段昆　高霞　耿婷　曹亮　肖偉　王振中

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）11-1320-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.07

摘 要 目的：探討桂枝茯苓膠囊及其主要成分（芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷）對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠腸道菌群的影響。方法：將雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、膠囊組（桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物，1 000 mg/kg）、芍藥苷組（15.0 mg/kg）、丹皮酚組（10.3 mg/kg）和苦杏仁苷組（12.1 mg/kg），每組6只。除正常組外，其余各組大鼠均于背部皮下注射苯甲酸雌二醇和腹腔注射縮宮素建立原發(fā)性痛經(jīng)模型。于皮下注射苯甲酸雌二醇的第4天起，正常組大鼠灌胃等體積生理鹽水，模型組大鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7 d。在檢測各組大鼠扭體次數(shù)和子宮組織中一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量的基礎(chǔ)上，采用氣相色譜法檢測其結(jié)腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量;以多樣性指數(shù)為指標(biāo)，采用細(xì)菌基因組重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Rep-PCR）和腸桿菌基因組間重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Eric-PCR）技術(shù)評(píng)價(jià)大鼠糞便中腸道菌群的多樣性。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠扭體次數(shù)顯著增多，子宮組織中NO、MDA含量均顯著升高，結(jié)腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸及總SCFAs含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;腸道菌群DNA電泳條帶數(shù)量明顯減少，大部分條帶亮度明顯減弱，且給藥1 h時(shí)其多樣性指數(shù)（Rep-PCR和Eric-PCR法，下同）均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，膠囊組、芍藥苷組、丹皮酚組大鼠的扭體次數(shù)均顯著減少，膠囊組、丹皮酚組大鼠子宮組織中NO含量以及膠囊組、芍藥苷組、丹皮酚組MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;膠囊組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丙酸及總SCFAs含量，芍藥苷組乙酸、丙酸、丁酸及總SCFAs含量以及丹皮酚組丙酸、丁酸及總SCFAs含量均顯著升高，而芍藥苷組異戊酸含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）;各給藥組大鼠腸道菌群DNA電泳條帶及亮度均有不同程度的改變，且給藥1 h時(shí)膠囊組和芍藥苷組大鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)均顯著升高，而丹皮酚組和苦杏仁苷組大鼠腸道菌群的上述多樣性指數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：桂枝茯苓膠囊可顯著減少原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠的扭體次數(shù)，降低其子宮組織中NO、MDA的含量;同時(shí)，該藥還可調(diào)節(jié)大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs含量和腸道菌群多樣性。上述作用可能與該藥中的芍藥苷和丹皮酚等成分有關(guān)。

