柯宏基，李向民，陳傅曉,3，樊佳偉，王永波,3，譚 圍,3

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海口 571126； 3.熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，海南三亞 572022)

彈涂魚(Periophthalmusmodestus)棲息于海邊灘涂處及紅樹林等區(qū)域[1]，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富[2]，不僅具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，其作為沿海灘涂特色小型魚類還具有獨(dú)特的生態(tài)研究價值 。近年來由于海域環(huán)境的惡化，彈涂魚的生存環(huán)境受到影響，資源數(shù)量下降，因此保護(hù)彈涂魚資源勢在必行。

COⅠ基因是線粒體氨基酸編碼基因，具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率適中、母系遺傳等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、物種鑒定等方面的研究[3-4]。李瑜等[5]采集廣東省珠海市淇澳島的青彈涂魚(Scartelaoshistophorus)、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)和大鰭彈涂魚(Periophthalmusmagnuspinnatus)，分析這些物種個體的核基因RAG1以及線粒體基因COⅠ的序列，得出種間遺傳距離最大的是大鰭彈涂魚與青彈涂魚，大鰭彈涂魚相比大彈涂魚和青彈涂魚遺傳多樣性最高。廖健等[6]基于COⅠ和D-loop區(qū)序列分析了雷州半島紅樹林海區(qū)2種野生彈涂魚的遺傳變異，結(jié)果表明彈涂魚種群遺傳多樣性高于大彈涂魚，目前海南島彈涂魚的相關(guān)研究較少[7]。本研究擬通過對海南島8個不同群體的彈涂魚COⅠ基因序列進(jìn)行分析，以期揭示不同群體之間的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)差異，為彈涂魚遺傳多樣性保護(hù)等工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及擴(kuò)增測序

彈涂魚群體于2018—2019年分別在?？?簡稱HK)、澄邁(簡稱CM)、臨高(簡稱LG)、儋州(簡稱DZ)、昌江(簡稱CJ)、東方(簡稱DF)、樂東(簡稱LD)、三亞(簡稱SY)野外人工捕捉。樣本活體運(yùn)輸至海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院瓊?？蒲谢兀”巢考∪饨M織于75%的乙醇中保存24 h，更換為 95%乙醇保存 24 h，最后于無水乙醇中常溫保存。采用TAKARA DNA提取試劑盒提取8個群體236尾彈涂魚的基因組 DNA，其中?？?0尾、澄邁30尾、臨高30尾、儋州30尾、昌江30尾、東方29尾、樂東30尾、三亞27尾。DNA樣品經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，保存于-20 ℃冰箱中備用。彈涂魚線粒體COⅠ基因擴(kuò)增所用引物序列如下[8]：cox F：5′-TCAACCAACCACAAAGACAATGGCAC-3′；cox R：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′，擴(kuò)增程序為：94 ℃ 預(yù)變性1 min 20 s；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，30個循環(huán)，72 ℃下延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

圖1 采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Map of sampling locations

1.2 數(shù)據(jù)分析

測序完成后，用SeqMan拼裝校對COⅠ基因序列。通過 MEGA 7.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。采用軟件DNASP 6.0計算序列變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等遺傳參數(shù)；利用MEGA 7.0軟件分析序列的堿基組成，基于Kimura 2-parameter模型計算群體內(nèi)及群體間的遺傳距離，采用鄰接法 (neighbor-joining，NJ)構(gòu)建彈涂魚單倍型鄰接關(guān)系進(jìn)化樹[9]，節(jié)點(diǎn)支持率采用 Bootstrap 1 000 次重復(fù)檢驗置信度；利用 Arlequin 3.11軟件計算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst) ，并進(jìn)行分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)，用于遺傳變異和地理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究；使用核苷酸不配對分析(mismatch distribution) 和中性檢驗(neutrality tests) 來檢測海南彈涂魚的種群歷史動態(tài)，利用 Network 5.0軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，分析單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。種群擴(kuò)張時間(T) 利用公式τ=2ut進(jìn)行估算，其中t表示種群擴(kuò)張至今所經(jīng)歷的代數(shù)，T=t×代時，代時為研究對象的生殖周期；τ為擴(kuò)張時間參數(shù);u=μk，μ為線粒體COⅠ基因變異速率;k表示序列長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

