袁喆晨，汪林芳，蘇芬芬，凌曉晶，陳時(shí)豪，曹佳澤，方 倩，樸正浩

(杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

0 引言

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界，是引起肺炎的主要病原菌[1].因綠膿桿菌具有對多種抗菌素的耐藥性，綠膿桿菌性肺炎治療較困難，病死率較高[2-3].先天免疫系統(tǒng)是控制綠膿桿菌感染的主要防御機(jī)制，但是機(jī)體不能及時(shí)清除病原菌是導(dǎo)致宿主預(yù)后不良的重要因素[3-4].

中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中抵抗細(xì)菌感染的主要防御細(xì)胞，在趨化因子的誘導(dǎo)下經(jīng)旋轉(zhuǎn)、粘附、爬行和轉(zhuǎn)移等一系列級聯(lián)反應(yīng)過程向炎癥部位募集，對侵入的病原體發(fā)揮吞噬殺傷和清除作用[5-6].所以，有效地促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集將有利于及時(shí)清除病原菌.綠膿桿菌的感染會引起中性粒細(xì)胞借助β2整合素(integrin)募集到炎癥部位[4,7].整合素是細(xì)胞的跨膜分子，主要由β2和α亞基組成，其中LFA1(αLβ2；CD11a/CD18)和Mac1(αMβ2；CD11b/CD18)為中性粒細(xì)胞的主要分子[5-6,8].中性粒細(xì)胞的Mac1通過β2整合素與內(nèi)皮細(xì)胞的表面分子相互作用，完成爬行和粘附的過程[5,9].

自噬(autophagy)是對胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過程，對穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境具有十分重要的作用[10-11].在腫瘤細(xì)胞中自噬能夠激活整合素，增加細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，并促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12-13].在中性粒細(xì)胞中，自噬可以促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒[14]、殺菌和形成細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap, NET)[15]，還可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化及中性粒細(xì)胞成熟標(biāo)志CD11b/CD18的表達(dá)[16].但自噬是否能調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的募集還不清楚.

本研究通過分離小鼠骨髓中性粒細(xì)胞進(jìn)行了體外的粘附實(shí)驗(yàn)，以了解自噬在綠膿桿菌感染時(shí)對中性粒細(xì)胞粘附的作用，進(jìn)而為探索自噬在中性粒細(xì)胞募集中的作用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

3-甲基腺苷(3-methyladenine，3-MA)(HY-19312)購于MedChem Express；胎牛血清(11012-8611)購于四季青；紅細(xì)胞裂解液(C3702)購于Beyotime Biotechnology；PecrollTM(10245267)購于Bioleaf Biotech；4%多聚甲醛固定液(E672002)購于BBI Life Sciences；BSA封閉液(C500036-0250)和30%的聚丙烯乙酰胺(B546018-0500)購于Sangon Biotech；RPMI1640(MA0215)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(MA0082)購于Meilun Biotech；β-actin(#3700)和LC3A/B(#4108)抗體購于Cell Signaling Technology；CD11b-PE(12-0112)和CD18-FITC(11-0181)流式細(xì)胞儀熒光抗體購于eBioscience；ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate(WBKLS0100)購于MILLIPORE.

1.2 小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的提取

提取C57BL/6野生型小鼠大腿骨，用注射器抽取培養(yǎng)液反復(fù)灌洗骨髓，離心后收集骨髓細(xì)胞.用紅細(xì)胞裂解液裂解其中的紅細(xì)胞，用1×PBS終止反應(yīng)，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞.細(xì)胞用0.5 mL 1×PBS 混懸，小心置于已制備好的Percoll細(xì)胞分離液中，1 000 r/min的轉(zhuǎn)速4 ℃離心30 min，并去除減速自然停止.離心結(jié)束后可見分層，取第三層細(xì)胞，用無菌的1×PBS洗滌兩次，通過FACS檢測中性粒細(xì)胞的百分比(CD11b/Gr1).

Percoll密度梯度分離液的制備：取100%的Percoll(按9∶1的比例混合Percoll原液和10×PBS)，用1×PBS稀釋成80%、65%、50%的3種Percoll液體，分別以體積4、3、3 mL依次緩慢加入一支15 mL離心管中，制作濃度梯度.

1.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

按常規(guī)方法收集各組處理后的細(xì)胞，每組細(xì)胞加100 uL RIPA細(xì)胞裂解液(加磷酸酶抑制劑和1 mmol/L PMSF)，在冰上裂解30 min后，收集裂解液在12 000 r/min條件下離心30 min，收集上清的蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度.取等量的各組蛋白質(zhì)，加1×的上樣緩沖液，于100 ℃條件下煮蛋白5 min，獲得最后的蛋白樣品.在12%的SDS-PAGE膠中每孔加入40 μg蛋白樣品，利用伯樂電泳系統(tǒng)進(jìn)行電泳，設(shè)置電壓為100 V，電泳90 min.電泳完成后，在100 V的電壓條件下轉(zhuǎn)膜60 min.膜用BSA封閉液封閉60 min，然后4 ℃孵育一抗過夜.次日，用1×TBST在搖床上洗膜(每次5 min，共3次).在室溫孵育二抗2 h后，用1×TBST緩沖液洗膜，最后用辣根過氧化物酶底物反應(yīng)后，在暗室顯影和定影.

