張作艷，吳林文，馬家思，鄭珊珊，何 鐳，張 翀，曾玲暉

（浙江大學城市學院醫(yī)學院，浙江 杭州 310015）

胃癌是我國發(fā)病率和致死率較高的惡性腫瘤，手術切除后復發(fā)和轉移是影響胃癌患者生存和預后的主要因素[1]。因此，探尋參與胃癌轉移的關鍵分子具有重要的意義。己糖激酶結構域蛋白1（hexokinase domain-containing protein 1，HKDC1）是目前發(fā)現(xiàn)的第5種己糖激酶，在人體中具有調節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用[2-3]。肝中的HKDC1在糖代謝、胰島素敏感性和孕期營養(yǎng)平衡等方面均發(fā)揮了重要作用，HKDC1過表達可改善全身葡萄糖耐量，增強肝和外周胰島素敏感性[4]。雖然目前對于HKDC1與腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體作用機制尚不明確，但是有文獻報道，通過一種基于計算的抗癌活性富集分析方法發(fā)現(xiàn)，HKDC1有望成為肺癌治療的一個全新藥物治療靶點[5]。另有文獻報道，HKDC1在肝癌組織中過度表達，沉默HKDC1能夠抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳遞抑制肝癌細胞的增殖和遷移，高表達HKDC1與肝癌患者不良預后密切相關[6]。然而，HKDC1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制尚不明確，本研究探討沉默HKDC1的表達與胃癌轉移和上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人胃癌細胞（NCI-N87，BGC-823和HGC-27）均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。磺酰羅丹明 B（sulforhodamine B，SRB）染料購自美國Sigma-Aldrich公司；一抗：兔抗人HKDC1單抗（ab228729）購自美國Abcam公司，兔抗人E-鈣黏蛋白單抗（3195P）、小鼠抗人N-鈣黏蛋白單抗（14215S）和兔抗人Snail單抗（3879S）購自美國CST生物技術公司，兔抗人GAPDH單抗（sc-25778）購自美國Santa公司；二抗：辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG抗體（71039511）和山羊抗兔IgG抗體（A80400644）購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；jetPRIME（114-15）轉染試劑購自法國Polyplus Transfection SA公司；Gluta-MAX?谷氨酰胺培養(yǎng)基及添加劑（35050061）和丙酮酸鈉溶液（11360070）購自美國Gibco公司；siRNA購自 上 海 吉瑪基因。 Transwell小 室（8 μm，6297045）購自美國Corning公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；SW-CJ-2J超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司；GZX-DH-40×45型倒置顯微鏡購自德國Leica公司；iCycle實時定量PCR系統(tǒng)、電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將BGC-823和HGC-27細胞接種于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含青霉素100 kU·L-1，鏈霉素0.1 g·L-1，10%胎牛血清），NCI-N87接種于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含青霉素100 kU·L-1，鏈霉素0.1 g·L-1，10%胎牛血清，1%GlutaMAX?谷氨酰胺培養(yǎng)基及添加劑、1 mmol·L-1丙酮酸鈉溶液）置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 HKDC1 siRNA序列的篩選和轉染

根據(jù)siRNA的設計原則以及GenBank中的HKDC1的基因序列，設計出具有特異性的針對HKDC1的干擾序列小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）-1和siRNA-2，以及與HKDC1序列無同源性的陰性對照siRNA（negative control siRNA，siRNA-NC）。該序列設計由上海吉瑪公司完成。HKDC1 siRNA-1序列為5'-CCAACGCCCAAUGAAAUCATT-3，HKDC1 siRNA-2序列為 5'-GAGCUUGUCAGGCUUAUCUTT-3'，陰性對照siRNA序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。

取對數(shù)生長期的胃癌細胞NCI-N87，BGC-823和HGC-27，按照每孔1.5×105細胞種入6孔板，過夜，待細胞生長至30%～40%融合度時進行轉染，將siRNA 4 μL加入jetPRIME 緩沖液200 μL中，溫和混勻，室溫孵育5 min，加入jetPRIME rejent試劑4 μL；再次溫和混勻，室溫孵育15～20 min。棄6孔板中培養(yǎng)液，用Opti-MEM洗1遍，每孔加入800 μL無雙抗的Opti-MEM，并同時將混合好的含有siRNA的200 μL試劑加入6孔板中，4 h后補加入含20%血清的培養(yǎng)液1 mL。轉染24 h后獲得NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞，BGC-823-siRNA-NC，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞，HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞。

1.4 siRNA對HKDC1表達的抑制

轉染24 h后收集細胞，用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，4℃，13 000×g離心30 min后，BCA法測定總蛋白濃度后進行Western印跡實驗，檢測siRNA對HKDC1表達的抑制效果，并計算抑制率。用Image J軟件對蛋白條帶進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析，蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IA內參蛋白比值表示。HKDC1抑制率（%）=（陰性對照組HKDC1蛋白表達-沉默組HKDC1蛋白表達）/陰性對照組HKDC1蛋白表達×100%。