實(shí)驗共獲得236條彈涂魚COⅠ基因片段序列，序列長度為621 bp，序列組成顯示平均 A、T、G、C堿基含量分別為 31.2% 、26.3%、26.0%、16.4%，A+T(57.5%)含量高于G+C(42.4%)的含量，236個樣本檢測到59個單倍型，發(fā)現(xiàn)了54個變異位點(diǎn)(表1)，占總位點(diǎn)數(shù)的8.7%，25個單變異位點(diǎn)，29個為簡約信息位點(diǎn)。

2.2 彈涂魚遺傳多樣性

各地理群體的單倍型數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性數(shù)據(jù)結(jié)果見表1，8個群體的單倍型數(shù)在12～15種，其中以HK、CM、LG、DF 4個群體單倍型最多，有15種單倍型，單倍型數(shù)從高到低依次為 HK、CM、LG、DF群體(15種)、CJ群體(14種)、LD、SY群體(13種)、DZ群體(12種)。

單倍型多樣性指數(shù)在0.805～0.919 之間，核苷酸多樣性指數(shù)在 0.003 23～0.006 15 之間。平均核苷酸差異數(shù)為2.002～3.813，其在DF群體中最多為 3.813個，在DZ群體中最少為 2.002個?？傮w單倍型多樣性為0.861±0.019；由單倍型參數(shù)可知，DF群體的單倍型多樣性最為豐富，單倍型多樣性為0.919±0.030；LD群體單倍型多樣性最低，單倍型多樣性為0.805±0.070；8個群體的單倍型多樣性均大于0.500，屬于高水平。總體核苷酸多樣性為0.004 39±0.000 24；由核苷酸參數(shù)可知，DF群體的核苷酸多樣性最為豐富，核苷酸多樣性為0.006 15±0.000 65；DZ群體核苷酸多樣性最低，核苷酸多樣性為0.003 23±0.000 57；8個群體只有DF和CM兩個群體的核苷酸多樣性大于0.005 00，其余群體均小于0.005 00，屬于低水平。結(jié)果顯示，8個群體中DF和CM群體具有較高的遺傳多樣性，其余群體遺傳多樣性相對較低。

2.3 單倍型在群體中的分布

在236條彈涂魚COⅠ基因片段序列中共檢測到59個單倍型(表2)，其中17個為共享單倍型，其余42個為獨(dú)有單倍型。單倍型Hap1和Hap4為所有群體的共享單倍型，Hap1出現(xiàn)頻次最高，分布于80個樣本中，占總樣本數(shù)的33.9%。Hap6為7個群體共享(HK、CM、 LG、DZ、CJ、DF、LD)，Hap10為7個群體共享(HK、CM、 LG、DZ、CJ、DF、LD)，Hap3為6個群體共享(HK、CM、CJ、DF、LD、SY)，Hap19為5個群體所共享(CM、CJ、DF、LD、SY)，Hap5為4個群體所共享(HK、LG、DZ、LD)，Hap12為4個群體共享(HK、LG、DZ、SY)，Hap14為4個群體共享(HK、CM、LG、CJ)，其余共享單倍型分別為2～3個群體共享。在獨(dú)有單倍型中HK群體有6個(Hap2、Hap8、Hap9、Hap11、Hap13、Hap15)，CM群體有6個(Hap16、Hap18、Hap20、Hap21、Hap22、Hap24)，LG群體有7個(Hap25、Hap26、Hap27、Hap28、Hap29、Hap30、Hap32)，DZ群體有5個(Hap33、Hap34、Hap35、Hap37、Hap38)，CJ群體有3個(Hap39、 Hap40、Hap42)，DF群體有6個(Hap44、Hap45、Hap46、Hap48、Hap49、Hap50),LD群體有4個(Hap51、Hap52、Hap53、 Hap54),SY群體有5個(Hap55、Hap56、Hap57、Hap58、Hap59)。

2.4 遺傳分化

利用 Network5.0 軟件分析彈涂魚單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系(圖2)：單倍型沒有按不同地理群體形成獨(dú)立的分支，而是星形放射狀結(jié)構(gòu)。單倍型在各群體的分布狀況如圖2所示，共享單倍型約占所有單倍型的28.8%(17/59)， 其中 Hap1和Hap4 由8個群體共享。

