川牛膝不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量綜合評價研究

丁 剛，李隆云*，宋旭紅，付紹智

1重慶市中藥研究院；2重慶市中藥良種選育與評價工程技術(shù)研究中心；3重慶市中藥資源學重點實驗室；4中國中醫(yī)科學院中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；5重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 404120

川牛膝又名白牛膝、甜牛膝，始載于明初蘭茂的《滇南本草》。川牛膝來源于莧科植物川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)的干燥根，為著名的川產(chǎn)道地藥材之一，是一種重要的大宗中藥材。《中國藥典》(2015版，一部)有收載，其性甘，微苦，平，歸肝、腎經(jīng)，具有逐瘀通經(jīng)、通利關節(jié)、利尿通淋等功效，在我國有較長的民間藥用和臨床應用歷史。川牛膝的產(chǎn)地主要是四川、重慶、湖北和湖南，由于各地氣候、地形、土壤條件等不同，所產(chǎn)川牛膝質(zhì)量也不均一。Ma等[1]測定不同產(chǎn)地川牛膝中杯莧甾酮的含量有顯著性差異，道地川牛膝中杯莧甾酮含量并不是最高。Zhang等[2]檢測不同產(chǎn)地川牛膝中齊墩果酸含量差異較大,牛膝栽培品的含量均高于野生品。Geng等[3]分離測定川牛膝中阿魏酸，Liu等[4]分離純化鑒定川牛膝的多糖。分別從不同角度研究川牛膝內(nèi)在質(zhì)量，為了綜合開發(fā)川牛膝產(chǎn)品及保障用藥安全，有必要對各產(chǎn)地川牛膝藥材的質(zhì)量進行全面的評價。本實驗建立了同時測定川牛膝杯莧甾酮、前杯莧甾酮和齊墩果酸，3種成分的HPLC方法，對不同產(chǎn)地川牛膝3種成分、總灰分、水冷浸物和乙醇冷浸物進行測定，并通過系統(tǒng)聚類分析法、主成分分析法進行評價，通過以上研究，更加全面地評價各地川牛膝的質(zhì)量，為川牛膝藥材的臨床使用和產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent公司，美國；DAD檢測器)，UV 2600紫外分光光度計(島津公司，日本)，Milli(Q Integral 5型純水儀(Millipoer公司，美國)，BSA 124(S型電子天平(Sartorius，德國)，KQ(250 DB型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，中國)，8(10型馬弗爐(沈陽節(jié)能電爐廠，中國)，XMTB數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司，中國)，G2X(9240 MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，中國)。

對照品：杯莧甾酮對照品(批號：MUST-16070511，純度：≥99%)、前杯莧甾酮對照品(批號：MUST-16072203，純度：≥98%)購自成都曼斯特生物科技有限公司；齊墩果酸對照品(批號：TAQT-LRLA，純度：≥93.1%)購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑：甲醇(TEDIA公司，美國；色譜純)、醋酸(TEDIA公司，美國；色譜純)，其它試劑均為分析純。

樣品產(chǎn)地：在全國范圍內(nèi)共收集樣品54批，詳細信息見表1。樣品經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為莧科植物川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)的干燥根。

表1 川牛膝樣品來源Table 1 Origin of C.officinalis Kuan

續(xù)表1(Continued Tab.1)

地區(qū)Region編號No.地點Habitat海拔Altitude(m)地區(qū)Region編號No.地點Habitat海拔Altitude(m)c-24奉節(jié)縣奉節(jié)縣長安鄉(xiāng)石縉村11 740h-8湖南小沙江鎮(zhèn)杉木坪村1 685c-25奉節(jié)縣長安鄉(xiāng)石縉村14社1 760h-9湖南小沙江鎮(zhèn)肖家院子1 623c-26奉節(jié)縣長安鄉(xiāng)石縉村21 820貴州省zz-1貴州大方縣興隆鄉(xiāng)獅子村5組1 925c-27奉節(jié)縣長安鄉(xiāng)石縉村17社1 830c-28巫溪縣天元鄉(xiāng)新月村1 740

2 實驗方法

2.1 水分、總灰分、水冷浸物、乙醇冷浸物的檢測

水分、灰分、浸出物，樣品處理及檢測方法按照《中華人民共和國藥典》[5]中相關方法進行檢測。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜分析條件

色譜柱：XTERRA?MS-C18(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm)。流動相：0.2%醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0～5 min，95% A；5～10 min，95%→65% A；10～35 min，65%→55% A；35～50 min，55%→5% A；50～51 min，5%→95% A；51～60 min，95%A；流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫為35 ℃，檢測波長：杯莧甾酮、前杯莧甾酮243 nm，齊墩果酸215 nm。色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A，B)和川牛膝供試品(C，D)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A,B) and C.officinalis sample (C,D)注：1.齊墩果酸；2.杯莧甾酮；3.前杯莧甾酮。Note:1.Oleanolic acid;2.Cyasterone;3.Precyasteron.

