劉國(guó)民

摘? 要：本文旨在進(jìn)一步探討豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV-2）的垂直傳播以及母豬接種PCV-2滅活疫苗對(duì)新生仔豬抵抗PCV-2感染的作用。試驗(yàn)以從兩家豬場(chǎng)中隨機(jī)選擇的繁殖母豬及其所產(chǎn)仔豬為研究對(duì)象，將所選母豬隨機(jī)分入未接種疫苗的對(duì)照組和接種疫苗的試驗(yàn)組。母豬斷奶后接種商用PCV-2滅活疫苗，18 d后對(duì)兩家豬場(chǎng)各一半的試驗(yàn)?zāi)肛i接種疫苗。母豬分娩時(shí)，研究人員從兩家豬場(chǎng)分別采集70頭母豬的初乳，并在哺乳前（豬場(chǎng)1）或哺乳后（豬場(chǎng)2）從每窩中隨機(jī)選擇5頭仔豬采集血液樣本。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)98.5%的初乳樣本含PCV-2抗體（135/137），且PCV-2抗體在免疫母豬的初乳中的分布率顯著更廣（P=0.003 9）。在仔豬中，43.9%的仔豬血清（301/685）呈PCV-2陽(yáng)性，11.7%（80/686）呈PCV-2 DNA陽(yáng)性。對(duì)所有PCV-2 DNA陽(yáng)性樣本進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，28份樣本中的PCV-2為PCV-2a型，28份樣本中的為PCV-2b型，5份樣本中的PCV-2既有PCV-2a型又有PCV-2b型。PCV-2 DNA在仔豬群的流行性（0.7%～22.8%）低于早先的研究結(jié)果（44.8%～90%），說(shuō)明很可能是由于母豬廣泛接種疫苗引起了PCV-2的生態(tài)學(xué)特性改變。在本研究的條件下，母豬接種PCV-2滅活疫苗可以降低所產(chǎn)仔豬因攝入初乳而引發(fā)的PCV-2病毒血癥的發(fā)病率。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型;病毒血癥;疫苗

中圖分類號(hào)：S851.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2020）04-0020-06

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV-2）是一種無(wú)包膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，與PCV-1同屬于環(huán)病毒科，對(duì)全球豬群有很高的致病性。PCV-2分為多個(gè)基因型，其中PCV-2b是豬群感染的PCV-2中的主要基因型。

PCV-2會(huì)導(dǎo)致豬群發(fā)生一系列臨床疾病，人們稱之為PCV相關(guān)病（PCV-associated Diseases，PCVAD）。在臨床上，PCVAD可能表現(xiàn)為仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、呼吸道疾病、腸道疾病和母豬繁殖障礙，少數(shù)病豬還會(huì)發(fā)生豬皮炎腎病綜合征。PCV-2無(wú)處不在的特性歸功于它的傳播途徑多樣化，如它可通過(guò)口鼻、糞便、精液、胎盤以及初乳等途徑傳播。給生長(zhǎng)豬接種PCV-2疫苗可以有效降低PCVAD的發(fā)病率和嚴(yán)重程度。

近來(lái)，人們將精力放在通過(guò)對(duì)繁殖母豬接種PCV-2疫苗來(lái)預(yù)防生長(zhǎng)豬發(fā)生PCV-2上。業(yè)已證明，母豬感染PCV-2后可以產(chǎn)生病毒血癥，并且會(huì)感染子宮中的胎兒。有趣的是，在發(fā)生病毒血癥期間，母豬仍能產(chǎn)下大量的仔豬，且所產(chǎn)仔豬似乎很健康。最近，美國(guó)的科研人員對(duì)5個(gè)商用繁殖母豬群進(jìn)行了一項(xiàng)田間調(diào)查，以研究PCV-2的垂直傳播情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV-2 DNA在母豬群中的總體流行率為69.5%（89/128），在仔豬群中的流行率為44.8%（226/504）。另一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)三家豬場(chǎng)的新生仔豬發(fā)生PCV-2病毒血癥的比例介于58%～90%。