8個彈涂魚群體的種內(nèi)和種間遺傳距離見表3所示。從表3中可以看出，彈涂魚群體內(nèi)的遺傳距離為0.003～0.006，群體間的遺傳距離為0.003～0.006，CM和DF以及CJ和DF群體的遺傳距離最大(0.006)，其余群體之間的遺傳距離在0.004～0.005之間。

群體間Fst分析結(jié)果顯示：兩兩群體間的Fst值在 -0.023 54～0.060 42之間(表4)，除了SY與LG、DF群體Fst大于0.05且小于0.15(SY與LG群體差異極顯著，SY與DF群體差異顯著),其余群體Fst均小于0.05?；蛄骶笥?或小于0 。

8個彈涂魚地理群體的AMOVA結(jié)果(表5)顯示，群體間的遺傳變異僅占所有遺傳變異的極少部分，絕大部分的遺傳變異(99.36%)來源于群體內(nèi)部;Fst為0.006 37,基因流為77.992 94，表明群體間基因交流頻繁，不存在明顯的遺傳分化。

2.5 彈涂魚的種群歷史動態(tài)

中性檢驗結(jié)果(表6)表明全部群體Tajima’sD值均為負(fù)值，其中LG、DZ、SY群體差異顯著；Fu’sFS值均為負(fù)值，DF群體差異顯著，其余群體差異極顯著?；贏rlequin核苷酸不配對分析圖表明，HK、DZ、CJ、SY群體為單峰狀(圖4)。DZ群體SSD (sum of square deviations)檢驗顯著，其他群體SSD和r(Harpending’s raggedness index)這兩個統(tǒng)計檢驗不顯著(表7)。

表2 彈涂魚單倍型的地理分布Tab.2 Distribution of haplotypes of 8 Periophthalmus modestus populations from the Hainan Island

圖2 彈涂魚 mtDNA COⅠ單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Haplotype network of Periophthalmus modestus based on COⅠ of mtDNA

表3 基于 COⅠ基因序列的彈涂魚群體遺傳距離Tab.3 Genetic distances within/among Periophthalmus modestus populations based on COⅠ

注: 對角線表示群體內(nèi)遺傳距離，對角線下為群體間遺傳距離。HK:海口； CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note: The diagonal stands for the genetic distance within populations and genetic distance among populations is below the diagonal. HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

表4 彈涂魚遺傳分化指數(shù)(對角線下方)和基因交流值(對角線上方) Tab.4 Matrix of pairwise Fst (below diagonal) and Nm (above diagonal) among populations of Periophthalmus modestus

注:*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。HK:?？冢?CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note:*means significant differences (P<0.05);**means extremely significant differences (P<0.01). HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

圖3 彈涂魚COⅠ單倍型鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree for COⅠ haplotypes of Periophthalmus modestus

表5 彈涂魚群體遺傳差異的AMOVA分析Tab.5 Analysis of molecular variance (AMOVA) among populations of Periophthalmus modestus

注：Va：群體間方差組分;Vb：群體內(nèi)方差組分

Note: Va:variance components among populations;Vb:variance components within populations

表6 中性檢驗Tab.6 Neutrality tests

注:*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。HK:?？?； CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note:*means significant differences (P<0.05);**means extremely significant difference (P<0.01). HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

表7 吻合度檢驗Tab.7 Goodness-of-fit test

注:*表示差異顯著(P<0.05)。HK:?？冢?CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note:*means significant differences (P<0.05). HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