關(guān)鍵詞 桂枝茯苓膠囊;有效成分;原發(fā)性痛經(jīng);短鏈脂肪酸;腸道菌群多樣性;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Guizhi fuling capsules and its principal components （paeoniflorin， paeonol and amygdalin） on the intestinal flora of primary dysmenorrhea model rats. METHODS： Female SD rats were randomly divided into normal group， model group， capsule group （Guizhi fuling capsule， 1 000 mg/kg）， paeoniflorin group （15.0 mg/kg）， paeonol group （10.3 mg/kg） and amygdalin group （12.1 mg/kg）， with 6 rats in each group. Except for normal group， other groups were given estradiol benzoate subcutaneously on the back of rats and oxytocin intraperitoneally to induce primary dysmenorrhea model. From the 4th day after subcutaneous injection of estradiol benzoate， normal group was given constant volume of normal saline intragastrically; model group was given constant volume of 0.5%CMC-Na solution intragastrically; administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 days. The writhing times and the contents of NO and MDA in uterus tissue of rats were determined， and then the contents of short-chain fatty acids （SCFAs） such as acetic acid， propionic acid， butyric acid in colonic contents were detected by GC method. Using diversity index as index， Rep-PCR and Eric-PCR were used to evaluate the diversity of intestinal flora in feces of rats. RESULTS： Compared with normal group， the writhing times of rats were increased significantly in model group; the contents of NO and MDA in uterus were increased significantly， while the contents of acetic acid， propionic acid and butyric acid in colonic contents and total content of SCFAs were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the number of DNA electrophoresis bands of intestinal flora was significantly reduced， the brightness of most bands was significantly reduced， and the diversity indexes （by Rep-PCR and Eric-PCR method， hereinafter） 1 h after administration were significantly reduced （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， writhing times of rats were decreased significantly in capsule group， paeoniflorin group and paeonol group; the contents of NO in uterus of rats in capsule group and paeoniflorin group as well as the contents of MDA in capsule group， paeoniflorin group and paeonol group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the propionic acid content and total content of SCFAs in colon of rats in capsule group， the contents of acetic acid， propionic acid and butyric acid， total content of SCFAs in paeoniflorin group as well as the contents of propionic acid and butyric acid， total content of SCFAs in paeonol group were increased significantly; the content of isovaleric acid was decreased significantly in paeoniflorin group （P<0.05 or P<0.01）; DNA electrophoresis bands and its brightness of intestinal flora changed to different extents in administration groups， and the diversity indexes of intestinal flora 1 h after administration were increased significantly in capsule group and paeoniflorin group， while those indexes were decreased significantly in paeonol group and amygdalin group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Guizhi fuling capsules can significantly reduce writhing times and the contents of NO and MDA in uterus of primary dysmenorrhea model rats. At the same time， the capsules also can regulate SCFAs content in colonic contents and intestinal flora diversity of rats. The above effects may be related to paeoniflorin and paeonol in the capsules.

KEYWORDS? ?Guizhi fuling capsules; Effective component; Primary dysmenorrhea; Short-chain fatty acids; Intestinal flora diversity; Rat

桂枝茯苓膠囊是參照東漢張仲景《金匱要略》中的經(jīng)典名方桂枝茯苓丸經(jīng)劑型改良而得，由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、芍藥等5味中藥組成，具有活血化瘀、消癥散結(jié)等功效，臨床主要用于婦人瘀血經(jīng)絡(luò)所致癥塊、經(jīng)閉、原發(fā)性痛經(jīng)、產(chǎn)后惡露不盡等癥[1]。研究表明，原發(fā)性痛經(jīng)與雌激素分泌密切相關(guān)，而雌激素紊亂可引起部分腸道菌群的顯著改變[2-3]。腸道菌群種類繁多，是維持人體正常消化功能的微生物，具有抵御感染和降低自身免疫疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的能力，其多樣性直接反映了機(jī)體的健康狀態(tài)[4]。短鏈脂肪酸（SCFAs）是由碳水化合物和蛋白質(zhì)在厭氧環(huán)境下經(jīng)腸道菌群發(fā)酵所生成的產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等，具有維持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡的作用，是腸道菌群代謝的重要信息分子，影響著體內(nèi)雌激素、生長激素等激素的合成和分泌[5-7]。

桂枝茯苓膠囊作為治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效藥物，其主要成分芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷等具有抗氧化作用，對(duì)痛經(jīng)、卵巢囊腫等癥的治療均具有較好的效果[8];同時(shí)，芍藥苷可顯著促進(jìn)嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的增殖[9]，丹皮酚、苦杏仁苷分別對(duì)兩歧雙歧桿菌、脆弱擬桿菌、丁酸梭菌以及金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有抑制作用[10-11]。由此可見，桂枝茯苓膠囊及其主要成分對(duì)大鼠病理狀態(tài)下腸道菌群的調(diào)節(jié)具有重要意義。目前，關(guān)于桂枝茯苓膠囊的研究主要集中于其各成分的含量測定以及藥理活性、子宮評(píng)價(jià)指標(biāo)以及子宮形態(tài)變化等方面[12]，而關(guān)于該藥對(duì)腸道菌群的影響尚未見報(bào)道。基于此，本研究通過注射苯甲酸雌二醇和縮宮素建立大鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型[13-14]，在給予桂枝茯苓膠囊及其主要成分（芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷）的基礎(chǔ)上，通過藥效學(xué)指標(biāo)來評(píng)價(jià)該藥及其成分的治療作用;同時(shí)，運(yùn)用氣相色譜（GC）技術(shù)進(jìn)一步考察大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs的含量，借助細(xì)菌基因組重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Rep-PCR）和腸桿菌基因組間重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Eric-PCR）兩種技術(shù)來分析大鼠腸道菌群多樣性的變化，以期闡明桂枝茯苓膠囊及主要成分對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠腸道菌群的影響，為該藥治療原發(fā)性痛經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Quant Studio 3型熒光定量PCR儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];PowerPac HC型電泳系統(tǒng)、Universal HOOD Ⅱ型多功能凝膠成像儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司];DNM-9602G型酶標(biāo)儀（北京普朗生物科技有限公司）;Centrifuge 5424型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;7890B型GC儀[安捷倫科技（中國）有限公司];HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）;XS205DU型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];CT62A型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;Milli-Q PACIFICT Ⅱ7型純水儀[密理博（上海）貿(mào)易有限公司）]。