本研究旨在確定先前母豬群和仔豬群暴發(fā)的高比例PCV-2病毒血癥是否也在2011年美國(guó)艾奧瓦州的繁殖豬場(chǎng)中發(fā)生，以及探討母豬接種PCV-2滅活疫苗是否會(huì)影響PCV-2的垂直傳播。

1? 材料與方法

1.1 豬場(chǎng)

豬場(chǎng)1是一家多點(diǎn)式從繁殖到斷奶的豬場(chǎng)，有將近2 400頭繁殖母豬。母豬采用人工授精的方式配種，精液由美國(guó)艾奧瓦州的一家種豬場(chǎng)提供。豬場(chǎng)2是一家獨(dú)立的繁殖場(chǎng)，有將近2 700頭繁殖母豬，母豬采用與豬場(chǎng)1相同的配種方式。兩家豬場(chǎng)的所有母豬都在分娩前接種大腸桿菌（Escherichia Coli）疫苗。所有繁殖母豬在斷奶時(shí)按照常規(guī)免疫方案接種可預(yù)防豬細(xì)小病毒病、細(xì)螺旋體病和豬丹毒的疫苗，豬場(chǎng)2的母豬還接種豬流感疫苗。盡管經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)兩家豬場(chǎng)的繁殖母豬為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）陽(yáng)性，但我們?nèi)哉J(rèn)為這些母豬群在PRRSV的流行上處于穩(wěn)定狀態(tài)，它們能夠生產(chǎn)出PRRSV-RNA陰性的仔豬。引進(jìn)的母豬或者豬場(chǎng)一直飼養(yǎng)的母豬未接種PCV-2滅活疫苗。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、疫苗接種方案、樣本選擇方式和母豬的繁殖參數(shù)

每家豬場(chǎng)選擇約100頭同步發(fā)情的母豬，按胎次（1胎～10胎）隨機(jī)平均分入需接種疫苗的試驗(yàn)組（組內(nèi)的母豬簡(jiǎn)稱“免疫母豬”，50頭）和不需接種疫苗的對(duì)照組（組內(nèi)的母豬簡(jiǎn)稱“未免疫母豬”，50頭）。每組的初乳樣本只從35頭母豬上采集，其余15頭為備用母豬，以確保在研究小組到達(dá)豬場(chǎng)時(shí)所選母豬中有35頭同時(shí)分娩，從而可以防止因母豬懷孕失敗或預(yù)產(chǎn)期不正確或分娩時(shí)未助產(chǎn)而出現(xiàn)分娩母豬數(shù)量不足的情況。一旦35窩仔豬的樣本采集到位，采樣工作立即停止，其余母豬不再采樣和收集數(shù)據(jù)。

母豬斷奶時(shí)，在試驗(yàn)組母豬頸部右側(cè)肌肉接種2 mL Suvaxyn PCV疫苗（美國(guó)富道動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)）;18 d后于相同部位進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，劑量為1 mL。所有母豬都于斷奶后第一次發(fā)情時(shí)進(jìn)行人工授精。

在母豬分娩時(shí)，從每組中隨機(jī)選擇35頭母豬，收集它們的初乳樣本，再?gòu)拿扛C仔豬中隨機(jī)選擇5頭臨床健康的仔豬采集血液樣本。根據(jù)仔豬血清中IgG的總光學(xué)密度（Optical Density，OD）的評(píng)估值，我們可以斷定豬場(chǎng)1和豬場(chǎng)2的仔豬血液樣本分別是在仔豬吮吸初乳之后和之前采集。

