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      KLF9 基因腺病毒載體的構(gòu)建及其脂肪酸氧化功能

      2020-06-15 01:16:32黃金燦張磊常永生
      關(guān)鍵詞:原代腺病毒質(zhì)粒

      黃金燦,張磊,常永生

      (天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系,天津300070)

      非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種常見的代謝紊亂疾病,隨著飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變,患病率正呈現(xiàn)快速增高的趨勢。其主要特征為循環(huán)中葡萄糖、脂質(zhì)和炎癥因子的增加,脂肪酸氧化異常等,脂肪酸氧化的減少,使得細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累,嚴(yán)重時會導(dǎo)致肝臟脂肪變性[1]。

      Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子 9(KLF9)屬于 KLFs 家族中的一員,又稱基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白1(basic transc ription element-binding protein-1, BTEB1),是一種鋅指蛋白,初期是從大鼠肝臟cDNA 文庫中克隆獲得,參與調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄[2]。其中KLF9 在腎、肺、肝臟、腦、胸腺、睪丸及脾臟中均有表達(dá),但是其表達(dá)量在腦組織中相對較高[3-5]。KLF9 與C/EBPα直接相互作用并結(jié)合到過氧化物酶體增殖物活化受體PPAR-γ 的啟動子激活元件上促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的發(fā)育分化[6]。在肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞中,KLF9 通過激活 PPAR-γ 的表達(dá),促進(jìn)脂合成,從而導(dǎo)致脂滴的異位儲存影響脂肪變性[7]。有最新研究報道,地塞米松可促進(jìn)KLF9 表達(dá),增加肝臟糖異生,最終導(dǎo)致高血糖現(xiàn)象[8]。但是有關(guān)KLF9 在脂肪酸氧化的研究鮮有文章報道。本研究通過構(gòu)建及驗證KLF9 基因過表達(dá)的腺病毒,進(jìn)一步在肝原代細(xì)胞和小鼠體內(nèi)過表達(dá)KLF9,初步探究KLF9 在肝臟脂肪酸氧化方面的功能。

      1 材料與方法

      1.1 材料 KLF9 擴增序列引物(TSINGKE),擴增序列:5′-TTGGCGCGCC AAGCCACCATGTCCGCGGCC GCCTACAT-3′(正向);5′-CGACGCGTCGTCACTTGTC ATCGTCATCCTTGTAGTCGATGTCATGATCTTTATA ATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCAAGGGGCTGG CAAGAGCCT-3′(反向);兩端分別添加 PmeI 和PacI 酶切位點,C 端加 3×Flag 標(biāo)簽。PmeI 和 PacI 酶、primer star DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、dNTPs(Takara 公司);T-easy 質(zhì)粒、實時定量 PCR MIX、Trizol(Invitrogen);細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 和胎牛血清(Sigma),Lipofectamine2000。pAdTrack-CMV,pAd-Track-U6,E.coli.BJ5183,DH5α 感受態(tài)細(xì)菌,HepG2細(xì)胞系,PPAR-γ 協(xié)同刺激因子PGC 1-α 啟動子以及人胚腎細(xì)胞系 293A 由本實驗室保存。pGL3-Basic,pRL-TK 載體購自Promega 公司,pcDNA3.1 購自 Invitrogen 公司,Dual-Luciferase Reporter Assay system(Promega);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI 公司);青霉素、鏈霉素、胰酶(Solarbio);明膠和膠原酶(Sigma公司)。anti-KLF9 抗體(abcam,ab227920),anti-PGC1-α 抗體(abcam,ab54481),anti-flag 抗體(Sigma,F(xiàn)7425)。雄性,6 周齡,體質(zhì)量 22~25g 的 12 只 C57BL/6J 小鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,小鼠飼養(yǎng)和管理按照天津醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

