(fā)現(xiàn)參與鎮(zhèn)靜作用的潛在蛋白質(zhì)，進而探討TH參與調(diào)控丙泊酚鎮(zhèn)靜作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠（體質(zhì)量200～220 g）和SPF級雄性C57BL/6J小鼠（體質(zhì)量18～22 g）均由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。實驗動物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學研究院行為實驗中心，12 h晝夜交替，室溫25℃，濕度55%～65%，自由攝食飲水。

1.2 試劑和儀器

丙泊酚（英國AstraZeneca公司）；同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)標記試劑盒（加拿大AB SCIEX公司）；SDS裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA試劑盒、質(zhì)譜級乙腈和質(zhì)譜水（美國Thermo Scientific公司）；PMSF（美國Amresco公司）；三氟乙酸（上海生物工程股份有限公司）；無水乙醇和異丙醇（上海GENERALREAGENT公司）；胰酶（北京華利世公司）；甲酸（德國CNW Technologies GmbH公司）；小鼠抗人TH單克隆抗體（美國Sigma公司）；兔抗人TH第19位絲氨酸磷酸化多克隆抗體（上海愛必信生物科技有限公司）；兔抗人GAPDH多克隆抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠多克隆IgG二抗和山羊抗兔多克隆IgG二抗（美國Jackson Immuno Research公司）；5×上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液和RIPA裂解液（北京博邁德基因技術(shù)有限公司）；顯影液（美國Millipore公司）；甲基酪氨酸（metyrosine，美國Selleck公司）。

Tanon-5200顯影儀（中國天能公司）；T4.0 AH SLO-BLO酶標儀（美國Molecular Devices公司）；TGL-16A臺式冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；DYY-6C SDS-PAGE凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）；ST-360酶標儀（上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）；FA2004B電子天平（上海越平科學儀器有限公司）。Q Exactive HF質(zhì)譜儀、Ultimate 3000液相系統(tǒng)、Acclaim PepMap100色譜預柱（100 μm×2 cm）、Acclaim PepMap RSLC色譜分析柱（75 μm×15 cm）（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 丙泊酚誘導鎮(zhèn)靜模型的生物學樣品制備

SD大鼠分為丙泊酚組和正常對照組，分別ip給予丙泊酚100 mg·kg-1或等體積生理鹽水。誘導大鼠翻正反射消失第30分鐘時處死大鼠并分離鼠腦，于冰上迅速取出丘腦置于無菌凍存管中，投入液氮中快速凍存后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱備用。

1.4 磷酸化蛋白質(zhì)的提取、酶解標記和肽段富集

蛋白質(zhì)提?。喝?.3制備的丘腦樣品，加入SDS裂解液（包含PMSF 1 mmol·L-1），冰上超聲破碎，14 300×g離心10 min取上清，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

酶解標記：參考超濾管酶解法[20]將蛋白質(zhì)樣品進行酶解，向酶解后的蛋白質(zhì)溶液加入iTRAQ試劑，渦流混勻，3757×g離心5 min并重復1次，室溫放置2 h后加入200 μL水反應(yīng)30 min，得到標記肽段，凍干后于-80℃保存。

肽段富集：向已標記的肽段中加入磷酸化肽富集液（含2%三氟乙酸和60%乙腈的谷氨酸飽和溶液）100 μL溶解樣品，渦旋混勻15 min，瞬時離心使液體沉積于管底。按照蛋白質(zhì)∶TiO2=1∶4的質(zhì)量比例加相應(yīng)體積TiO2溶液，渦旋15 min，3757×g離心1 min，棄上清并加400 μL洗滌液1（含0.5% 三氟乙酸和50%乙腈）渦旋15 min，3757×g離心1 min棄去上清，并重復一次。向沉淀中加400 μL洗滌液2（含0.1%三氟乙酸和50%乙腈）渦旋15 min，3757×g離心1 min棄上清，并重復一次。加10%NH3·H2O 100 μL 洗脫磷酸化肽段，渦旋 15 min，6356×g離心3 min，收集上清液，再重復一次。最后合并收集的上清液，14 300×g離心5 min收集上清液，用真空濃縮儀旋干備用。