2.2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取對照品齊墩果酸3.21 mg、杯莧甾酮2.11 mg、前杯莧甾酮1.03 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密移取上述溶液，甲醇稀釋，得齊墩果酸濃度為321 μg/mL、杯莧甾酮濃度為211 μg/mL、前杯莧甾酮濃度為103 μg/mL的對照品溶液母液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取干燥川牛膝樣品粉末(過30目篩)0.5 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量。于25 ℃超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)60 min，冷卻，用甲醇補足失重，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察

將梯度濃度的混合對照品溶液按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測。以各對照品峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X，μg/mL)為橫坐標，做標準曲線，齊墩果酸的線性方程為Y=2.968X-0.255，r=0.999 1；杯莧甾酮的線性方程為Y=14.04X-2.516，r=0.999 9；前杯莧甾酮的線性方程為Y=11.721X+2.256，r=0.999 4。結(jié)果表明，齊墩果酸在0.49～19.6 μg/mL、杯莧甾酮在1.45～72.5 μg/mL、前杯莧甾酮在1.24～12.38 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.4.2 精密度試驗

取同一混合對照品溶液按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄各成分的峰面積。結(jié)果齊墩果酸、杯莧甾酮、前杯莧甾酮面積RSD分別為2.81%、1.28%、2.07%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復性試驗

取同一來源川牛膝樣品，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果齊墩果酸、杯莧甾酮、前杯莧甾酮面積RSD分別為2.87%、1.40%、2.24%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果齊墩果酸、杯莧甾酮、前杯莧甾酮峰面積RSD分別為2.11%、1.34%、1.99%，表明供試品溶液于24 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.4.5 回收率試驗

精密稱取已知含量的同一來源川牛膝樣品6份，每份0.25 g，分別精密添加與樣品中含量相當?shù)凝R墩果酸、杯莧甾酮、前杯莧甾酮對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，計算得到齊墩果酸的平均加樣回收率為103.31%，RSD為2.73%；杯莧甾酮的平均加樣回收率為100.77%，RSD為1.75%；前杯莧甾酮的平均加樣回收率為102.63%，RSD為2.75%。結(jié)果表明本方法的回收率良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 水分、總灰分、浸出物及乙醇冷浸物的檢測

川牛膝樣品中水分、總灰分、浸出物及乙醇冷浸物的檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示54批川牛膝樣品的水分含量在4.08%～8.95%之間，均低于16.00%，符合藥典規(guī)定；總灰分含量在2.41%～5.40%之間，均低于8.00%，符合藥典規(guī)定；浸出物水冷浸含量在66.13%～81.82%之間，均大于65.00%，符合藥典規(guī)定；浸出物乙醇冷浸含量在7.91%～23.94%之間，藥典沒有控制。

表2 川牛膝中水分、灰分、水浸出物和乙醇冷浸物測定結(jié)果Table 2 The determination of moisture,ash,water extract,95% ethanol extract in C.officinalis

續(xù)表2(Continued Tab.2)

