基于數(shù)字PCR 的不同品種鴨組織中線粒體與核DNA拷貝數(shù)差異研究

紀(jì)藝 徐曉麗 姜媛媛 汪小福 徐俊鋒 李玥瑩 陳笑蕓

（1. 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310021）

食品安全關(guān)乎人們的身體健康和生命安全，已經(jīng)成為當(dāng)前全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)肉制品摻假屢禁不止，肉制品以次充好，引起人們對(duì)食品安全的高度關(guān)注［1］。肉及肉制品動(dòng)物源性成分核酸檢測(cè)是判斷摻假肉的最常用技術(shù)之一［2］。與核DNA相比，線粒體DNA 具有其特殊的母系遺傳方式和胞內(nèi)多拷貝帶來(lái)的高靈敏度檢測(cè)的特征，因此，除被廣泛用于飼料、生鮮及肉制品的來(lái)源追蹤和物種成分鑒別等研究外，線粒體DNA 在國(guó)內(nèi)外還被用于摻假肉類的定量檢測(cè)［3-7］。

鴨肉是我國(guó)較為便宜的畜牧業(yè)肉類品種，也是最常見的被用于摻假的肉品。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外PCR 技術(shù)在肉類摻假以及肉類品種來(lái)源分析中以及得到廣泛應(yīng)用［8-9］。林霖等［10］構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法用于檢測(cè)番鴨、家鴨DNA 成分，為識(shí)別摻假肉類提供了技術(shù)支持。但是，熒光定量PCR 需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于不同組織中線粒體的拷貝數(shù)不同［11-12］，使得基于線粒體DNA 的肉類摻假定量檢測(cè)存在客觀的技術(shù)局限性。微滴式數(shù)字PCR 可以通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，對(duì)每個(gè)微滴逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。

本研究通過(guò)數(shù)字PCR 技術(shù)測(cè)定不同品種鴨不同組織中線粒體DNA 和核DNA 的拷貝數(shù)，對(duì)線粒體和核DNA 的拷貝數(shù)比值進(jìn)行分析，旨在探尋鴨肉制品摻假定量檢測(cè)的最佳組織來(lái)源，并為檢測(cè)機(jī)構(gòu)定量鴨肉摻假比例篩選合適的靶DNA 提供一定的 借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

不同品種（紹興鴨、北京鴨、縉云麻鴨、攸縣麻鴨、高郵麻鴨、金定麻鴨、山麻鴨、GD-紹興鴨和馬太湖鴨）的生鮮鴨來(lái)源于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，其中北京鴨和紹興鴨的取樣組織包括鴨血、鴨胸、鴨肝、鴨皮、鴨心及鴨腿；縉云麻鴨、攸縣麻鴨、高郵麻鴨和GD-紹興鴨的取樣組織包括鴨胸和鴨腿；山麻鴨、金定麻鴨、攸縣鴨和馬太湖鴨的取樣組織為鴨血。

動(dòng)物組織DNA 試劑盒購(gòu)自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；血液DNA 提取試劑盒購(gòu)自浙江易思得生物科技有限公司；預(yù)混液ddPCR Supermix for Probes 和Droplet Generation Oil for Probes 購(gòu) 自 美 國(guó)Bio-Rad；引物和探針由杭州尚亞賽生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理和DNA 提取 用無(wú)菌手術(shù)刀將試驗(yàn)材料切成小塊，先在液氮中將樣品迅速冷凍并研磨成粉末。按照試劑盒說(shuō)明書的要求稱取一定量的樣品，采用相應(yīng)的試劑盒對(duì)所有樣品進(jìn)行 DNA 提取，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行重復(fù)。

1.2.2 DNA 濃度、純度和鹽殘留測(cè)定 各取1 μL 的DNA 樣品溶液用Qubit 2.0 進(jìn)行DNA 的濃度檢測(cè)，利用NanoDrop 2000 進(jìn)行純度和鹽殘留等指標(biāo)的 檢測(cè)。