1.2 藥品與試劑

桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：171006，規(guī)格：0.31 g/粒）;芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：X12A8C33627，純度：≥98%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：Z08J6L1，純度：98≥%）均購自上海源葉生物科技有限公司;苦杏仁苷對(duì)照品（東京TCI公司，批號(hào)：H3BBD- GE，純度：≥97%）;乙酸對(duì)照品（批號(hào)：J181172，純度：≥99.9%）、丙酸對(duì)照品（批號(hào)：SHBD0049V，純度：≥99.5%）、丁酸對(duì)照品（批號(hào)：SHBG8089V，純度：≥99%）、戊酸對(duì)照品（批號(hào)：G1818016，純度：≥99.5%）、異戊酸對(duì)照品（批號(hào)：C1702044，純度：≥99.5%）、2-乙基丁酸對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：STBH4972，純度：≥99%）均購自默克生命科學(xué)上海有限公司;異丁酸對(duì)照品（國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180104，純度：≥99%）;苯甲酸雌二醇注射液（湖北武當(dāng)動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：170721，規(guī)格：1 mL ∶ 1 mg）;縮宮素注射液（寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：S171110，規(guī)格：2 mL ∶ 10單位）;一氧化氮（NO）測定試劑盒（批號(hào)：20180503）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號(hào)：20180502）均購自南京建成生物工程研究所;QIAamp? DNA Stool Mini Kit試劑盒（德國Qiagen公司，批號(hào)：160050377）;2×Taq PCR Mix試劑[天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：KT201801];DL2000 DNA Marker（批號(hào)：A2501C）、DL5000 DNA Marker（批號(hào)：AHF1916）均購自寶生物工程（大連）有限公司;Rep-PCR引物[上游（Rep1r）：5′-IIIICGICGICATCIGGC-3′，下游（Rep2i）：5′-ICGICTTATCIGGCCTAC-3′]、Eric-PCR引物[上游（Eric1f）：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，下游（Eric2r）：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′]均由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成;烏來糖（上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司）;瓊脂糖、溴化乙錠（美國Sigma公司）;5×氨基丁三醇-硼酸（TBE，上海生工生物工程技術(shù)有限公司）;氯化鈉注射液（批號(hào)：SD18082803，規(guī)格：250 mL ∶ 2.25 g，作生理鹽水用）;乙醚、硫酸、無水乙醇等其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠36只，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。所有大鼠均在SPF級(jí)動(dòng)物房中分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫（24±2）℃，每12 h晝夜交替。

2 方法

2.1 溶液配制、造模與樣品收集

2.1.1 給藥溶液的配制 稱取芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷對(duì)照品以及桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物各適量，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷以及膠囊內(nèi)容物質(zhì)量濃度分別為3.0、2.0、2.4、200 g/L的混懸液，臨用新配。