      1.2 KLF9 腺病毒的構(gòu)建

      1.2.1 KLF9 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及腺病毒包裝 將測序正確的連接在T-easy 質(zhì)粒上KLF9 酶切下來,定向連入穿梭載體pAdTrack-CMV 后提質(zhì)粒。取8 μg質(zhì)粒,經(jīng)PmeI 酶切7 h 充分線性化,用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于 20 μL 去離子水中。取100~500 ng 酶切質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到E.coli.BJ5183 感受態(tài)細(xì)菌。以200 μL LB 培養(yǎng)基重懸細(xì)菌,涂于卡那霉素抗性的LB 平板,置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)15~20 h。挑克隆,置于5 mL 有卡那霉素抗性的LB 培養(yǎng)基,37℃搖床過夜后提質(zhì)粒,通過PacI 酶切可得3.0 和4.5 kb兩條帶,即為陽性克隆。將陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,涂板挑菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒。取14 μg所得的重組質(zhì)粒用PacI 酶切7~9 h,經(jīng)酚/氯仿抽提,溶于20 μL 去離子水。將重組質(zhì)粒以轉(zhuǎn)染密度50%~80%接種于10 cm 培養(yǎng)皿的293A 細(xì)胞中,孵箱中培養(yǎng)10~15 d,不用換培養(yǎng)基,隔天補500 μL DMEM 完全培養(yǎng)基。一般轉(zhuǎn)染5~7 d 后可以通過熒光顯微鏡觀察到GFP 斑。

      1.2.2 KLF9 腺病毒的擴增 將構(gòu)建好的KLF9 腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)293A 細(xì)胞,48 h 后將細(xì)胞收到50 mL離心管中。離心去上清后,在液氮和37℃反復(fù)凍融4次,4℃12 000 r/min 離心,收集上清,即病毒裂解液。第2 輪擴增,加病毒裂解液到6 個15 cm 培養(yǎng)皿(接種293A 細(xì)胞,匯合度90%),細(xì)胞全部呈綠色且30%~50%細(xì)胞懸浮時,收集細(xì)胞,離心去上清,在液氮和37℃反復(fù)凍融4 次,收集病毒裂解液。第3 輪擴增,步驟同第2 輪擴增。

      1.2.3 KLF9 腺病毒的純化 先在50 mL 離心管中緩慢加入1.4 g/mL 氯化銫8 mL,再緩慢加入1.2 g/mL氯化銫6 mL,在不連續(xù)梯度頂部加入20 mL DMEM 5%病毒保存液。4℃,100 000×g,離心 90 min。抽吸病毒帶至無菌15 mL 離心管中,加入1×TE 把溶液濃度降低到1.2 g/mL 以下。用連續(xù)密度發(fā)生器將12 mL 1.4 g/mL 和14 mL 1.29 g/mL 氯化銫連續(xù)密度梯度加入,在密度梯度頂部加入8~10 mL 上述稀釋的病毒懸液,4 ℃,100 000×g離心 16~20 h。抽吸藍(lán)白色病毒帶透析后,即為純化的腺病毒,可用于下一步尾靜脈注射老鼠。

      1.3 細(xì)胞實驗

      1.3.1 腺病毒感染細(xì)胞及Trizol 法提取RNA 用經(jīng)典的灌流-膠原酶消化法獲得小鼠肝臟原代細(xì)胞,鋪至 6 孔板中,用 1640(10%的血清,100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素)培養(yǎng),感染病毒前換新鮮的培養(yǎng)基。每個孔加120 pfu 的病毒。采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293A 細(xì)胞,培養(yǎng)基中添加100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素,細(xì)胞在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng),實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。感染病毒前換新鮮的培養(yǎng)基。每個孔加120 pfu的病毒,Trizol 法提取293A 細(xì)胞和肝臟原代細(xì)胞總RNA,超微量分光光度計定量,取 2 μg 總 RNA,加入Random primer 用Thermofisher 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以100ngcDNA 為模板,在羅氏LightCycler96儀器上進(jìn)行擴增反應(yīng),條件為:95℃10 min、95℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s(捕捉熒光值),循環(huán) 55 次,并作熔解曲線。各基因的Q-PCR 引物序列見表1。樣本結(jié)果以目的基因與36B4 的比值做相對定量分析,數(shù)據(jù)分析采用比較CT 法,重復(fù)樣本(n=3)取平均值。