編號No.水分Moisture(%)總灰分Total ash(%)水冷浸Water extract(%)乙醇冷浸物95% ethnaol extract(%)c-156.38±0.154.67±0.4278.83±1.4718.60±0.03c-168.40±0.384.58±0.2380.10±2.6616.53±1.20c-176.76±1.293.45±0.4674.12±1.1715.74±0.47c-186.86±1.372.41±0.2679.55±1.5621.18±1.34c-195.59±0.283.95±0.5181.17±0.4522.95±0.08c-208.05±0.544.39±0.3268.7±2.8811.41±0.56c-218.06±0.344.73±0.0376.88±2.3918.46±0.03c-226.19±0.854.77±0.5275.00±1.0219.23±1.48c-237.45±0.304.67±0.5080.76±1.4823.94±0.30c-247.77±1.434.67±0.0471.38±1.0815.55±0.37c-255.61±1.444.86±0.0779.50±1.2422.61±0.18c-265.88±0.214.58±0.6977.27±0.5016.91±0.83c-277.06±1.125.40±0.8274.32±1.0716.36±0.17c-287.47±1.254.13±0.2678.32±1.6620.14±0.25s-16.27±0.793.59±0.0678.79±1.5322.92±1.47s-25.79±0.435.06±0.0774.83±2.5617.17±0.30s-36.51±0.074.78±1.0077.84±1.7118.51±0.10s-46.74±1.124.54±0.8267.52±2.887.19±1.10s-58.25±0.724.78±0.0577.63±1.1115.91±1.31s-67.21±1.424.39±0.2877.92±1.9316.37±0.20s-77.03±0.044.87±0.1473.44±1.7116.09±0.83s-85.57±0.114.87±0.4568.72±1.8810.65±0.40s-96.65±0.513.58±0.2474.58±2.1117.82±0.46s-106.28±0.385.11±0.5077.27±2.9315.05±0.11s-117.44±1.294.52±0.0476.02±0.9115.38±0.02s-128.12±0.924.87±0.5481.82±1.0621.35±0.21s-137.14±1.394.87±0.9570.00±2.5710.16±1.66s-148.75±0.423.58±0.8276.18±1.1015.38±2.87s-158.32±0.594.79±0.0578.39±0.2819.21±0.05s-167.19±1.595.09±0.2169.16±1.6515.41±0.19h-17.22±0.813.80±0.1970.00±1.2713.14±0.52h-25.75±0.784.92±0.3579.18±0.4519.71±0.48h-37.07±1.194.82±0.4467.39±0.2312.03±0.78h-45.88±0.824.78±0.3569.16±1.0414.18±0.64h-57.06±1.194.39±0.2481.12±1.1121.75±0.74h-67.03±0.924.41±0.2472.55±0.2318.97±0.72h-77.17±0.794.87±0.7975.35±0.3316.03±0.66h-88.06±1.193.58±0.7276.66±0.4018.80±0.53h-96.19±1.224.79±0.6578.83±0.4115.97±0.56zz-16.95±0.445.16±0.2179.49±0.1119.22±1.01藥典規(guī)定Pharmacopeial regulations≤16.0≤8.00≥65.0未控制Uncontrolled

3.2 含量測定

按“2.2.3”項下方法每個樣品平行制備3份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。根據(jù)線性方程分別齊墩果酸、杯莧甾酮與前杯莧甾酮的百分含量，結(jié)果見表3。

表3 川牛膝中3種成分含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of 3 components in C.officinalis

續(xù)表3(Continued Tab.3)

編號No.齊墩果酸Oleanolic acid(%)前杯莧甾酮Precyasterone(%)杯莧甾酮Cyasterone(%)PCA得分排序PCA score sorts-80.01±0.0030.017±0.0080.198±0.11351s-90.021±0.0180.011±0.0050.312±0.02713s-100.027±0.0010.011±0.0030.184±0.03115s-110.029±0.0110.023±0.0040.172±0.01028s-120.005±0.0100.027±0.0010.223±0.0438s-130.014±0.0000.027±0.0020.241±0.01845s-140.011±0.0200.015±0.0030.170±0.04541s-150.013±0.0080.014±0.0020.164±0.01720s-160.035±0.0030.022±0.0020.181±0.00533h-10.010±0.0010.010±0.0120.243±0.04146h-20.046±0.0010.012±0.0030.287±0.0232h-30.021±0.0150.015±0.0120.243±0.02139h-40.011±0.0130.014±0.0040.232±0.00738h-50.034±0.0010.025±0.0010.242±0.0083h-60.026±0.0010.023±0.0060.221±0.03121h-70.014±0.0020.009±0.0050.238±0.01318h-80.034±0.0020.019±0.0030.242±0.02711h-90.026±0.0020.019±0.0070.223±0.0239zz-10.070±0.0020.003±0.0010.581±0.0281藥典規(guī)定Pharmacopeial regulations未控制Uncontrolled未控制Uncontrolled≥0.030%

由結(jié)果可知，川牛膝樣品中杯莧甾酮含量在0.10%～0.58%之間，均符合藥典要求。

3.3 化學模式識別

3.3.1 聚類分析

總灰分、水冷浸物、乙醇冷浸物及單個有效成分含量是評價川牛膝質(zhì)量的重要指標。本研究以總灰分、水冷浸物、乙醇冷浸物、齊墩果酸、杯莧甾酮和前杯莧甾酮含量數(shù)據(jù)為變量，運用SPSS 20.0軟件，以平方歐氏距離作為度量標準，對54批樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2，54批樣品共被分為2大類。