1.5 采用色譜和質(zhì)譜法蛋白質(zhì)定量

色譜條件：經(jīng)1.4收集的樣品以300 μL·min-1的流速經(jīng)色譜柱分離。流動相（體積比）：A相為水-甲酸（99.9∶0.1）、B相為乙腈-水-甲酸（80∶19.9∶0.1）。梯度洗脫條件：0～5 min，3%～7%B；5～125 min，7%～25%B；125～140 min，25%～35%B；140～145 min，35%～95%B；145～150 min，95%B。

質(zhì)譜條件：在正離子模式下，一級質(zhì)譜質(zhì)量分辨率60 000，自動增益控制值4×105；質(zhì)譜掃描設(shè)定為全掃描質(zhì)核比范圍350～1550，并對其中10個最高峰進行質(zhì)譜掃描；所有質(zhì)譜圖譜采集使用數(shù)據(jù)依賴型的正離子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量38。質(zhì)譜的分辨率15000，自動增益控制1×105，動態(tài)排除時間40 s。數(shù)據(jù)處理：實驗數(shù)據(jù)采用Proteome DiscovererTM2.2軟件分析，所用數(shù)據(jù)庫為Uniprot大鼠數(shù)據(jù)庫?？刂票捶咏M及對照組肽段鑒定的假陽性率＜1%。將絕對肽段數(shù)＞1且評分＞0的蛋白質(zhì)確定為可信蛋白質(zhì)。丙泊酚組與對照組間差異磷酸化蛋白篩選標準為：變化倍數(shù)值＞1.2（上調(diào)）或＜0.833（下調(diào)）且具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。差異磷酸化蛋白質(zhì)基因本體（gene ontology，GO）富集分析。

利用OmicsBean組學數(shù)據(jù)整合分析云平臺，對差異磷酸化蛋白進行了GO富集分析和功能注釋。GO功能注釋包括生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）3個層面。

1.6 Western印跡法檢測大鼠丘腦TH第19位絲氨酸磷酸化水平

1.3制備的丘腦組織加入300 μL裂解液（包含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑）后勻漿、離心、取上清并測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)沸水浴變性后進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗（稀釋倍數(shù)為1∶1000）4℃過夜，二抗（稀釋倍數(shù)為1∶5000）室溫孵育1 h，進行圖像采集。利用Gis Analysis軟件分析蛋白質(zhì)條帶積分吸光度，以TH第19位絲氨酸磷酸化蛋白積分吸光度值與TH總蛋白積分吸光度值的比值反映其磷酸化水平。

1.7 TH抑制劑對丙泊酚誘導的C57BL/6J小鼠鎮(zhèn)靜作用實驗

將小鼠分為5組，分別ip給予丙泊酚70，80，90，100和120 mg·kg-1（n=18～23），并分別于給予丙泊酚前30 min ip給予TH抑制劑甲基酪氨酸20 mg·kg-1，觀察各組小鼠翻正反射消失的誘導時間、持續(xù)時間（未出現(xiàn)翻正反射消失的小鼠，持續(xù)時間記為0 min）和翻正反射消失率。

1.8 統(tǒng)計學分析

利用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計，計量資料均以±s表示。大鼠丙泊酚誘導差異磷酸化蛋白質(zhì)篩選和小鼠翻正反射消失誘導時間采用Studentt檢驗。小鼠翻正反射消失持續(xù)時間采用無重復測量two-way ANOVA及Bonferroni檢驗；采用Log（agonist）vs.normalized response-Variable Slope模塊進行量效關(guān)系分析，并計算ED50及95%置信區(qū)間。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚誘導鎮(zhèn)靜模型大鼠丘腦TH第19位絲氨酸磷酸化