      表1 實時熒光定量PCR 的引物序列Tab 1 The primer sequence of real-time quantitative PCR

      1.3.2 雙熒光素酶報告試劑盒測定PGC1-α 基因啟動子活性 將HepG2 細(xì)胞接種至24 孔板,待細(xì)胞達(dá)到80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用50 μL 無血清DMEM分別稀釋3.2 μL 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(1 mg/mL)和 0.8 μg 質(zhì)粒(表達(dá)質(zhì)粒:報告質(zhì)粒:TK 質(zhì)粒=30:30:1),輕輕混勻后室溫靜置5 min,其中質(zhì)粒(μg):Lipofectamine 2000(μL)=1:4 將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入DNA 混懸液中室溫靜置15 min。將DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的混懸液逐滴加入24 孔板細(xì)胞中,混勻后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h 后棄去培養(yǎng)基,用 100 μL 1×passive lysis buffer 裂解細(xì)胞20 min,取10 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔熒光檢測板中。將熒光素酶底物反應(yīng)液混勻備用。按照Promega 公司的雙熒光素酶報告試劑盒說明,在熒光檢測儀Turner Modulus 上對每孔細(xì)胞Firefly 和Renilla 熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

      1.3.3 ChIP 實驗 通過經(jīng)典的灌流-膠原酶消化法獲得小鼠肝原代細(xì)胞并在室溫下用1%甲醛處理10min,然后用ChIP 細(xì)胞裂解緩沖液(10 mmol/L pH 8.0 的Tris-HCl,10 mmol/L NaCl,3 mmol/L MgCl2,0.5%NP-40 和蛋白酶抑制劑混合物)和ChIP 核裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.05 mmol/L EDTA,1%SDS和蛋白酶抑制劑混合物)處理細(xì)胞。通過超聲處理細(xì)胞裂解液以剪切染色質(zhì),并用對KLF9 特異的抗體和非特異性IgG 進(jìn)行免疫沉淀。使用蛋白A/G-瓊脂糖珠(Invitrogen)分離免疫沉淀物,將其洗滌,并用0.1%NaHCO3洗脫。在65℃孵育過夜并使用蛋白酶K 解交聯(lián)后,通過酚氯仿抽提免疫沉淀DNA 片段和Input 的DNA 片段。純化的DNA 用于擴增小鼠PGC1-α 啟動子。PGC1-α 的引物設(shè)計見表2。

      表2 ChIP 的引物序列Tab 2 The primer sequence of ChIP

      1.4 小鼠分組和處理 從北京斯貝福生物科技有限公司購買C57BL/6J 小鼠12 只,隨機選擇6 只小鼠用脂肪含量10%普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,另外6只用脂肪含量60%高脂飼料喂養(yǎng)90 d,小鼠自由飲食飲水,飼養(yǎng)在溫度(22±2)℃、濕度(55±10)%、12 h 照明/非照明循環(huán)房間。將普通飼料喂養(yǎng)的小鼠隨機分為2 組:(1)對照組3 只:尾靜脈注射純化過的腺病毒空載體(Ad-GFP),注射量為 100 μL/只;(2)實驗組3 只:尾靜脈注射純化過的Ad-KLF9,注射量為100 μL/只。腺病毒注射10 d 后處死小鼠,取肝臟組織,提取組織總蛋白和RNA,檢測KLF9、PGC1-α、Cpt1a、Cyp4a10、Cyp4a14、Acdam、PPAR-α以及內(nèi)參基因36B4。高脂飲食小鼠的處理同上。

      1.5 Western blot 蛋白樣品以SDS-PAGE(分離膠濃度為10%)分離;電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,電轉(zhuǎn)2 h,5%牛奶室溫封閉PVDF 膜 1 h;PVDF 膜置于一抗溶液中,4℃搖床過夜;TBST 洗 PVDF 膜 3 次,每次 15 min;PVDF 膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(用TBST 配制的5%牛奶以 1∶5 000 稀釋) 室溫作用 1 h;TBST 洗 PVDF 膜5 次,每次10 min;將ECL 化學(xué)發(fā)光試劑A 液和 B液以1∶1 的比例混勻,滴加在PVDF 膜上,室溫反應(yīng)3 min 后在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中曝光。