豬場(chǎng)1的試驗(yàn)仔豬由場(chǎng)內(nèi)工人選擇，再負(fù)責(zé)將它們帶入不同的房間交給研究小組的成員采集血液樣本。血液樣本通過(guò)仔豬的臍帶或頸靜脈采集。為了避免仔豬之間發(fā)生交叉污染，同時(shí)避免在采集血液樣本和初乳樣本的過(guò)程中樣本受到環(huán)境的污染，每采集一頭仔豬的樣本后更換一副手套，軟管的打開(kāi)、關(guān)閉和儲(chǔ)存由未捕捉過(guò)仔豬的工作人員執(zhí)行。豬場(chǎng)2的試驗(yàn)仔豬的選擇和血液樣本采集由研究小組的成員進(jìn)行。最終的樣本數(shù)見(jiàn)表1。所有的樣本都用血清學(xué)方法檢測(cè)是否含有PCV-2 IgG，并用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)是否存在PCV-2 DNA及確定其數(shù)量和亞型。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)

所有血液樣本和初乳樣本都用之前介紹的基于ORF-2的ELISA檢測(cè)PCV-2抗體。一個(gè)樣本的樣本轉(zhuǎn)陽(yáng)性（Sample-to-Positive，S/P）值不低于0.2即判定為陽(yáng)性。豬場(chǎng)1的樣本還用SERELISA PCV-2 ab Mono Blocking ELISA試劑盒檢測(cè)。

所有的仔豬血液樣本還用豬體內(nèi)總IgG ELISA進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用溶于PBS的0.5 ?g/mL羊抗豬IgG （Fc）抗體包被微量滴定板，并在室溫下孵育過(guò)夜。在用含有0.05%吐溫20的PBS洗板3次后，用1%的牛血清蛋白在室溫下封閉2 h。該血清樣本用添加了牛血清蛋白的PBS按1∶100稀釋，滴在平板上后再在37 ℃下孵育45 h。洗板后，將按1∶40 000稀釋的過(guò)氧化物酶共軛山羊抗豬IgG加入孔中，37 ℃下孵育30 min。再次洗板后，將四甲聯(lián)苯胺氫過(guò)氧化顯色底物加入每個(gè)孔中，在室溫下放置15 min后，再在每個(gè)孔中加入50 μL的0.25 M硫酸終止反應(yīng)，隨后用分光光度計(jì)測(cè)定450 nm處的吸光度值。已哺乳的或哺乳前的仔豬血清作為分析對(duì)照。比較兩家豬場(chǎng)的仔豬血清的平均OD值。

1.4 PCV-2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中，用針對(duì)PCV-2 ORF1的引物和探針檢測(cè)PCV-2 DNA。在25 μL反應(yīng)體系中加入2.5 μL的DNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s（40個(gè)循環(huán)），60 ℃ 1 min（40個(gè)循環(huán)）。樣本的循環(huán)閾值（Cycle Threshold，CT）大于40判定為陰性。

1.5 PCV-2a/b多重PCR

利用可定向分析PCV-2 ORF2中模式序列的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)PCV-2a和PCV-2b。25 μL反應(yīng)體系包括：12.5 μL的混合液（master mix），0.5 μL DNA，引物各0.4 μM，探針各0.2 μM。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s（40個(gè)循環(huán)），60 ℃ 1 min? （40個(gè)循環(huán)）。樣本的CT值大于40判定為陰性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用JMP V.9.0.0軟件和SAS V.9.2軟件分析，P值小于0.05即認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。ELISA的S/P比值用“豬場(chǎng)”、“胎次”和“豬場(chǎng)與母豬接種狀態(tài)的互作”建立的線性混合模型分析。接種狀態(tài)與按胎次和豬場(chǎng)分級(jí)的PCV-2流行率之間的聯(lián)系用CMH檢驗(yàn)評(píng)估，各豬場(chǎng)的血清學(xué)結(jié)果用配對(duì)t檢驗(yàn)分析。兩組間的發(fā)病率差異通過(guò)費(fèi)歇爾確切檢驗(yàn)（Fisher's exact test）計(jì)算。

2? 結(jié)果

2.1 窩生產(chǎn)性能

在豬場(chǎng)1所選的仔豬窩中，平均窩產(chǎn)活仔數(shù)（用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，下同）為“12.2頭±0.3頭”，窩平均死胎數(shù)為“1.2胎±0.2胎”，窩平均木乃伊胎數(shù)為“0.4胎±0.2胎”。豬場(chǎng)2的平均窩產(chǎn)活仔數(shù)為“11.8頭±0.4頭”，窩平均死胎數(shù)為“0.8胎±0.2胎”，窩平均木乃伊胎數(shù)為“0.2胎±0.1胎”。試驗(yàn)組和對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異（表2）。