1.4 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

提取的骨髓中性粒細(xì)胞接種在涂有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)板中，用綠膿桿菌(MOI 25)感染不同時(shí)間后，去除上清液中的未貼壁細(xì)胞，并用1×PBS洗一次培養(yǎng)板.每孔加入適量的1×PBS刮貼壁的細(xì)胞，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)為粘附細(xì)胞的數(shù)量.

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

提取骨髓中性粒細(xì)胞，用綠膿桿菌(MOI 25)感染不同時(shí)間后收集全部細(xì)胞(懸浮和貼壁的細(xì)胞)，用1×PBS清洗細(xì)胞.加入CD11b-PE和CD18-TIFC熒光抗體2 μL(抗體稀釋100倍)4 ℃避光孵育細(xì)胞15 min.再用1×PBS清洗一次細(xì)胞后，加入200 μL 4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀觀察中性粒細(xì)胞整合素CD11b和CD18的熒光強(qiáng)度.

2 結(jié)果

2.1 綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細(xì)胞的粘附，增強(qiáng)整合素CD11b/CD18的表達(dá)

提取小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，分成4組，每組細(xì)胞數(shù)量為5.1×105個.接種在涂有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)板上，再用綠膿桿菌PA14菌株(MOI 25)感染細(xì)胞10、30、60 min后，去除上清液中未貼壁的細(xì)胞，清洗一次培養(yǎng)板后刮取貼壁的細(xì)胞并計(jì)數(shù).0組為沒有感染的實(shí)驗(yàn)組，每組3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

圖1 綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細(xì)胞的粘附
Fig.1Pseudomonasaeruginosapromotes the adhesion of neutrophils

中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中抵抗細(xì)菌感染的主要防御細(xì)胞，募集到感染部位發(fā)揮抗感染的作用，而粘附是中性粒細(xì)胞募集級聯(lián)反應(yīng)過程中的一個必經(jīng)階段[5-6].在綠膿桿菌感染時(shí)中性粒細(xì)胞依賴β2整合素募集到感染部位[4].本課題組分離了小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，感染綠膿桿菌進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞的粘附細(xì)胞數(shù)量隨著感染時(shí)間的延長而增多，在30 min時(shí)粘附的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到頂峰(圖1).整合素是中性粒細(xì)胞發(fā)揮功能所需的跨膜蛋白[5-6]，綠膿桿菌感染后中性粒細(xì)胞表面整合素CD11b/CD18的表達(dá)也增加(圖2).由此確定，綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細(xì)胞的粘附和整合素CD11b/CD18的表達(dá)增強(qiáng).

A、B：提取小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，平均分成4組，每組細(xì)胞數(shù)量為5.5×105個.用綠膿桿菌(MOI 25)感染10、30、60 min，收集細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測CD11b的熒光強(qiáng)度，并制作折線圖分析趨勢.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

C、D：提取小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，平均分成4組，每組細(xì)胞數(shù)量為5.5×105個.用綠膿桿菌(MOI 25)感染10、30、60 min，收集細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測CD18的熒光強(qiáng)度，并制作折線圖分析趨勢.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

圖2 綠膿桿菌感染增強(qiáng)整合素CD11b/CD18的表達(dá)
Fig.2Pseudomonasaeruginosaenhances the expression of integrin

2.2 綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細(xì)胞自噬的發(fā)生

自噬調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的功能，參與細(xì)菌感染的炎癥反應(yīng)[4,17].在腫瘤細(xì)胞中自噬能夠激活整合素，增加細(xì)胞粘附并促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12-13].為了研究中性粒細(xì)胞的粘附機(jī)制，本研究通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀察了自噬標(biāo)記性分子LC3-I/II的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著綠膿桿菌感染時(shí)間的增加，LC3-II蛋白的表達(dá)增加(圖3A).3-MA是自噬的抑制劑[18]，用3-MA預(yù)先處理骨髓中性粒細(xì)胞后感染綠膿桿菌發(fā)現(xiàn)，LC3-II的表達(dá)明顯被抑制(圖3B).可見，綠膿桿菌感染可引起中性粒細(xì)胞的自噬.

