“化濁解毒方”對(duì)二惡英暴露2型糖尿病大鼠脂代謝及胰島素抵抗的影響

郭勝男 劉弘毅 吳深濤

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300380；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南昆明650000）

目前，全球2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM） 的患病人數(shù)呈爆炸性增長(zhǎng)，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島素分泌受損是T2DM發(fā)生、發(fā)展的兩大病理生理基礎(chǔ)，傳統(tǒng)觀(guān)念認(rèn)為不良的生活方式（如久坐少動(dòng)）和不健康的飲食習(xí)慣（如高脂飲食）是導(dǎo)致肥胖、IR和T2DM的主要原因，但這些常規(guī)危險(xiǎn)因素已不能解釋全球范圍內(nèi)與IR相關(guān)的代謝性疾病的飛速增長(zhǎng)，然而卻與近50年工業(yè)發(fā)展呈一致趨勢(shì)。隨著全球工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染日益加劇，持續(xù)性有機(jī)污染物（persistent organic pollutants，POPs）是環(huán)境污染物中最具代表性的有毒化學(xué)物質(zhì)[1]，這類(lèi)化合物具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、難降解、親脂性、疏水性、遠(yuǎn)距離傳輸、高蓄積性等特點(diǎn)，并且能夠通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)并產(chǎn)生生物放大效應(yīng)[2]，最終蓄積在人體（血液、脂肪、母乳等）中，并且很難從人體代謝或排泄出去，對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生潛在的負(fù)面影響[3]。有證據(jù)表明，POPs暴露會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生[4]。

早期研究發(fā)現(xiàn)，脂毒性與脂代謝異常既是胰島素抵抗的結(jié)果，又是胰島素抵抗的重要致病因素[5]。我們前期研究表明，化裁自升降散的化濁解毒方在改善SD大鼠糖、脂毒性相關(guān)IR方面有顯著的療效[6-7]。本研究選取POPs中典型的有機(jī)污染物——二惡英，建立2型糖尿病大鼠（ZDF大鼠）染毒模型，觀(guān)察化濁解毒方對(duì)二惡英暴露的ZDF大鼠糖脂代謝及IR的影響，揭示化濁解毒方如何解“環(huán)境污染之毒”，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 SPF級(jí)雄性ZDF（fa/fa）大鼠，6周齡，體重180～200 g；SPF級(jí)雄性ZDF（fa/+）大鼠，6周齡，體重140～160 g。大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。PMI Labdiet5008飼料：成分為粗蛋白24%、粗脂肪7.1%、粗纖維3.2%、無(wú)氮浸出物48.9%、礦物質(zhì)（有機(jī)物）6.7%、維生素3.2%，購(gòu)自雍立（上海）生物科技有限公司。大鼠飼養(yǎng)于屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（配備獨(dú)立通氣飼養(yǎng)籠），控制溫度20～25 ℃，濕度（55±10）%，12 h明暗交替照明（光照時(shí)間7∶00—19∶00）。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由攝食進(jìn)水，每日更換墊料，保持籠內(nèi)干燥、清潔。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 二惡英混標(biāo)（成分：2,3,7,8-Tetrach lorodibenzo-p-dioxin，1,2,3,7,8-Pentachlorodibenzop-dioxi，1,2,3,4,7,8-Hexachlorodibenzo-p-dioxin，1,2,3,4,6,7,8-Heptachlorodibenzo-p-dioxin，Octachlorodibenzo-p-dioxin），購(gòu)自美國(guó)AccuStandard公司；化濁解毒方顆粒（組成：黃連、大黃、姜黃、蟬蛻、僵蠶、枳實(shí)、清半夏、白芍、柴胡、黃芩、干姜、佩蘭），由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥廠(chǎng)制備，批號(hào)：津藥制字（臨）Z20130944。