3.3.2 主成分分析

運用SPSS 20.0軟件，以川牛膝中齊墩果酸、杯莧甾酮、前杯莧甾酮、總灰分、水冷物、乙醇冷浸物的含量作為變量，以特征值和累計貢獻率作為判定依據(jù)，對不同產(chǎn)地川牛膝進行主成分分析。根據(jù)降維結(jié)果，共挑選出3個主成分PC1、PC2、PC3，特征值分別為1.951、1.497、1.250。各成分方差貢獻值分別為32.511%、24.955%、20.840%，累積貢獻值達到78.306%，具有較強的代表性，可用來評價川牛膝的質(zhì)量。

表4 因子載荷矩陣Table 4 Initial factor load matrix

圖2 川牛膝樣品聚類分析Fig.2 Cluster analysis of C.officinalis

根據(jù)各因子載荷矩陣及特征值計算得分系數(shù)，進一步得到PC1、PC2、PC3及綜合得分(Y)方程式：

PC1 =-0.025ZX1+0.075 ZX2+0.272 ZX3-0.065 ZX4+0.672 ZX5+0.681 ZX6

PC2 = 0.323 ZX1-0.649 ZX2+0.675 ZX3+0.058 ZX4-0.091 ZX5-0.090 ZX6

PC3 = 0.595 ZX1+0.392 ZX2+0.036 ZX3+0.692 ZX4+0.090 ZX5-0.059 ZX6

Y= 0.415 PC1+0.319 PC2+0.266 PC3

式中：ZX1、ZX2、ZX3、ZX4、ZX5、ZX6分別為齊墩果酸、前杯莧甾酮、杯莧甾酮、總灰分、水冷浸物、乙醇冷浸物的標準化值。

利用上式計算各地川牛膝質(zhì)量綜合得分并按結(jié)果高低進行排序(表3)，得分越高，表明川牛膝質(zhì)量越好，排名越靠前。同一地域樣品排名有前有后，川牛膝質(zhì)量與地域沒有明顯關系。此外，由表4及圖4可知，PC1主要反映了水冷浸物和乙醇冷浸物的信息，PC2主要反映了杯莧甾酮的信息；PC3主要反映了總灰分和齊墩果斷的信息。

圖3 主成分得分圖Fig.3 Scores plot from principal component analysis

圖4 主成分因子分析圖Fig.4 Loadings plots from principal component analysis

4 討論

本研究建立了可同時檢測齊墩果酸、杯莧甾酮、前杯莧甾酮，3種成分的HPLC方法，方法學驗證均符合藥典中相關規(guī)定，表明該方法準確、可行。

本研究對全國各主要產(chǎn)地川牛膝的質(zhì)量指標進行了較全面地考察。運用主成分分析方法和聚類分析法，分析總灰分、水冷浸物、乙醇冷浸物和齊墩果酸、杯莧甾酮、前杯莧甾酮含量指標數(shù)據(jù)，通過一系列算法重新組成新的互不相關的幾個綜合指標代替原來數(shù)據(jù)指標[6]。結(jié)果可將54批川牛膝樣品分為2大類，提煉出3個主成分。2大類主要體現(xiàn)是浸出物與有效成分含量指標。3個主成分，第一主成分反應浸出物，體現(xiàn)多糖[7]對川牛膝質(zhì)量的影響；第二主成分反應杯莧甾酮[8]，體現(xiàn)有效成分對川牛膝質(zhì)量的影響；第三主成分反應總灰分，體現(xiàn)鹽類、金屬氧化物含量等對川牛膝質(zhì)量的影響。

重慶奉節(jié)縣長安鄉(xiāng)西曹村兩個川牛膝偽品(麻牛膝)，杯莧甾酮含量分別為0.086%和0.077%，與正品川牛膝杯莧甾酮含量均值0.207%有顯著差異。經(jīng)過田間海拔實驗，川牛膝在海拔1 400 m以下，發(fā)現(xiàn)杯莧甾酮含量明顯降低。

川牛膝質(zhì)量與地域沒有明顯關系，因為川牛膝種植區(qū)域集中在西南高海拔山區(qū)，生長氣候條件類似。藥農(nóng)種植技術(shù)、田間管理水平、初加工技術(shù)是導致質(zhì)量差異的主因，同一個加工點，不同批次，川牛膝質(zhì)量也存在差異。下一步將開展種植技術(shù)、初加工技術(shù)對川牛膝質(zhì)量影響的研究。