1.5 SRB染色法測定細胞存活率

將轉染24 h后的胃癌細胞經(jīng)胰酶消化，按每孔6×104細胞接種于96孔板，再孵育72 h后，棄上清，每孔加入100 μL三氯乙酸固定，4℃冰箱放置過夜，去離子水沖洗5遍后烘干，每孔加入0.4%（m/V）SRB染液50 μL，避光染色20 min，1%冰醋酸洗滌5遍后，烘干，加入三羥甲基氨基甲烷堿液100 μL，輕拍混勻，使用酶標儀測定540 nm處的吸光度A540nm，并計算細胞存活率。實驗重復3次。細胞存活率（%）=（轉染組A540nm-空白對照組A540nm）/（陰性對照組A540nm-空白對照組A540nm）×100%。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移能力

將HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞和NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞以每孔8×104細胞，BGC-823-siRNA-NC，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞以每孔1×105細胞接種于無血清的200 μL培養(yǎng)基的Transwell小室上室，下室加入500 μL 20%胎牛血清培養(yǎng)基，置于37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出后用1%甲紫甲醇溶液固定染色30 min，用棉棒清除上室未穿過細胞，PBS洗滌后隨機選取5個視野，顯微鏡下拍照，進行細胞計數(shù)，比較細胞遷移能力。

1.7 Transwell法檢測細胞侵襲能力

將0.5%的基質膠按照每孔100 μL加入Transwell上室，37℃培養(yǎng)箱放置30 min后，取出吸取殘余液體，備用。將HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞和NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞以每孔1×105細胞，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞以每孔1.2×105細胞接種于無血清的200 μL培養(yǎng)基的Transwell小室上室，下室加入500 μL 20%胎牛血清培養(yǎng)基，置于37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出后用1%甲紫甲醇溶液固定染色30 min，用棉棒清除上室細胞，PBS洗滌后，顯微鏡下拍照，進行細胞計數(shù)，比較細胞侵襲能力。

1.8 Western印跡法檢測HKDC1蛋白和EMT相關蛋白表達

收集轉染24 h后的胃癌細胞，用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，4℃，13 000×g離心30 min后，BCA法測定總蛋白：SDS-PAGE凝膠電泳后，轉膜，封閉 1 h，加一抗 4℃孵育過夜（HKDC1：1∶1000；E-鈣黏蛋白：1∶1000；N-鈣黏蛋白：1∶1000 ；Snail：1∶1000；GAPDH：1∶500）?；厥找豢?，PBS清洗3次后加二抗（HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體1：5000；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體1∶5000），室溫孵育1 h后曝光。用Image J軟件對蛋白條帶進行IA分析。待測蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IA內參蛋白比值表示。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 22.0軟件，各組間的比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），組間兩兩比較采用Studentt檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 siRNA對HKDC1表達的抑制效果

Western印跡結果顯示（圖1），轉染siRNA-1和siRNA-2后，與siRNA-NC組相比，3種細胞HKDC1蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。對NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞的抑制率分別為（20.5±0.1）%和（48.6±0.1）%，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞分別為（56.5±0.1）%和（58.9±0.1）%，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞分別為（63.5±0.1）%和（85.9±0.1）%。

Fig.1 Silence effect of siRNA on expression of hexokinase domain containing 1（HKDC1）protein in NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells by Western blotting.Gastric cancer cells were transfected by negative control siRNA（siRNA-NC），HKDC1 siRNA-1（siRNA-1）and HKDC1 siRNA-2（siRNA-2）for 24 h，Western blotting was used to detect the expression of HKDC1.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

2.2 沉默HKDC1表達對胃癌細胞增殖的影響

由圖2顯示，與對應的siRNA-NC組細胞相比，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞的存活率降低（P＜0.01），BGC-823-siRNA-1，BGC-823-siRNA-2，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞的存活率也均顯著低于siRNA-NC組（P＜0.05，P＜0.01），提示沉默HKDC1表達可顯著抑制胃癌細胞增殖。

Fig.2 Effect of silence HKDC1 on cell viability of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells transfected by siRNA were incubated for 72 h and the SRB assay was used to detect the cell viability.Cell viability（%）=（A540 nmof siRNA group-A540 nmof blankgroup）/（A540 nmof siRNA-NCgroup-A540 nmof blank group）×100%.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

2.3 沉默HKDC1表達對胃癌細胞遷移能力的影響

Transwell實驗結果顯示（圖3），轉染siRNA-1和siRNA-2后，3種細胞在Transwell小室內培養(yǎng)24 h后，細胞的遷移數(shù)如圖3B所示。與對應siRNA-NC組相比，轉染siRNA-1和siRNA-2細胞體外遷移能力顯著降低（P＜0.01），表明沉默HKDC1表達可抑制胃癌細胞遷移。