1.2.3 鴨源性微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)體系的建立 鴨線粒體基因和核單拷貝基因的PCR 引物和探針序列參考文獻(xiàn)合成［13］，線粒體12S rRNA 基因的上游引物序列為5′-GATCAAAATGCAACTAAGCTGTCGC-3′；下游引物序列為5′-GACCTGTCTTATTAGCGGGGTGCTG-3′；探針序列為FAM-CCCTAAATCTTGATACTTACCCTACCGAA-BHQ1；IL-2 核基因的上游序列為5′-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3′，下 游 序列 為5′-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3′，探針序列為FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1。將上述提取的不同鴨組織DNA 稀釋至同一濃度后作為模板，進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng)。PCR 體系為20 μL，含前述步驟所得的DNA 模板2 μL，2×ddPCR Supermix for Probes 反應(yīng)液10 μL，10 μmol/L 的上下游引物各1 μL，10 μmol/L 的探針0.5 μL，其余用ddH2O 補(bǔ)足到20 μL。

PCR 反應(yīng)程序中退火溫度的高低對(duì)微滴下雨現(xiàn)象有顯著的影響，在反應(yīng)程序的退火環(huán)節(jié)，設(shè)置了溫度梯度。根據(jù)PCR 反應(yīng)的熱圖，鴨源性基因組DNA 在不同的退火溫度下，微滴的熒光強(qiáng)度存在較顯著差異（圖1）。比較不同退火溫度的數(shù)字PCR 擴(kuò)增熱圖，發(fā)現(xiàn)在退火溫度為60℃時(shí)，沒(méi)有明顯的下雨現(xiàn)象，確定數(shù)字PCR 的最佳退火溫度60℃。最終，確定微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性10 min；40 個(gè)循環(huán)（94℃ 變性15 s，60℃退火延伸1 min）；98℃變性10 min；4℃保存。

圖1 微滴式數(shù)字PCR 退火溫度優(yōu)化擴(kuò)增熱圖

1.2.4 DNA 拷貝數(shù)定量分析 微滴式數(shù)字PCR 結(jié)束后，將96 孔板置入微滴讀取儀中讀取信號(hào)，使用軟件QuantaSoft Version 1.6.6.0320 分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得DNA 模板拷貝數(shù)的絕對(duì)定量結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 DNA質(zhì)量測(cè)定

采用熒光計(jì)Qubit 2.0 測(cè)定DNA 濃度，利用NanoDrop 2000 核酸蛋白測(cè)定儀來(lái)測(cè)定DNA 純度和鹽殘留情況，提取DNA 的濃度及純度等參數(shù)見表1。結(jié)果顯示，提取的DNA 濃度在20 ng/μL-200 ng/μL 之間，說(shuō)明在不同組織中都能提取到較理想的DNA；OD260/OD280比值基本都在1.8-2.0 之間，說(shuō)明蛋白質(zhì)和RNA 等雜質(zhì)殘留少；OD260/OD230比值普遍大于2.0，說(shuō)明核酸中鹽分等雜質(zhì)殘留少，提取的DNA 質(zhì)量較好。鑒于所提取組織的DNA 濃度不同，因此將工作濃度統(tǒng)一調(diào)整為8.89 ng/μL，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 鴨源性微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)體系的建立

微滴式數(shù)字PCR 可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量，如在反應(yīng)體系中加入GD-紹興鴨胸和馬太湖麻鴨血的DNA，利用微滴式數(shù)字PCR 分別讀取IL-2核基因和12S rRNA 線粒體基因的拷貝數(shù)。從圖2 可知，灰色為陰性微滴，藍(lán)色為陽(yáng)性微滴，在FAM 熒光通道上均擴(kuò)增出鴨源性的信號(hào)，且得到良好的擴(kuò)增，滿足分析要求。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同鴨品種間的DNA 其IL-2 核基因的拷貝數(shù)較為穩(wěn)定，而12S rRNA 線粒體基因的拷貝數(shù)變化較大，表明線粒體的豐度存在較大差異。