2.1.2 分組、造模與給藥 取大鼠36只，隨機(jī)分為正常組、模型組、膠囊組（桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物，1 000 mg/kg）、芍藥苷組（15.0 mg/kg）、丹皮酚組（10.3 mg/kg）、苦杏仁苷組（12.1 mg/kg），每組6只。膠囊組劑量設(shè)置參考本課題組前期研究，各成分組劑量設(shè)置參考現(xiàn)有文獻(xiàn)的定量分析結(jié)果[15-16]。通過注射苯甲酸雌二醇和縮宮素復(fù)制大鼠痛經(jīng)模型：除正常組大鼠于背部皮下注射等體積生理鹽水外，其余各組大鼠均于背部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液，每天1次，連續(xù)10天（其中第1、10天每只注射0.2 mL，其余各天每只注射0.1 mL）;于皮下注射苯甲酸雌二醇的第4天起，各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物，模型組大鼠灌胃0.5%CMC-Na混懸液，正常組大鼠灌胃生理鹽水，灌胃量均為5 mL/kg，每天1次，連續(xù)7天;于第10天末次給藥1 h后，模型組和各給藥組大鼠單次腹腔注射縮宮素注射液1.0 mL，若大鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)則表明模型成功[17]。

2.1.3 樣品收集 分別于腹腔注射縮宮素后1、48 h時(shí)收集大鼠糞便，并于48 h時(shí)用20%烏來糖溶液麻醉大鼠，處死，摘除子宮，并收集結(jié)腸內(nèi)容物，于-80 ℃保存，備用。

2.2 藥效指標(biāo)評(píng)價(jià)

于摘除子宮前，觀察并記錄注射縮宮素后30 min內(nèi)大鼠的扭體次數(shù)，并計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率：扭體反應(yīng)抑制率=（模型組大鼠平均扭體次數(shù)-給藥組大鼠平均扭體次數(shù)）/模型組大鼠平均扭體次數(shù)×100%。空白組大鼠未見扭體反應(yīng)，記為“0”。

取“2.1.3”項(xiàng)下子宮樣本適量，于冰浴條件下采用玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿處理。取勻漿液適量，分別采用硫代巴比妥酸法、硝酸還原酶法以酶標(biāo)儀檢測各組大鼠子宮組織中NO、MDA的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.3 結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs含量測定

2.3.1 GC條件 色譜柱：Agilent DB-FATWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;升溫程序：初始溫度80 ℃，以7 ℃/min升至190 ℃（保持2 min）;載氣：高純氮?dú)猓兌龋骸?9.999%）;流速：1 mL/min;進(jìn)樣口溫度：240 ℃;火焰離子化檢測器（FID）溫度：240 ℃;進(jìn)樣量：2 μL;分流比：5 ∶ 1。

2.3.2 樣品處理 稱取“2.1.3”項(xiàng)下結(jié)腸內(nèi)容物適量，加水0.4 mL和50%硫酸溶液0.1 mL，渦旋5 min，以12 000 r/min離心10 min。吸取上清液0.4 mL，加入乙醚0.5 mL，渦旋5 min，以12 000 r/min離心10 min，取上層有機(jī)層396 μL，加入質(zhì)量濃度為1.25 g/L的內(nèi)標(biāo)溶液（以乙醚為溶劑配制，臨用現(xiàn)配）4 μL，混勻，取適量進(jìn)行GC分析。

2.3.3 方法學(xué)考察 分別取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸對(duì)照品適量，用乙醚配制成質(zhì)量濃度均為1 g/L的混合對(duì)照品貯備液。取上述混合對(duì)照品貯備液用乙醚逐級(jí)稀釋后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量下限、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率等方法學(xué)考察，所有溶液均臨用現(xiàn)配[18]。

2.3.4 SCFAs的含量測定 取“2.1.3”項(xiàng)下結(jié)腸內(nèi)容物適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3.1”項(xiàng)下GC條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中SCFAs的質(zhì)量濃度，并計(jì)算其含量（X，mg/g）：X=c×v×D/m[式中，c為樣品中SCFAs的質(zhì)量濃度（mg/L），v為樣品預(yù)處理時(shí)的定容體積（L），m為結(jié)腸內(nèi)容物的取樣質(zhì)量（g），D為樣品稀釋倍數(shù)]。