2.4 沉默HKDC1表達對胃癌細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結果如圖（圖4），轉染siRNA-1和siRNA-2后，3種細胞在Transwell小室內培養(yǎng)24 h，細胞的侵襲數(shù)如圖4B所示。與對應siRNA-NC組相比，轉染siRNA-1和siRNA-2細胞體外侵襲能力顯著降低（P＜0.01），提示沉默HKDC1可抑制胃癌細胞體外侵襲能力。

2.5 沉默HKDC1表達對EMT相關蛋白表達的影響

Western印跡結果（圖5）顯示，與siRNA-NC相比，分別轉染siRNA-1和siRNA-2 24 h后，3種細胞E-鈣黏蛋白表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；N-鈣黏蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；Snail蛋白表達在NCI-N87和BGC-823細胞中顯著下降（P＜0.01）；而在HGC-27細胞中，僅轉染siRNA-2的細胞表達顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of silence HKDC1 on migration of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells were cultured in Transwell for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

Fig.4 Effect of silence HKDC1 on invasion of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells were cultured in Transwell for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

Fig.5 Effect of silence HKDC1 on protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Snail in NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA by Western blotting.See Fig.1 for the cell transfection.B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

3 討論

胃癌是全球第五大最常被診斷的癌癥，也是第三大與癌癥死亡相關原因，胃癌患者的5年生存率僅為26%[7-8]。前期臨床TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)，HKDC1在胃癌腫瘤組織中高表達，且HKDC1高表達患者較低表達患者預后更差，進一步提示HKDC1可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究首先利用siRNA沉默HKDC1表達，發(fā)現(xiàn)siRNA-1和siRNA-2均能夠特異性抑制HKDC1的表達。隨后發(fā)現(xiàn)，轉染siRNA-1和siRNA-2后，與siRNA-NC組相比，3種細胞的存活率降低，提示沉默HKDC1表達可顯著抑制胃癌細胞的增殖。在前期預實驗中發(fā)現(xiàn)，轉染siRNA-NC對HKDC1表達無影響，與正常對照組細胞無差別，因此本研究中未設細胞對照組。

胃癌復發(fā)和高轉移是威脅患者生存的重要因素[9]，闡明影響胃癌轉移的關鍵分子將為晚期胃癌治療提供生物標志物和治療靶點。本研究用siRNA沉默HKDC1后，檢測胃癌細胞體外遷移和侵襲的能力變化，發(fā)現(xiàn)與siRNA-NC組相比，3種細胞HKDC1表達被抑制后，體外遷移和侵襲的能力均顯著下降，提示靶向沉默HKDC1可能是抑制胃癌轉移的有效途徑。據(jù)報道，HKDC1在乳腺癌細胞和臨床乳腺癌腫瘤組織中也存在高表達，沉默HKDC1能夠在體內和體外水平抑制乳腺癌細胞的增殖以及腫瘤的生長和轉移[10]。因此，靶向HKDC1信號通路可能是抑制腫瘤轉移的新型治療策略。

EMT是指上皮細胞轉化為具有間質表型及生物學特性的生物學過程，其異常與腫瘤轉移、耐藥和腫瘤干細胞特性密切相關。鈣黏蛋白是一種鈣依賴性的負責調節(jié)細胞間黏附作用的跨膜糖蛋白家族[11]。分為10多個亞類，包括EMT重要的標志物E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和跨膜糖蛋白等[12]。EMT發(fā)生過程中，細胞-細胞間黏附的上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達下調，而間質細胞標志物N-鈣黏蛋白、纖黏蛋白（fibronectin）和波形蛋白（vimentin）等表達上調。E-鈣黏蛋白參與調節(jié)細胞增殖、侵襲和遷移的信號通路，E-鈣黏蛋白失調導致胃上皮細胞功能障礙并導致胃癌發(fā)展[13]。此外，其表達變化可反映胃黏膜的的病理狀態(tài)。在胃癌中，可溶性的E-鈣黏蛋白可作為胃癌的預后分子標志物[14]和獨立的預后因子[15]。本研究結果表明，沉默HKDC1表達能促進E-鈣黏蛋白的表達，抑制N-鈣黏蛋白的表達，表明HKDC1可能通過抑制EMT影響胃癌細胞的遷移和侵襲能力。轉錄因子Snail可促進EMT的發(fā)生，并在多種腫瘤中呈高表達。Snail高表達的腫瘤組織中，E-鈣黏蛋白表達常下降。本研究結果表明，沉默HKDC1表達可以抑制Snail蛋白的表達。但HKDC1如何調控胃癌細胞EMT發(fā)生還有待更深入的研究。

綜上所述，沉默HKDC1表達后，胃癌細胞增殖、EMT和侵襲運動能力均受到抑制，提示HKDC1可能參與胃癌細胞轉移，HKDC1有可能成為胃癌治療的潛在分子靶點。