2.3 DNA拷貝數(shù)分析

結(jié)果如表2 所示，微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng)測(cè)得8.89 ng/μL 的DNA 中含有的核DNA 拷貝數(shù)平均值為13 470，與理論值［14］接近，所有組織中核DNA 拷貝數(shù)的變異系數(shù)為11.16%，小于線粒體DNA 拷貝數(shù)的變異系數(shù)（26.23%），表明核DNA 是開展鴨肉制品摻假定量檢測(cè)的最適DNA 來(lái)源。線粒體DNA的拷貝數(shù)在不同鴨品種乃至同一品種不同組織間存在較大差異。整體而言，鴨肝中線粒體拷貝數(shù)最高；鴨心、鴨胸肉、鴨腿肉和鴨皮中的線粒體拷貝數(shù)次之；鴨血中的線粒體拷貝數(shù)最低。

表1 不同品種鴨組織DNA 的提取質(zhì)量

2.4 線粒體和核DNA拷貝數(shù)穩(wěn)定性分析

線粒體DNA 的拷貝數(shù)和核DNA 拷貝數(shù)的比值能反映提取DNA 中線粒體的相對(duì)豐度。如表2 所示，鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值最高；鴨心及鴨胸/腿肉中的拷貝數(shù)比值次之；鴨皮的拷貝數(shù)比值再次之；鴨血的拷貝數(shù)比值最低。分析6 個(gè)不同組織中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值后可知，鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值的變異系數(shù)最大；鴨血和鴨心次之；而鴨腿肉的變異系數(shù)最小（4.10%）。

圖2 微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)不同品種鴨組織DNA 核和線粒體DNA 的拷貝數(shù)

3 討論

以DNA 為基礎(chǔ)的PCR 技術(shù)被廣泛用于食品中動(dòng)物源性成分的鑒別，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者常利用線粒體基因來(lái)開展肉類摻假的定性和定量檢測(cè)［15-18］。眾所周知，線粒體是產(chǎn)生ATP 的細(xì)胞器，在能量代謝旺盛的細(xì)胞中，線粒體的數(shù)量相對(duì)豐富［19］。然而，由于不同組織的能量代謝水平不同，其線粒體的豐度也不盡相同，這勢(shì)必影響基于線粒體DNA 的肉類摻假定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究提取了9 個(gè)鴨品種不同組織的總DNA，并測(cè)定了線粒體DNA 和核DNA 的拷貝數(shù)及其比例情況。

從檢測(cè)結(jié)果可知，不同品種鴨源性核DNA 的拷貝數(shù)穩(wěn)定性好，而線粒體DNA 拷貝數(shù)在不同組織中存在較大的差異，核DNA 是開展鴨肉摻假定量檢測(cè)的最優(yōu)選擇。在檢測(cè)的6 個(gè)組織中，鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值及其最大，這與肝臟是重要的代謝器官密切相關(guān)［20］；鴨胸肉、鴨心、鴨腿肉和鴨皮次之，這與心肌細(xì)胞參與心臟舒縮活動(dòng)和骨骼肌參與機(jī)體運(yùn)動(dòng)密不可分［21］；鴨血中拷貝數(shù)比值最低，說(shuō)明在開展基于線粒體DNA 的摻假比例定量檢測(cè)時(shí)須充分考慮摻假物的組織來(lái)源，以免影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)鴨腿肉的變異系數(shù)最小，這可能與腿部骨骼肌在鴨子日常運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮動(dòng)力作用緊密相關(guān)［22］。因此，在開展基于核DNA 的鴨肉摻假比例定量檢測(cè)時(shí)，不同品種以及組織均可進(jìn)行測(cè)定；線粒體DNA 作為靶基因的鴨肉摻假比例定量檢測(cè)時(shí)，鴨腿肉來(lái)源的肉制品是最佳選擇。本文為鴨肉制品甚至其他肉制品開展摻假定量檢測(cè)選擇合適的靶DNA 提供參考。

表2 不同品種鴨組織中線粒體和核DNA 拷貝數(shù)及拷貝數(shù)比值情況

4 結(jié)論

核DNA 的拷貝數(shù)在不同品種鴨組織中具有良好的穩(wěn)定性，是開展鴨肉制品摻假定量檢測(cè)的最適DNA 來(lái)源。在開展利用線粒體DNA 為參比的摻假定量檢測(cè)時(shí)，需充分考慮不同組織中線粒體的豐度問(wèn)題，以免影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。不同品種鴨腿肉中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值的變異系數(shù)最小。

致謝：

感謝浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供實(shí)驗(yàn)材料。