3 討論

本研究中，8個彈涂魚群體的單倍型多樣性指數(shù)在0.805～0.919之間，核苷酸多樣性指數(shù)在0.003 23～0.006 15 之間，總體單倍型多樣性指數(shù)為0.861，核苷酸多樣性指數(shù)為0.004 39。單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)都是用來說明遺傳多樣性的重要指標(biāo)。這兩者的臨界值在0.5(單倍型多樣性指數(shù))和0.005(核苷酸多樣性指數(shù))，越大表明遺傳多樣性越高。根據(jù)GRANT和BOWEN[10]提出的4種模式，海南島8個彈涂魚群體分為兩個類型：一是單倍型多樣性高、核苷酸多樣性低，表明在群體瓶頸后快速增長和突變積累；二是單倍型多樣性及核苷酸多樣性都高，表明群體規(guī)模足夠大，長期進(jìn)化歷史中十分穩(wěn)定，或包含了兩個不同世系的次級結(jié)構(gòu)[11]。海南島群體總體與雷州半島群體[6]及東海群體[12]對比表明：海南島的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均低于雷州半島群體以及東海群體。目前海南島彈涂魚不是主要的經(jīng)濟(jì)食用魚種，影響其生存的主要威脅并非過度捕捉。根據(jù)走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沿海環(huán)境的惡化以及人為活動導(dǎo)致彈涂魚原有的生存環(huán)境發(fā)生改變，而棲息地的退化和消失，使得彈涂魚的分布區(qū)域不斷減少，這可能是彈涂魚種質(zhì)資源下降的主要原因，因此需要采取相應(yīng)的保護(hù)措施，防止彈涂魚資源進(jìn)一步退化。

遺傳分化系數(shù)Fst是反映群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)，較高水平的Fst表明其具有較高水平的遺傳分化，當(dāng)Fst為0～0.05時無分化，0.05～0.15為中度分化，0.15～0.25為高度分化[13]。群體間基因交流值(Nm)一般用來評估兩兩群體間的基因交流是否頻繁。兩個群體頻繁地隨機(jī)交配時，出現(xiàn)Nm< 0 或Nm>4；當(dāng)兩群體達(dá)到中等程度分化時，Nm值范圍約為 1～4；當(dāng)兩群體間基因交流較為匱乏，如隔離的產(chǎn)生使基因交流受阻嚴(yán)重時，Nm值范圍約在 0～1 之間[14]。本文群體間Fst分析結(jié)果顯示：兩兩群體間的Fst值在 -0.023 54～0.060 42之間，除了SY與LG、DF群體0.05

中性檢驗結(jié)果表明，8個群體Tajima’sD值均為負(fù)值，其中LG、DZ、SY群體P﹤0.05；Fu’sFS值均為負(fù)值，DF群體差異顯著，其余群體差異極顯著。基于Arlequin不配對分布表明HK、DZ、CJ、SY群體為單峰狀。DZ群體SSD檢驗顯著，其他群體SSD和r這兩個統(tǒng)計檢驗不顯著。由于目前缺乏關(guān)于彈涂魚性成熟年齡的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，本研究以與彈涂魚相近的大彈涂魚種類為參考[17]，大彈涂魚性成熟的年齡為1齡，線粒體COⅠ基因進(jìn)化速率參考為每百萬年 1% ～3%[18]，推算HK群體擴(kuò)張時間為8.05～2.60萬年前，LG群體擴(kuò)張時間為24.2～8.1萬年前，DZ群體擴(kuò)張時間為7.2～2.4萬年前，CJ群體擴(kuò)張時間為30.6～10.2萬年前，SY群體擴(kuò)張時間為14.5～4.8萬年前。30.6～2.4萬年前在第四紀(jì)，這期間也有其他海洋生物發(fā)生擴(kuò)張[19]，主要經(jīng)歷了中國倒數(shù)第二次冰期、末次間冰期、末次冰期。第四紀(jì)時期海面隨冰期-間冰期的交替而升降變化，寒冷時期大陸冰川發(fā)展，大量淡水結(jié)冰停留在陸地冰川中，海面下降；氣候轉(zhuǎn)暖，冰川溶解，海面升高[20]。這些氣候變化會給生物生存環(huán)境帶來各方面的影響，彈涂魚群體可能受到這些方面的影響從而發(fā)生群體擴(kuò)張。

本研究對海南島8個彈涂魚群體的分析結(jié)果表明，海南島彈涂魚整體遺傳分化程度不高，是一個隨機(jī)交配的群體。海南島部分群體經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，整體遺傳多樣性較低，應(yīng)加強(qiáng)資源保護(hù)。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，海南島彈涂魚資源分布區(qū)域基本同海南省近岸海域生態(tài)保護(hù)紅線劃定重疊，因此，嚴(yán)格遵守生態(tài)保護(hù)紅線和環(huán)境質(zhì)量底線，對今后彈涂魚等生物資源的保護(hù)將發(fā)揮重要作用。