1.3 試劑與儀器 碘[125I]胰島素放射免疫試劑盒，購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；游離脂肪酸測(cè)定試劑盒（比色法），購(gòu)自南京建成生物工程研究所。羅氏血糖儀（型號(hào)：ACCU-CHEK），購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；血糖試紙（型號(hào)：ACCU-CHEK），購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司，批號(hào)477493；SN697雙探頭全自動(dòng)放免γ計(jì)數(shù)器，購(gòu)自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；全自動(dòng)生化分析儀（規(guī)格型號(hào)：7020型ISE），購(gòu)自日本日立公司；電子天平（型號(hào)：KFS-3000），購(gòu)自浙江凱豐集團(tuán)公司；低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（型號(hào)：TDZ5-WS），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；分光光度計(jì)（型號(hào)：723S），購(gòu)自上海棱光技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與染毒、藥物干預(yù) 選取6周齡雄性ZDF（fa/fa）大鼠為模型鼠，以普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組與二惡英染毒組，另取6周齡雄性ZDF（fa/+）大鼠為正常組。實(shí)驗(yàn)全程正常組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組、二惡英染毒組予ZDF專(zhuān)用飼料PMI Labdiet5008喂養(yǎng)。二惡英用玉米油溶解，以50 ng/kg灌胃二惡英染毒組大鼠染毒，模型組和正常組以等體積玉米油灌胃，每日灌胃1次，共8周。隨后將二惡英染毒組大鼠隨機(jī)分為染毒組與化濁解毒方組。依據(jù)《中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)》中的公式以及我們前期研究，化濁解毒方高劑量（6.0 g·kg-1·d-1）在降糖降脂及改善胰島素抵抗等方面明顯優(yōu)于低劑量（1.5 g·kg-1·d-1）及中劑量（3.0 g·kg-1·d-1）[8-9]，因此本研究化濁解毒方組按生藥6.0 g·kg-1·d-1灌胃給藥，其他各組以等體積生理鹽水灌胃，共4周。最終各組選擇6只大鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT） 治療后對(duì)各組大鼠進(jìn)行OGTT。大鼠禁食不禁水12 h，于上午7時(shí)對(duì)各組大鼠依次剪尾，使用血糖儀檢測(cè)空腹血糖（FBG），隨后用50%葡萄糖以2 g/kg的劑量灌胃，在灌胃后30 min、60 min、90 min、120 min時(shí)再次剪尾檢測(cè)血糖濃度。

2.3 空腹血清胰島素（FINS）及血脂指標(biāo)檢測(cè) 藥物干預(yù)結(jié)束后各組大鼠目?jī)?nèi)眥取血，將收集到的血漿樣本置于離心機(jī)中，離心半徑157 mm，3 000 r/min離心10 min，收集血清，檢測(cè)空腹血清胰島素（FINS）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）及游離脂肪酸（FFA）。

2.4 計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)、胰島素敏感指數(shù) 參照李光偉教授[10]發(fā)表的相關(guān)胰島素抵抗計(jì)算公式，進(jìn)行計(jì)算。胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IRI）=FBG×FINS/22.5，胰島素敏感指數(shù)（HOMA-ISI）=Ln[1/（FBG×FINS）]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用（x-±s）表示，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），2組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠治療后OGTT結(jié)果比較 見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠治療后空腹血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)及胰島素敏感指數(shù)比較 見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠治療后血脂水平比較 見(jiàn)表3。

4 討論

各國(guó)許多大規(guī)模流行病學(xué)研究已經(jīng)確定了POPs與胰島素抵抗以及T2DM之間密切相關(guān)，尤其是近10年來(lái)，全球至少有20個(gè)橫斷面研究和近10個(gè)縱向研究證實(shí)了這一觀(guān)點(diǎn)。POPs不僅造成環(huán)境污染，而且90%可通過(guò)飲食攝入危害人體健康。研究發(fā)現(xiàn)，胎兒在子宮內(nèi)暴露POPs極大增加成年后罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[11]。雖然POPs自20世紀(jì)70年代已被禁止或限制使用，但其高穩(wěn)定性、高親脂性及高生物蓄積性，其危害仍然持續(xù)存在。我國(guó)長(zhǎng)三角、珠三角當(dāng)?shù)丨h(huán)境中POPs含量顯著高于美國(guó)等其他國(guó)家風(fēng)險(xiǎn)閾值[12-15]，河北省POPs人體負(fù)荷水平6年間上升了25%[16]。因此，研究開(kāi)發(fā)新的藥物以防治POPs對(duì)人體的持續(xù)危害是目前亟須解決的問(wèn)題。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明，二惡英暴露會(huì)導(dǎo)致ZDF大鼠胰島素抵抗，且能夠使TC、TG與FFA的水平升高。POPs導(dǎo)致IR具體的分子機(jī)制尚未闡明，有研究發(fā)現(xiàn)低劑量二惡英暴露引起線(xiàn)粒體出現(xiàn)去極化現(xiàn)象，胰島細(xì)胞對(duì)血糖刺激的敏感性顯著降低，隨著二惡英劑量加大，線(xiàn)粒體嵴出現(xiàn)腫脹，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性[17]。