2.2 血清中的總lgG水平

豬場(chǎng)1的仔豬血清IgG的OD值與從哺乳后的仔豬上采集的樣本測(cè)得的結(jié)果相接近，而豬場(chǎng)2的仔豬血清IgG的OD值與從哺乳前的仔豬上采集的樣本測(cè)得的結(jié)果相接近。豬場(chǎng)1仔豬血清的IgG的OD值顯著高于豬場(chǎng)2仔豬的（P<0.000 1）。

2.3 抗PCV-2 lgG抗體的流行率與ELISA S/P平均值

所有免疫母豬和97%的未免疫母豬分泌的初乳都檢測(cè)到了PCV-2 IgG抗體，免疫母豬的平均S/P值顯著高于未免疫母豬的（P=0.003 9）。PCV抗體陽(yáng)性的母豬在發(fā)病率上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。各豬場(chǎng)免疫母豬和未免疫母豬的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)兩家豬場(chǎng)的免疫母豬和未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血液樣本檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，PCV-2 IgG抗體陽(yáng)性的樣本比例分別為44.5%和43.4%。豬場(chǎng)1的免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血液IgG抗體水平顯著高于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的。豬場(chǎng)1血清陽(yáng)性的仔豬比例高達(dá)88.1%，豬場(chǎng)2的這一比例僅為1.1%。豬場(chǎng)1免疫母豬所產(chǎn)仔豬的PCV-2 IgG抗體水平顯著高于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的。

2.4 PCV-2 DNA檢測(cè)率

表3列出了按接種方式和豬場(chǎng)匯總的母豬初乳中PCV-2 DNA的檢測(cè)結(jié)果：豬場(chǎng)1未免疫母豬初乳樣本的PCV-2 DNA檢測(cè)率為5.9%，未從豬場(chǎng)1免疫母豬的初乳樣本以及豬場(chǎng)2未免疫母豬的初乳中檢測(cè)到PCV-2 DNA。

綜合豬場(chǎng)1和豬場(chǎng)2的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14.9%的未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血清樣本和8.4%的免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血清樣本含有PCV-2 DNA，未免疫母豬所產(chǎn)仔豬血清樣本的PCV-2 DNA檢測(cè)率顯著高于免疫母豬所產(chǎn)仔豬的。在PCV-2陽(yáng)性樣本中，28個(gè)樣本只檢測(cè)到了PCV-2a，28個(gè)樣本只檢測(cè)到了PCV-2b，5個(gè)樣本同時(shí)檢測(cè)到了PCV-2a和PCV-2b，另外19個(gè)樣本未能確定所檢測(cè)到的PCV-2的血清亞型。在豬場(chǎng)1，免疫母豬所產(chǎn)仔豬血清樣本的PCV-2 DNA檢測(cè)率顯著低于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的? ? （P<0.001）（表3）。

表4列出了不同豬場(chǎng)母豬所產(chǎn)窩中PCV-2 DNA陽(yáng)性仔豬的分布情況。在未免疫母豬所產(chǎn)窩中，至少有1～3頭仔豬呈PCV-2 DNA陽(yáng)性的窩數(shù)顯著高于免疫母豬所產(chǎn)窩的（P=0.036）。在單家豬場(chǎng)中，如豬場(chǎng)1，如果仔豬由免疫母豬生產(chǎn)，無(wú)PCV-2 DNA陽(yáng)性仔豬的窩比例極高（P<0.01）;相反，如果仔豬由免疫母豬生產(chǎn)，有2～3頭仔豬為PCV-2 DNA陽(yáng)性的窩所占比例較低（P<0.05）。