A：提取野生型小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞，平均分成4組，每孔細(xì)胞數(shù)量為2.6×106個.用綠膿桿菌(MOI 25)感染10、30、60、120 min后獲取蛋白，每孔蛋白量為40 μg左右.進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，觀察LC3-I/II和Actin.

B：從小鼠的骨髓中分離骨髓中性粒細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)量為2.1×106個，3-MA抑制劑組預(yù)先處理1 h(濃度分別為10、50、100、200 μmol/l).清洗細(xì)胞后用綠膿桿菌(MOI 25)感染細(xì)胞60 min.獲取蛋白，每孔蛋白量為40 μg左右，并進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀察LC3-I/II的表達(dá).

圖3 綠膿桿菌感染激活骨髓中性粒細(xì)胞中自噬的發(fā)生
Fig.3Pseudomonasaeruginosainduces autophagy in neutrophils from bone marrow

2.3 自噬調(diào)節(jié)綠膿桿菌感染時(shí)骨髓中性粒細(xì)胞的粘附和整合素的表達(dá)

提取小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)量為2.9×106個.預(yù)先用3-MA(200 μmol/L)或DMSO處理后清洗一次細(xì)胞，接種在涂有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)板上，再用綠膿桿菌(MOI 25)感染不同時(shí)間，觀察粘附細(xì)胞的數(shù)量.0組為沒有感染的組.

圖4 自噬調(diào)節(jié)綠膿桿菌感染時(shí)骨髓中性粒細(xì)胞的粘附
Fig.4 Autophagy regulates the adhesion of neutrophils duringPseudomonasaeruginosainfection

為了確定自噬對中性粒細(xì)胞粘附的作用，用3-MA抑制劑預(yù)先處理骨髓中性粒細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬的抑制劑顯著地抑制中性粒細(xì)胞的粘附(圖4).CD11b是中性粒細(xì)胞執(zhí)行功能的重要分子，在缺乏自噬的細(xì)胞中的表達(dá)顯著地降低[16].本研究發(fā)現(xiàn)自噬的抑制劑3-MA抑制整合素CD11b的表達(dá)(圖5A、B)，但是CD18的表達(dá)幾乎沒有被抑制(圖5C、D).因此，可以確定自噬在骨髓中性粒細(xì)胞的粘附和整合素的表達(dá)中起重要作用.

3 討論

綠膿桿菌廣泛分布于自然界，常在醫(yī)院內(nèi)引起感染，而且具有對多種藥物的耐藥性，所以治療困難[1,19].綠膿桿菌感染引起中性粒細(xì)胞的募集[7]，從骨髓經(jīng)旋轉(zhuǎn)、粘附、爬行和轉(zhuǎn)移一系列過程募集到炎癥部位[5-6].已有文獻(xiàn)報(bào)道，在綠膿桿菌感染時(shí)中性粒細(xì)胞借助β2整合素募集到感染部位[4]，整合素是中性粒細(xì)胞執(zhí)行功能的重要跨膜蛋白[5-6,8].本研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌感染引起小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的粘附，同時(shí)增強(qiáng)整合素CD11b和CD18的表達(dá).

A、B：提取小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)量為7.2×105個.3-MA(200 μmol/L)或DMSO預(yù)處理后清洗一次細(xì)胞，感染綠膿桿菌(MOI 25).收集各組細(xì)胞后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b的熒光強(qiáng)度，并制作折線圖觀察變化趨勢.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

C、D：提取小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)量為7.2×105個.3-MA(200 μmol/L)或DMSO預(yù)處理后清洗一次細(xì)胞，感染綠膿桿菌(MOI 25).收集各組細(xì)胞后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD18的熒光強(qiáng)度，并制作折線圖觀察變化趨勢.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

圖5 自噬調(diào)節(jié)綠膿桿菌感染時(shí)整合素的表達(dá)
Fig.5 Autophagy regulates the expression of integrin duringPseudomonasaeruginosainfection

自噬在腫瘤細(xì)胞中激活整合素，并促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12-13].在中性粒細(xì)胞中自噬可以促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒、分化、殺菌等作用[14-16]，但對中性粒細(xì)胞募集的影響還沒有文獻(xiàn)報(bào)道.已有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞成熟標(biāo)志CD11b/CD18的表達(dá)[16].CD11b/CD18是中性粒細(xì)胞遷移和激活必不可少的重要分子[5,20].本研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細(xì)胞的自噬，而且自噬的抑制劑3-MA顯著地抑制細(xì)胞CD11b的表達(dá)和中性粒細(xì)胞的粘附.

綜上所述，綠膿桿菌感染可以激活骨髓中性粒細(xì)胞的自噬，而且自噬的抑制劑抑制細(xì)胞中整合素CD11b的表達(dá)和粘附.本研究確定自噬參與中性粒細(xì)胞的粘附，但是否促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集尚不清楚，需進(jìn)一步研究.