      1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism8 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗數(shù)據(jù)均以表示,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 Ad-KLF9 在293A 細(xì)胞中過表達(dá) 使用融合表達(dá)3×Flag 的 KLF9 過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞,48 h 后通過熒光顯微鏡可見明顯的綠色熒光,感染效率達(dá)90%以上(圖1A)。收集細(xì)胞并提取總細(xì)胞蛋白和RNA,通過Western 印跡檢測后,發(fā)現(xiàn)在分子量35 KD 處有一條特異性的條帶,而感染Ad-GFP 的對照組則沒有條帶(圖1B)。通過Q-PCR 檢測,發(fā)現(xiàn)與感染Ad-GFP 組相比,感染Ad-KLF9 組293A 細(xì)胞中 KLF9 的表達(dá)量上調(diào)約 20 倍(圖1C,1D)。

      圖1 KLF9 基因腺病毒載體的包裝驗證Fig 1 The identification of KLF9 adenoviral vector

      2.2 KLF9 直接調(diào)控PGC1-α 的轉(zhuǎn)錄 通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn),PGC1-α 上存在KLF9 能夠結(jié)合的順式作用元件,ChIP-Q-PCR 實驗進(jìn)一步證明KLF9 能夠直接結(jié)合到PGC1-α 的啟動子上,促進(jìn) PGC1-α 基因的表達(dá)(圖2)。

      2.3 Ad-KLF9 促進(jìn)小鼠肝原代細(xì)胞中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá) 用經(jīng)典的灌流-膠原酶消化法獲取成活率為90%以上的C57BL/6J 小鼠肝原代細(xì)胞,鋪至6 孔板中,分別感染Ad-GFP 和Ad-KLF9,48 h后提取細(xì)胞總蛋白和RNA。通過Western blot 檢測,發(fā)現(xiàn)感染Ad-KLF9 與感染Ad-GFP 的肝原代細(xì)胞相比,在分子量100 KD 和35 KD 處,靶基因PGC1-α和KLF9 蛋白表達(dá)增強(圖3A)。經(jīng)Q-PCR 檢測,發(fā)現(xiàn)脂肪酸氧化的基因表達(dá)(Cpt1a,Cyp4a10,Cyp4a14,Acdam,PPAR-α)呈上調(diào)趨勢(圖3B,3C)。

      2.4 KLF9 促進(jìn)小鼠肝臟中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá) 將純化過的Ad-GFP 和Ad-KLF9 分別通過尾靜脈注射到老鼠體內(nèi),10 d 后,取肝臟組織,提取組織總蛋白和RNA。通過Western blot 檢測,與注射Ad-GFP 相比,注射Ad-KLF9 的小鼠肝臟中,在分子量分別為 100 KD 與 35 KD 處,PGC1-α 和KLF9表達(dá)增強(圖4A)。經(jīng)Q-PCR 檢測,KLF9 以及促進(jìn)脂肪酸氧化相關(guān)基因(Cpt1a,Cyp4a10,Cyp4a14,Acdam,PPAR-α)的表達(dá)均明顯上調(diào)(圖4B,4C)。

      圖2 KLF9 促進(jìn) PGC1-α 的表達(dá)Fig 2 KLF9 promotes expression of PGC1-α

      圖3 KLF9 上調(diào)小鼠肝原代細(xì)胞脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)Fig 3 The expression of fatty acid oxidation genes in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

      圖4 KLF9 上調(diào)小鼠肝臟組織中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)Fig 4 The expression of fatty acid oxidation genes in mouse liver injected with Ad-GFP and Ad-KLF9 via the tail vein

      2.5 KLF9 改善高脂小鼠非酒精性脂肪肝 將純化的Ad-GFP 和Ad-KLF9 分別通過尾靜脈注射到高脂小鼠體內(nèi),10 d 后,取肝臟組織做HE 染色和油紅O 染色,同時提取組織總蛋白和RNA。通過HE 和油紅O 染色,可以觀察到注射Ad-KLF9 的高脂小鼠肝臟脂滴形態(tài)變小,數(shù)量明顯減少,肝臟中脂肪堆積明顯得到改善(圖5A)。通過Western blot 和Q-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)與注射Ad-GFP 相比,注射Ad-KLF9 的高脂小鼠肝臟中,脂肪酸氧化相關(guān)基因(Cpt1a,Cyp4a10,Cyp4a14,Acdam,PPAR-α)表達(dá)明顯上調(diào)(圖 5B,5C,5D)。由此說明KLF9 可以促進(jìn)脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá),改善高脂小鼠脂肪肝。