2.4 腸道菌群多樣性分析

2.4.1 腸道菌群DNA提取 取“2.1.3”項(xiàng)下各組大鼠糞便適量，使用QIAamp? DNA Stool Mini Kit試劑盒提取其細(xì)菌DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.4.2 Rep-PCR和Eric-PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)體系（25? ?μL，兩種方法相同）：DNA模板3.0 μL、上/下游引物各0.5 μL、2×Taq PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL。Rep-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，39 ℃退火30 s，36 ℃再退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸9 min。Eric-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，49 ℃退火30 s，46 ℃再退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸9 min。擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓：90 V，時(shí)間：1 h），以1%溴化乙錠試液顯色后，使用多功能凝膠成像儀成像并拍照，以DL2000 DNA Marker（2 000 bp）、DL5000 DNA Marker（5 000 bp）為參照，獲取DNA條帶信息。利用Image Lab 6.0軟件將電泳圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)椴ǚ鍒D，其中每個(gè)波峰代表1個(gè)條帶，假設(shè)1個(gè)條帶代表1個(gè)細(xì)菌類群，條帶波峰峰面積則代表該類群的種群數(shù)量。采用多樣性指數(shù)（H′，即Shannon-Wiener指數(shù)）描述大鼠腸道菌群的多樣性：H′=-∑（pi lnpi）（式中，pi=ni/N，ni為大鼠的第i條帶的峰面積，N為此大鼠所有條帶的峰面積總和），H′值越高則表明菌群多樣性越豐富[19-20]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)

腹腔注射縮宮素后，與正常組比較，模型組大鼠均出現(xiàn)了明顯的扭體反應(yīng)，且扭體次數(shù)顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，膠囊組、芍藥苷組、丹皮酚組大鼠的扭體次數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01），抑制率分別為60.1%、77.9%、34.8%。與正常組比較，模型組大鼠子宮組織中NO、MDA含量均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，膠囊組、丹皮酚組大鼠子宮組織中NO含量以及膠囊組、芍藥苷組、丹皮酚組MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs含量變化

3.2.1 GC方法學(xué)考察結(jié)果 （1）專屬性：混合對(duì)照品溶液（經(jīng)乙醚稀釋，質(zhì)量濃度均為50 mg/L）、結(jié)腸內(nèi)容物樣品溶液、空白溶劑（乙醚）的GC圖見圖1。其中，圖1A、圖1B在同一保留時(shí)間有相同的色譜峰，且分離度良好;空白溶劑（圖1C）對(duì)定量分析無干擾，提示本法專屬性好。（2）線性關(guān)系：6種SCFAs檢測質(zhì)量濃度的線性范圍均為5～1 000 mg/L（R2均大于0.999），定量下限均為5 mg/L。（3）精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率試驗(yàn)：精密度、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為0.5%～2.5%、4.8%～10.9%（n=6）;結(jié)腸內(nèi)容物樣品溶液室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定（RSD為5.1%～11.2%，n=5）;6種SCFAs成分的平均加樣回收率為99.0%～113.3%（RSD為9.6%～14.1%，n=9）。精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)略，其余詳見表2。

3.2.2 結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs含量 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸及總SCFAs的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，膠囊組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丙酸及總SCFAs含量，芍藥苷組乙酸、丙酸、丁酸及總SCFAs含量以及丹皮酚組丙酸、丁酸及總SCFAs含量均顯著升高，而芍藥苷組異戊酸含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.3 腸道菌群多樣性變化

