龔玲 劉代順 張龍舉

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種慢性進(jìn)展性且不可逆轉(zhuǎn)的纖維化間質(zhì)性肺炎，目前病因不明確，其表現(xiàn)特征為UIP(普通型間質(zhì)性肺炎)[1-2]。該病患病率不斷上升，最常累計(jì)60歲以上患者，該病每年以11%的比例增長(zhǎng)[2-4]。IPF診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于大多數(shù)腫瘤，因此被稱為一種“類腫瘤疾病”[5-6]。IPF相關(guān)的主要生長(zhǎng)因子包括TGF-β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、血小板衍生生長(zhǎng)因子。Kulkarni A A等[7]報(bào)道，PPAR-γ配體CDDO、15D-PGJ2及羅格列酮均有抑制肺成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，它們主要是通過抑制TGF-β誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的FAK下游的PI3K-AKT途徑。本研究旨在應(yīng)用PPAR-γ配體羅格列酮及FAK探討PPAR-γ與PI3K-AKT途徑上游的FAK通路在TGF-β誘導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞進(jìn)程中是否存在關(guān)聯(lián)性，為肺纖維化的深入研究提供新的分子機(jī)制。

資料與方法

一、細(xì)胞、藥物和試劑

第3～4代C57BL/6(美國(guó)ATCC○RCRL-6013TM)細(xì)胞，羅格列酮(德國(guó)Sigma) ，TGF-β2(美國(guó) R&D Systems)，PCR試劑盒(日本TaKaRa)，PCR引物合成 (中國(guó) 生工)，DMEM(Hyclone USA)，MTT試劑盒(中國(guó) 凱基)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

加入DMEM培養(yǎng)基的C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞放置于溫度37℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)每2～3 d換液1次，在用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞處于80%左右融合狀態(tài)。

三、藥物處理

參照文獻(xiàn)[8]，刺激C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞的TGF-β2濃度為10 ng/mL。參照文獻(xiàn)[9]羅格列酮用DMSO溶解，刺激C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞的濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L。進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、PCR實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。

四、RNA提取及PCR

C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24 h，以Trizol提取總RNA，判斷純度和濃度達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)后，取2 μL總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(cDNA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)過程參考PCR試劑盒說明書。檢測(cè)PPAR-γ mRNA、FAK mRNA光密度值。

五、MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，每孔100 μL懸液分別接種于96孔板。24 h后設(shè)置調(diào)零孔，未處理組UNT，以TGF-β2 10 ng/mL刺激C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，羅格列酮(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L)分別加入，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，再分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h。MTT實(shí)驗(yàn)時(shí)吸去孔內(nèi)上清液，MTS：培養(yǎng)基=1:5稀釋后，連續(xù)加樣，每孔50uL，避光孵育，酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)各孔在490nm吸光光度，最后記錄數(shù)據(jù)結(jié)果。

表1 PCR引物序列表

六、生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

密度相同的C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞分別接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為空白組、TGF-β2組(10 ng/mL)、TGF-β210 ng/mL +羅格列酮組(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L)，分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后以血球細(xì)胞板分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PPAR-γ配體對(duì)C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

從圖1A可以看出，隨著 PPAR-γ配體(羅格列酮)培養(yǎng)濃度增加的增加，C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，在濃度40 μmol/L抑制72 h最明顯。從圖1B可以看出，在相同濃度TGF-β2 10 ng/mL刺激下，隨著PPAR-γ配體(羅格列酮)培養(yǎng)濃度的增加，C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)也同樣受到抑制，仍在濃度40 μmol/L抑制72 h最明顯。因此，從(圖1A)和(圖1B)可以看出，PPAR-γ配體羅格列酮抑制肌纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)(見表2)。

二、PPAR-γ配體對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞C57BL/6增殖的影響

從(圖2)可以看出，小鼠肺成纖維細(xì)胞C57BL/6在相同濃度TGF-β2 10 ng/mL的刺激下，隨著A.不同劑量羅格列酮對(duì)C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響; B.TGF-β210 ng/mL+不同劑量羅格列酮對(duì)C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響PPAR-γ配體(羅格列酮)培養(yǎng)濃度的增加，細(xì)胞增殖受到抑制，在濃度40 μmol/L抑制72 h最明顯。因此，PPAR-γ配體羅格列酮抑制肌纖維母細(xì)胞增殖(見表3)。

表2 羅格列酮對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞C57BL/6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

注： Rosi不同濃度組與空白組比較：*P<0.05；TGF-β2+ Rosi不同濃度組與空白組比較：**P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 羅格列酮對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞C57BL/6增殖的影響

注： Rosi實(shí)驗(yàn)組與空白組比較：#P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 羅格列酮對(duì)C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖2 羅格列酮對(duì)C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