3? 討論

本研究中，兩家豬場(chǎng)的新生仔豬血清樣本的PCV-2抗體陽(yáng)性率為43.9%。在感染PCV-2后，大多數(shù)母豬會(huì)在妊娠第70天后出現(xiàn)高水平的PCV-2垂直傳播率。Lai等和Vandeputte等證明，新生仔豬從初乳獲得的抗體可在攝入初乳后2 h內(nèi)檢測(cè)到，并且抗體水平可在攝入初乳后9 h～24 h達(dá)到峰值。在豬場(chǎng)1，母豬接種PCV-2滅活疫苗會(huì)顯著影響所產(chǎn)仔豬的PCV-2 IgG的S/P值。

PCV-2 DNA陽(yáng)性仔豬的分布率為11.7%。豬場(chǎng)1的仔豬血清樣本在哺乳后采集，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)免疫母豬所產(chǎn)仔豬的病毒血癥發(fā)病率顯著低于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的，窩中仔豬的PCV-2 DNA陽(yáng)性發(fā)生率也呈現(xiàn)出類似的情況。有趣的是本研究檢測(cè)到的PCV-2a陽(yáng)性血清樣本數(shù)和PCV-2b陽(yáng)性血清樣本數(shù)相接近，這與Shen等對(duì)499個(gè)來(lái)自哺乳前仔豬的血清樣本檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)較多樣本呈PCV-2b陽(yáng)性的結(jié)果相悖，可能是由于本研究對(duì)一部分母豬接種PCV-2滅活疫苗會(huì)干擾PCV-2亞型特異性病毒復(fù)制。業(yè)已證明母豬在妊娠早期和中期感染PCV-2后會(huì)導(dǎo)致個(gè)別母豬發(fā)生繁殖障礙。但是，PCV-2在繁殖母豬群中的流行對(duì)仔豬和生長(zhǎng)豬的影響可能大于對(duì)母豬的影響。Opriessnig等指出，當(dāng)PCV-2的亞臨床感染仔豬與敏感仔豬和生長(zhǎng)豬混群時(shí)，PCVAD高發(fā)病率通常出現(xiàn)在仔豬的母源抗體開(kāi)始衰退后。

盡管豬場(chǎng)給生長(zhǎng)豬接種PCV-2疫苗目前已經(jīng)很普遍，并且?guī)?lái)PCVAD的發(fā)病率下降，但是眾多跡象表明接種PCV-2疫苗并不能完全有效地預(yù)防豬感染PCV-2。Ci-Ozuna等在多篇研究論文中報(bào)道了發(fā)生在美國(guó)堪薩斯和內(nèi)布拉斯加州的與PCV-2相關(guān)的嚴(yán)重急性肺炎和肺水腫病例。2009年末，出現(xiàn)在加拿大的PCV-2重組病毒還引起了人們對(duì)PCV-2疫苗安全性的擔(dān)憂。業(yè)已證明給母豬接種PCV-2疫苗無(wú)法徹底預(yù)防PCV-2通過(guò)精液或?qū)嶒?yàn)性攻毒引起的母豬子宮內(nèi)感染，本研究的結(jié)果證實(shí)了先前的發(fā)現(xiàn)，即母豬接種PCV-2滅活疫苗后很可能會(huì)通過(guò)防止子宮內(nèi)感染從而減少患病毒血癥的仔豬的數(shù)量，或通過(guò)初乳降低出生不久感染PCV-2的仔豬的數(shù)量。

在實(shí)驗(yàn)條件下，給母豬接種商用PCV-2滅活疫苗可以提高其所分泌的初乳中抗PCV-2的IgG水平。同時(shí)，母豬接種PCV-2滅活疫苗可以顯著減少出現(xiàn)病毒血癥的仔豬數(shù)，并可降低有PCV-2病毒血癥仔豬的窩發(fā)生率。

原題名：Vaccination of sows reduces the prevalence of PCV-2 viraemia in their piglets under field conditions（英文）

原作者：K. C. ONeill、M. Hemann、L. G. Giménez-Lirola、 P. G. Halbur和T. Opriessnig