3.3.1 腸道菌群DNA電泳圖 各組大鼠糞便中腸道菌群DNA的Rep-PCR和Eric-PCR電泳圖見圖2。由圖2A、圖2B可見，與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群DNA的電泳圖中條帶數(shù)量明顯減少，且大部分條帶的亮度明顯減弱、小部分條帶亮度有所增強(qiáng)。與模型組比較，膠囊組和芍藥苷組大鼠腸道菌群DNA的電泳圖中條帶數(shù)量增多，亮度明顯增強(qiáng);丹皮酚組大鼠的電泳圖中部分條帶的亮度明顯增強(qiáng)，也有部分條帶的亮度有所減弱;苦杏仁苷組大鼠的電泳圖中條帶數(shù)量明顯減少，其亮度明顯減弱。此外，上述現(xiàn)象在Eric-PCR電泳圖中更為明顯，故本研究采用Eric-PCR法對(duì)末次給藥48 h后的大鼠糞便進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著給藥時(shí)間的延長，模型組、苦杏仁苷組和丹皮酚組的條帶數(shù)和條帶亮度均有明顯增多/增強(qiáng)的趨勢，膠囊組和芍藥苷組的條帶數(shù)和條帶亮度則明顯減少/減弱，各組間差異減小，詳見圖2C。

3.3.2 腸道菌群的多樣性指數(shù) 給藥1 h時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)均顯著下降（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，膠囊組和芍藥苷組大鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)均顯著升高，而丹皮酚組和苦杏仁苷組大鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。給藥48 h時(shí)，各組大鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表4。

4 討論

痛經(jīng)是最常見的婦科疾病，桂枝茯苓膠囊在治療原發(fā)性痛經(jīng)方面具有較好的療效[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷均具有良好的鎮(zhèn)痛、抗菌作用，其中芍藥苷是芍藥的主要有效成分，具有緩解痙攣性疼痛的作用[21]，丹皮酚、苦杏仁苷是治療痛經(jīng)中藥復(fù)方中的常見成分，具有緩解痛經(jīng)的作用[22]。在痛經(jīng)的發(fā)生過程中，機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，其中內(nèi)皮舒張因子NO和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA發(fā)揮著重要的作用[23]。NO可作用于子宮平滑肌，影響子宮收縮，其生成量增多可引發(fā)疼痛[24]。痛經(jīng)發(fā)作時(shí)，子宮平滑肌陣發(fā)性收縮可導(dǎo)致肌間血管受壓而引發(fā)子宮肌層及內(nèi)膜的暫時(shí)性缺血，子宮組織細(xì)胞由于缺血而生成較多的氧自由基，造成MDA含量增加[25]。本課題組前期藥效學(xué)研究結(jié)果表明，0.27～1.08 mg/g的桂枝茯苓膠囊對(duì)大鼠子宮組織前列腺素F2α、前列腺素E2、超氧化物歧化酶以及NO、MDA等指標(biāo)均有明顯的改善作用[12]?；诖?，本研究設(shè)置膠囊組給藥劑量為1 000 mg/kg（以該膠囊內(nèi)容物計(jì)算），同時(shí)結(jié)合芍藥苷、丹皮酚和苦杏仁苷在制劑中的含量（3種成分的含量范圍分別為14.80～18.5、7.13～10.8、8.72～14.4 mg/g）設(shè)置各單體成分的給藥劑量[15-16]。本研究通過皮下注射苯甲酸雌二醇和腹腔注射縮宮素建立了大鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型，并通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了桂枝茯苓膠囊能顯著減少模型大鼠的扭體次數(shù)，降低大鼠子宮組織中NO、MDA的含量，而芍藥苷和丹皮酚也表現(xiàn)出了類似的作用。這提示桂枝茯苓膠囊對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)具有較好的治療作用，芍藥苷和丹皮酚可能是發(fā)揮治療作用的有效成分之一。