      圖5 KLF9 上調(diào)高脂小鼠肝臟組織中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)Fig 5 The expression of fatty acid oxidation genes in liver of highfat mice increased by KLF9

      3 討論

      NAFLD 是世界范圍內(nèi)越來越常見的肝功能障礙疾病,影響著全球30%的人群,對人類健康產(chǎn)生巨大的威脅。其是肝臟脂質(zhì)堆積引發(fā)的肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化,從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝臟疾病,如肝硬化以及肝細(xì)胞癌等[9-10]。研究表明肥胖和2 型糖尿病都與NAFLD 密切相關(guān)[11]。肝臟作為機體內(nèi)主要代謝器官,可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,包括脂肪酸氧化,脂肪生成以及高、低密度脂蛋白吸收。其中脂肪酸氧化異常和過量轉(zhuǎn)移脂肪脂代謝異常相關(guān)疾病的風(fēng)險因素[12]。

      有研究報道,KLF3 通過促進(jìn)脂肪酸β 氧化來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[13]。KLF5 可以調(diào)控糖尿病小鼠心肌細(xì)胞PPAR-α 的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)代謝[14]。KLF11 過表達(dá)激活PPAR-α 信號通路和脂肪酸氧化,進(jìn)而改善DIO 小鼠和db/db 小鼠的脂肪肝表型,減少巨噬細(xì)胞浸潤[15]。由此,筆者對KLF 家族中的另外一位成員KLF9 與脂肪酸氧化之間的關(guān)系產(chǎn)生了興趣。在調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的眾多因子中,轉(zhuǎn)錄因子PGC1-α和PPAR-α 尤為重要。PGC1-α 是一種多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可以募集轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄復(fù)合體到達(dá)下游靶基因啟動子周圍并與其相互作用,從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。有研究報道,與野生型小鼠相比,PGC1-α 基因敲除小鼠表現(xiàn)出肝臟糖異生功能下降,脂肪酸氧化和線粒體能量代謝下降,并且編碼脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的基因表達(dá)都下降[16]。轉(zhuǎn)錄因子PPAR-α 一旦被配體激活,可以誘導(dǎo)與脂代謝平衡相關(guān)基因的表達(dá)。PPAR-α 基因缺陷小鼠在禁食狀態(tài)下肝臟中將會積累大量的甘油三酯,并且會出現(xiàn)低酮體和低血糖癥狀[17]。在眾多被PPAR-α 調(diào)節(jié)的基因中,編碼肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a(Cpt1a)和中鏈乙酰輔酶 A 脫氫酶(MCAD)基因與線粒體的脂肪酸氧化有關(guān);編碼微粒體細(xì)胞色素P450 酶(Cyp4a10 和Cyp4a14)的基因與催化微粒體中的脂肪酸氧化相關(guān)[15]。

      本研究中首先通過雙熒光素酶報告基因和ChIP 實驗得出,KLF9 可以結(jié)合到 PGC1-α 的啟動子上,促進(jìn)PGC1-α 基因的表達(dá)。然后將過表達(dá)KLF9 的腺病毒感染小鼠肝原代細(xì)胞,檢測與脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá),同時在蛋白水平驗證KLF9 和PGC1-α 的表達(dá)情況。為了證實細(xì)胞實驗的結(jié)果可靠性,進(jìn)一步通過尾靜脈注射過表達(dá)腺病毒和空載,同樣在蛋白水平驗證KLF9 和PGC1-α的表達(dá)情況,進(jìn)而檢測脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,在小鼠肝原代細(xì)胞或者在小鼠體內(nèi)過表達(dá) KLF9 都會增強 PGC1-α、PPAR-α 及其下游靶基因的表達(dá),并且進(jìn)一步改善肝臟脂肪變,筆者初步證實KLF9 在脂肪酸氧化中存在調(diào)控作用。

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