質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，丙泊酚（100 mg·kg-1）組大鼠丘腦內(nèi)共篩選出92個差異磷酸化蛋白質(zhì)，其中41個（45%）上調(diào)，51個（55%）下調(diào)。根據(jù)差異磷酸化蛋白質(zhì)結(jié)果，GO富集分析出30個具有顯著性的條目（表1～表3），這些條目主要包含25個差異磷酸化蛋白質(zhì)（表4和表5）。GO生物過程分析結(jié)果顯示（表1），TH 參與了前腦發(fā)育（GO：0030900）、對生物堿反應(yīng)（GO：0043279）、對鹽應(yīng)激（GO：0009651）、酪氨酸的多巴胺生物合成（GO：0006585）、對光刺激的反應(yīng)（GO：0009416）等多種生物過程（P＜0.05）。GO分子功能分析結(jié)果顯示（表2），TH的分子功能與TH活性密切相關(guān)（GO：0004511）（P＜0.05）。GO細胞組分分析結(jié)果（表3）顯示，TH分布在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（GO：0005790）和黑素體膜（GO：0033162）。質(zhì)譜結(jié)果顯示（表4和表5），TH第19位絲氨酸磷酸化顯著下調(diào)（P＜0.01），提示該蛋白質(zhì)可能參與調(diào)控丙泊酚誘導的鎮(zhèn)靜作用。

Tab.1 Gene ontology（GO）biological process analysis of differentially expressed phosphorylated proteins in SD rat thalamus induced by propofol 100 mg·kg-1

Tab.2 GO molecular function analysi of differentially expressed phosphorylated proteins in SD rat thalamus induced by propofol 100 mg·kg-1

Tab.3 GO cellular component analysis of differentially expressed phosphorylated proteins in SD rat thalamus induced by propofol 100 mg·kg-1

2.2 丙泊酚誘導大鼠丘腦TH第19位絲氨酸磷酸化變化

Western印跡法對TH第19位絲氨酸磷酸化和TH表達水平檢測結(jié)果顯示（圖1），與正常對照組相比，丙泊酚處理組大鼠丘腦p-TH（Ser19）/TH的比值顯著降低（P＜0.05）。表明丙泊酚（100 mg·kg-1）誘導大鼠丘腦TH第19位絲氨酸磷酸化顯著下調(diào)，與質(zhì)譜結(jié)果變化趨勢一致。

2.3 甲基酪氨酸對丙泊酚誘導C57BL/6J小鼠翻正反射消失行為的影響

TH抑制劑甲基酪氨酸干預丙泊酚鎮(zhèn)靜作用行為實驗結(jié)果（圖2，表6）表明，單用丙泊酚70～120 mg·kg-1可劑量依賴性地增加C57BL/6J小鼠翻正反射消失率，丙泊酚120 mg·kg-1致翻正反射消失率為 100%，ED50為 92.32 mg·kg-1（95%CI：90.60～94.08，R2=0.9969）；甲基酪氨酸+丙泊酚組較單用丙泊酚組翻正反射消失率升高，量效曲線左移，ED50為85.38 mg·kg-1（95%CI：81.30～89.67，R2=0.9768）。甲基酪氨酸+丙泊酚100或120mg·kg-1組翻正反射消失的誘導時間較單用丙泊酚組顯著縮短（P＜0.01）。甲基酪氨酸+丙泊酚組較單用丙泊酚組持續(xù)時間延長（F1195=24.42，P＜0.01），其中，甲基酪氨酸+丙泊酚90，100和120 mg·kg-1翻正反射消失持續(xù)時間較單用丙泊酚組顯著延長（P＜0.01）。提示TH抑制劑甲基酪氨酸可顯著增強丙泊酚的鎮(zhèn)靜作用。

Tab.4 Up-regulation of phosphorylated proteins in thalamus in propofol-induced sedative SD rats

Tab.5 Down-regulation of phosphorylated proteins in thalamus of propofol-induced sedative SD rats

Fig.1 Confirmation of changes of tyrosine hydroxylase phosphorylation at Ser19[p-TH（Ser19）]in thalamus of rats by Western blotting.See Tab.1 for the rat treatment，each lane corresponding to a rat.B was the quantitative analysis result of p-TH（Ser19）/TH.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with saline group.

Fig.2 Dose-response effect of metyrosine on ratio of LORR induced by propofol.C57BL/6J mice were injected with metyrosine（20 mg·kg-1，ip）30 min before propofol（70，80，90，100 and 120 mg·kg-1，ip）.Non-liner regression was performed between propofol doses and LORR ratio，ED50was estimated from dose-response curve.n=18-23.