三、PCR檢測(cè)不同濃度 PPAR-γ配體對(duì)PPAR-γ mRNA、FAK mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

從圖3A可以看出，PPAR-γ配體(羅格列酮)使PPAR-γ mRNA轉(zhuǎn)錄增加且存在明顯濃度依賴，在羅格列酮40 μmol/L時(shí)PPAR-γ mRNA轉(zhuǎn)錄增加最明顯。從圖3B可以看出，羅格列酮使FAK mRNA轉(zhuǎn)錄減少且存在濃度依賴，在羅格列酮40 μmol/L時(shí)FAK mRNA轉(zhuǎn)錄減少最明顯(見表4)。

討 論

IPF的臨床主要表現(xiàn)為以活動(dòng)后明顯的進(jìn)行加重的呼吸困難、限制性通氣功能障礙、彌散功能降低伴低氧血癥、干咳及爆裂音。IPF的病因不清，但一些風(fēng)險(xiǎn)因素已經(jīng)確定(如吸煙、環(huán)境暴露、慢性病毒感染及家族病史、胃酸反流異常)。IPF多為散發(fā)，

表4 羅格列酮對(duì)PPAR-γ mRNA/FAK mRNA表達(dá)影響

注：結(jié)果使用表示，PPAR-γ mRNA組*P<0.05、FAK mRNA組*P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 A：PPAR-γ mRNA在不同濃度羅格列酮刺激下的轉(zhuǎn)錄水平;

B：FAK mRNA在不同濃度羅格列酮刺激下的轉(zhuǎn)錄水平

占所有間質(zhì)性肺病的20%～30%，男女比例為1.5 ∶1～2 ∶1，IPF每年的病率約為(6.8～16.3)/10萬，由于IPF病因發(fā)病機(jī)制尚不明確，影響早期診斷及治療，確診后的平均生存時(shí)間為3～5年[4,10-11]，急性加重是IPF死亡的首要原因，加重后的中位生存期僅為3～4個(gè)月，病死率55～88%[12]。IPF預(yù)后比多數(shù)腫瘤要更差，如皮膚癌、甲狀腺癌、乳腺癌等，5年生存率約20～40%，因此稱其為“不是癌癥的癌癥”，因它的發(fā)病機(jī)制不確定、進(jìn)展快、預(yù)后差，被世界衛(wèi)生組織(WTO)稱為肺系疑難疾病[1-2]。近年來，IPF發(fā)病機(jī)制的探討和治療靶點(diǎn)研究已成為研究熱點(diǎn)，加大對(duì)肺纖維化發(fā)病機(jī)制、治療方案的探討意義深遠(yuǎn)。

近年研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ配體CDDO、15D-PGJ2及羅格列酮在細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝、抑制細(xì)胞增殖、抗炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮十分重要的作用，其中，PPAR-γ合成配體羅格列酮目前研究最多[13-14]。多項(xiàng)研究表明，羅格列酮、CDDO、15D-PGJ2均能阻礙TGF-β誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[7,10,13]。FAK是一種非受體型酪氨酸激酶，它與細(xì)胞周期增殖、凋亡、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、調(diào)控等密切相關(guān)，它可以介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞與ECM粘附的作用。IPF存在成纖維細(xì)胞增殖及大量ECM聚集，F(xiàn)AK是抑制TGF-β誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)基本的要素。Kulkarni A A等[7]報(bào)道，PPAR-γ配體羅格列酮能抑制肺成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，它們主要是通過抑制TGF-β誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的FAK下游的PI3K-AKT途徑。但是，PPAR-γ與FAK上游信號(hào)通路在IPF中的關(guān)系及分子機(jī)制令人關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞C57BL/6，以TGF-β2誘導(dǎo)其向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使用不同濃度PPAR-γ配體羅格列酮作用于小鼠肺成纖維細(xì)胞C57BL/6，探討PPAR-γ與FAK信號(hào)通路在IPF中的作用，細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)羅格列酮對(duì)肌纖維母細(xì)胞的生長(zhǎng)存在抑制作用，MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)羅格列酮對(duì)肌纖維母細(xì)胞的增殖存在抑制作用，抑制肌纖維母細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖存在明顯的濃度依賴及時(shí)間依賴。PCR實(shí)驗(yàn)可以看出，PPAR-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨羅格列酮濃度增加而增加，F(xiàn)AK mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨羅格列酮濃度增加而減少。

綜上所述，PPAR-γ配體羅格列酮抑制TGF-β誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與抑制FAK表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β2誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)，該分子機(jī)制的研究對(duì)深入探討肺纖維化發(fā)生機(jī)制及治療靶點(diǎn)可能存在潛在的價(jià)值。