游離脂肪酸及甘油三酯是造成脂毒性的核心物質(zhì)，脂毒性會(huì)促進(jìn)炎癥和IR，IR反過(guò)來(lái)會(huì)加重脂毒性。IR是造成機(jī)體代謝紊亂的關(guān)鍵因素，造成高血糖和脂代謝紊亂，是引發(fā)脂毒性及多種并發(fā)癥的重要因素。因此二惡英可能是通過(guò)脂毒性導(dǎo)致胰島素抵抗。胰島素抵抗可以由各種情況引起，包括異常的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、脂毒性、炎癥、線(xiàn)粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激等[18]。二惡英是否通過(guò)其他途徑導(dǎo)致胰島素抵抗，還有待進(jìn)一步研究。

葡萄糖耐量試驗(yàn)是目前診斷糖代謝異常的標(biāo)準(zhǔn)方法，其結(jié)果可以反映胰島β細(xì)胞分泌功能以及機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力。本研究結(jié)果表明，化濁解毒方對(duì)染毒大鼠葡萄糖耐量具有改善作用。

表1 各組大鼠治療后口服糖耐量試驗(yàn)結(jié)果比較（x-±s） 單位：mmol/L

表2 治療后各組大鼠空腹血清胰島素水平和胰島素抵抗、胰島素敏感指數(shù)比較（x-±s）

表3 治療后各組大鼠血脂水平比較（x-±s）

胰島素作為機(jī)體內(nèi)唯一具有降低血糖作用的激素，對(duì)維持體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)有極其重要的作用。IR導(dǎo)致胰島素對(duì)其靶器官的生物效應(yīng)降低，致染毒大鼠胰島β細(xì)胞代償分泌胰島素，并出現(xiàn)高胰島素血癥。本研究結(jié)果表明，化濁解毒方能有效降低二惡英染毒大鼠空腹胰島素水平，改善大鼠高胰島素血癥，其機(jī)制與其對(duì)染毒大鼠胰島素抵抗的改善作用有關(guān)。

化濁解毒方以清代醫(yī)家楊栗山之古方升降散化裁，全方“取僵蠶、蟬蛻升陽(yáng)中之清陽(yáng)，姜黃、大黃降陰中之濁陰，一升一降，內(nèi)外通和，而雜氣之流毒頓消矣”（《寒溫條辨》卷四））。更以黃連清胃腸之熱，合大黃為君清熱解毒，蕩滌濁邪；加柴胡、黃芩為臣清利少陽(yáng)，瀉肝膽而疏理脾胃；白芍柔肝斂陰，輔佐以不傷陰；枳實(shí)理氣導(dǎo)滯行濁；清半夏降濁合黃連辛開(kāi)苦降，疏暢中焦；佩蘭和胃化濁消脾癉，干姜辛溫以暖中焦，兩者相合亦制他藥之苦寒。全方共奏化濁解毒、清肝和胃之功。本研究結(jié)果表明，化濁解毒方能夠降低二惡英暴露大鼠TC、TG、FFA及空腹血糖，改善糖耐量及IR，提高胰島素敏感性。

綜上，我們可以推測(cè)，化濁解毒方改善二惡英暴露大鼠的胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂，可能與其改善糖脂毒性有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明，化濁解毒方不僅能解糖脂之毒，亦可能解環(huán)境污染之毒，做到真正意義上的解毒，為未來(lái)代謝藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)代謝平衡的作用，今后實(shí)驗(yàn)中，我們將重點(diǎn)探討化濁解毒方對(duì)二惡英暴露大鼠肝、胰及脂肪等病理及分子生物學(xué)指標(biāo)方面的影響，進(jìn)一步揭示化濁解毒方解環(huán)境污染之毒的具體機(jī)制。