SCFAs是腸道菌群和機(jī)體之間的關(guān)鍵鏈接因子之一，能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)孕酮、雌二醇的合成與分泌[6-7，26]。腸道內(nèi)含量最為豐富的SCFAs是乙酸、丙酸和丁酸，其主要來源于腸道內(nèi)碳水化合物的分解代謝;同時(shí)，腸道內(nèi)氨基酸的代謝也會(huì)產(chǎn)生SCFAs，如異丁酸、異戊酸等[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸及總SCFAs的含量均顯著降低，以丁酸含量變化最為明顯。有研究揭示了產(chǎn)生丁酸的腸道細(xì)菌主要屬于厚壁菌門中瘤胃菌科、毛螺旋菌科和梭菌科等，上述菌種均可降低腸道通透性、減少腸道炎癥，促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)完善，其豐度與糞便中丁酸的含量顯著相關(guān)[28]。在給予相應(yīng)藥物后，膠囊組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丙酸及總SCFAs含量，芍藥苷組大鼠乙酸、丙酸、丁酸及總SCFAs含量以及丹皮酚組大鼠丙酸、丁酸及總SCFAs含量均較模型組顯著升高，而芍藥苷組大鼠異戊酸含量較模型組顯著降低。這提示桂枝茯苓膠囊可提高模型大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丁酸、乙酸、丙酸等SCFAs的含量，且發(fā)揮這種作用的可能是芍藥苷和丹皮酚，與上述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致;但有關(guān)芍藥苷組大鼠體內(nèi)異戊酸含量的降低尚有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

Rep-PCR和Eric-PCR技術(shù)可用于鑒別屬、種、菌株的差異，其中Rep-PCR可擴(kuò)增細(xì)菌基因組中的重復(fù)序列，針對(duì)的是菌株的相同片段;Eric-PCR可擴(kuò)增腸桿菌基因組間的重復(fù)序列，針對(duì)的是腸桿菌間的相同片段;兩種方法均具有檢測快速、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于微生物研究中[29]。為全面反映模型大鼠腸道菌群的變化情況，本研究同時(shí)采用了Rep-PCR和Eric-PCR兩種方法。結(jié)果顯示，造模后，模型組大鼠腸道菌群的DNA電泳圖中可見條帶數(shù)量明顯減少，亮度發(fā)生變化，多樣性指數(shù)較正常組顯著降低。這提示大鼠腸道的微生態(tài)平衡被打亂，菌群多樣性發(fā)生改變。給予藥物1 h后，與模型組比較，膠囊組和芍藥苷組大鼠腸道菌群DNA的電泳圖中條帶數(shù)量增多，其亮度明顯增強(qiáng);丹皮酚組大鼠的電泳圖中部分條帶的亮度明顯增強(qiáng)，但也有部分條帶的亮度有所減弱;苦杏仁苷組大鼠的電泳圖中條帶數(shù)量明顯減少，其亮度明顯減弱。多樣性指數(shù)檢測結(jié)果顯示，給藥1 h時(shí)，膠囊組和芍藥苷組大鼠的多樣性指數(shù)均較模型組顯著升高，而丹皮酚組和苦杏仁組大鼠的多樣性指數(shù)均顯著降低。這提示桂枝茯苓膠囊能在用藥早期可對(duì)模型大鼠腸道菌群的多樣性進(jìn)行調(diào)節(jié)，且芍藥苷可能是發(fā)揮該作用的主要成分。給藥48 h時(shí)，各組大鼠的多樣性指數(shù)無顯著差異，推測可能是在48 h時(shí)，大鼠的扭體反應(yīng)早已消失，SCFAs的失調(diào)亦逐步恢復(fù)，這可能與大鼠機(jī)體的自我恢復(fù)能力有關(guān)，但具體機(jī)制有待后續(xù)研究予以驗(yàn)證。

綜上所述，桂枝茯苓膠囊可顯著減少原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠的扭體次數(shù)，降低其子宮組織中NO、MDA的含量;同時(shí)，該藥還可調(diào)節(jié)大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs的含量和腸道菌群多樣性。這提示調(diào)節(jié)SCFAs和菌群多樣性可能是桂枝茯苓膠囊治療原發(fā)性痛經(jīng)的機(jī)制之一，上述作用可能與該藥中的芍藥苷和丹皮酚等成分有關(guān)。本課題組后續(xù)還將通過16S rDNA高通量測序等技術(shù)對(duì)主要調(diào)節(jié)的腸道菌群種屬進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，并分析其變化情況，深入探討該藥的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2019-09-11 修回日期：2020-03-06）

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