3 討論

丙泊酚鎮(zhèn)靜作用機制復雜且可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)功能性蛋白質(zhì)的功能密切相關(guān)[8]。蛋白質(zhì)的磷酸化及去磷酸化修飾在蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。前期研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化通過調(diào)節(jié)配體門控離子通道的功能參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導[21]。此外，異常的磷酸化蛋白質(zhì)與許多疾病的發(fā)生密不可分，如tau蛋白的過度磷酸化是阿爾茨海默病發(fā)病機制的重要原因[22]。通過磷酸化蛋白質(zhì)組學篩選并分析丙泊酚鎮(zhèn)靜作用導致的磷酸化蛋白質(zhì)變化，明確其作用機制具有重要意義。

磷酸化蛋白質(zhì)組學是蛋白質(zhì)組學的重要分支，可從整體角度研究某一階段細胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)的表達狀態(tài)，并為研究藥物作用機制提供蛋白質(zhì)磷酸化修飾位點及數(shù)量。文獻報道，快速起效的吸入類麻醉藥物異氟烷誘導小鼠鎮(zhèn)靜模型的海馬體磷酸化蛋白質(zhì)組學顯示，給藥后30 min發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶、糖原合成酶激酶-3β等重要蛋白質(zhì)的磷酸化發(fā)生變化[23]。因此，本研究將動物鎮(zhèn)靜模型與定量磷酸化蛋白質(zhì)組學相結(jié)合，在丙泊酚誘導翻正反射消失第30 min后取出樣本，研究鎮(zhèn)靜大鼠丘腦內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化及去磷酸化水平變化，發(fā)現(xiàn)了92個磷酸化水平發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，并明確了它們的磷酸化位點。一方面提示丘腦中可能存在多種磷酸化蛋白質(zhì)參與調(diào)控丙泊酚誘導的鎮(zhèn)靜作用，另一方面為進一步闡述丙泊酚或其他中樞鎮(zhèn)靜劑的藥理學機制及關(guān)鍵靶分子提供線索。

與以往單一蛋白質(zhì)功能研究相比，本研究采用的定量質(zhì)譜方法高通量篩選出磷酸化蛋白質(zhì)，表達信息數(shù)據(jù)規(guī)模較大。進一步結(jié)合生物信息學，對研究發(fā)現(xiàn)的差異磷酸化蛋白質(zhì)按照生物過程、細胞組分、分子功能3個層面歸類，并從中篩選出與多巴胺生物合成相關(guān)的TH開展后續(xù)研究。

Tab.6 Effect of metyrosine on the propofol-induced LORR in C57BL/6J mice

Western印跡結(jié)果表明，丙泊酚誘導的鎮(zhèn)靜模型大鼠丘腦TH第19位絲氨酸磷酸化水平顯著下調(diào)，與磷酸化蛋白質(zhì)組學質(zhì)譜檢驗結(jié)果一致。行為學研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚70～120 mg·kg-1可劑量依賴性地誘導小鼠翻正反射消失率增加，與文獻[24]報道一致。甲基酪氨酸可使丙泊酚鎮(zhèn)靜作用量效曲線左移，顯著延長高劑量丙泊酚誘導的小鼠翻正反射消失持續(xù)時間，說明抑制TH活性可增強丙泊酚的鎮(zhèn)靜效應(yīng)。

文獻報道，TH第19位絲氨酸磷酸化由鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ激活[25-26]，而該激酶激活還可引起其他反應(yīng)，如調(diào)控腺苷酸環(huán)化酶催化環(huán)磷酸腺苷的合成與分解[27]，這些同步效應(yīng)是否協(xié)同參與丙泊酚的鎮(zhèn)靜作用仍需進一步研究。

綜上，本研究基于磷酸化蛋白質(zhì)組學初步發(fā)現(xiàn)了多種可能參與丙泊酚鎮(zhèn)靜作用的磷酸化蛋白質(zhì)，并結(jié)合生物信息學分析和行為藥理學研究方法發(fā)現(xiàn)，抑制TH活性可增強丙泊酚鎮(zhèn)靜作用，為深入研究鎮(zhèn)靜類藥物的作用機制提供了線索。