孫定軍，邢波，陳漠水，馬添翼，張福偉

動脈粥樣硬化是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，心血管疾病是人類死亡的主要原因。動脈壁中膽固醇積聚是動脈粥樣硬化的特征，其中巨噬細(xì)胞起決定性作用[1-2]。巨噬細(xì)胞形成的泡沫細(xì)胞在脂質(zhì)積累中起著至關(guān)重要的作用。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)可促進膽固醇流出至無脂質(zhì)載脂蛋白A1并增加高密度脂蛋白(HDL)的形成，是預(yù)防動脈粥樣硬化的重要靶點[3-4]。ABCA1基因在巨噬細(xì)胞中的表達受配體依賴性核受體的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)通過誘導(dǎo)肝臟X受體α(liver X receptor α，LXRα)基因和ABCA1基因的轉(zhuǎn)錄來增強膽汁外流[5-7]。LXRα與類視黃醇X受體結(jié)合形成異二聚體，并跟蹤ABCA1啟動子中特定DNA反應(yīng)元件的連接，刺激ABCA1基因轉(zhuǎn)錄，增加ABCA1依賴性膽固醇外流至ApoA1。因此，PPARγ/LXRα/ABCA1信號可刺激巨噬細(xì)胞膽固醇外流[8]。瑞舒伐他汀是一種選擇性HMG-CoA還原酶抑制劑。HMG-CoA還原酶抑制劑是轉(zhuǎn)變3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A為甲戊酸鹽—膽固醇前體的限速酶。瑞舒伐他汀的主要作用部位是肝，是降低膽固醇的靶向器官[9]。瑞舒伐他汀增加了肝LDL細(xì)胞表面受體數(shù)目，促進LDL的吸收和分解代謝，抑制了VLDL的肝合成，由此降低VLDL和LDL微粒的總數(shù)[10]。本研究擬探討瑞舒伐他汀經(jīng)PPARγ-LXRα信號通路抑制THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的機制，為動脈粥樣硬化的治療提供理論依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)THP-1巨噬細(xì)胞：購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；(2)試藥試劑：瑞舒伐他汀(美國sigma公司)、NaHCO3、青霉素、鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)基(賽默飛世公司)，10%熱滅活的胎牛血清(FBS，sigma公司)、氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)(碧云天生物科技公司)、MTT(碧云天生物科技公司)、十二烷基硫酸鈉(賽默飛世公司)、膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)試劑(BD Pharmingen公司)、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco/BRL公司)、6%SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠(Millipore Corporation，USA)、PVDF(Millipore Corporation，USA公司)、PPARγ-LXRα一抗(均為1∶1 000，美國賽默飛世公司)，總膽固醇(TC)，游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)試劑盒為貝克曼原廠試劑、RNAzol試劑盒(sigma公司)；(3)儀器設(shè)備：UK-098CO2培養(yǎng)箱(美國熱電)、VT-098酶標(biāo)儀(美國BioTek Instruments)、FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)、貝克曼AU-480生化儀、Light Cycler Run 5.32實時PCR系統(tǒng)(美國Roche)。

1.2 THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及分組 2018年12月—2019年3月于?？谑腥嗣襻t(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院中心實驗室進行實驗，將THP-1巨噬細(xì)胞在含有10%FBS、0.37%NaHCO3、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基置于5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中。每2 d更換一次培養(yǎng)基。對照組：取THP-1巨噬細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/ml)10 ml于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、20% O2)；ox-LDL組：取THP-1巨噬細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，加入ox-LDL，使其終濃度為100 mmol/L，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、20% O2)；瑞舒伐他汀低、中、高劑量組：取THP-1巨噬細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，加入ox-LDL，使其終濃度為100 mmol/L，各組分別加入瑞舒伐他汀，使瑞舒伐他汀最終濃度為10.0 μg/ml、100.0 μg/ml、1 000.0 μg/ml，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、2%O2、93%N2)。以上各組每孔設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 THP-1巨噬細(xì)胞活力測定：細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，向每個孔中加入MTT(0.5 mg/ml)溶液100 μl， 然后將96孔板在37℃、5%CO2、飽和濕度下溫育，加入20%十二烷基硫酸鈉(含有50%二甲基甲酰胺)100 μl以溶解甲晶體，在酶標(biāo)儀570 nm波長下測量光密度值(OD值)。

1.3.2 THP-1巨噬細(xì)胞凋亡水平測定：使用FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)雙重染色，通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡。與番茄紅素一起溫育后，將細(xì)胞在PBS中洗滌2次，通過胰蛋白酶消化收獲，懸浮于PBS液3 ml中，并以3000×g離心5 min。除去上清液后，將細(xì)胞在含有膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI的結(jié)合緩沖液中室溫溫育15 min。 使用流式細(xì)胞儀進行熒光分析。

1.3.3 THP-1巨噬細(xì)胞TC、FC、CE水平測定：應(yīng)用貝克曼AU-480型生化儀測定細(xì)胞上清液TC、FC和CE的水平。

1.3.4 THP-1巨噬細(xì)胞PPARγ-LXRα基因水平測定：通過RNAzol試劑盒從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離總細(xì)胞RNA，并使用oligo(dT)作為引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Gibco/BRL，698547)，然后用PPARγ、LXRα、ABCA1，ApoA1和β-肌動蛋白上的10個引物堿基擴增。用于擴增PPARγcDNA的引物是位于5'-非翻譯區(qū)的5'-TCTCCAGCATTTCTACTCCAC-3'和位于3'-非翻譯區(qū)的5'-GCCAACAGCTTCTCCTTCTCG-3'，用于擴增LXRαcDNA的引物是5'-TCAGCCGGGAGGACCAGATTG-3'和5'-CCGGAGGCTCACCAGTTTCATTAG-3'，用于擴增β-肌動蛋白的引物是5'-GAGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3'和5'-GCCTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3'。使用Light Cycler Run 5.32實時PCR系統(tǒng)進行定量PCR，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s(35個循環(huán))，然后在72℃持續(xù)7 min。PPARγ、LXRα和β-肌動蛋白擴增產(chǎn)物大小分別為460、404、439、215和518 bp。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色。通過Matrox Inspector 2.1軟件定量PPARγ、LXRα相對水平。

1.3.5 THP-1巨噬細(xì)胞PPARγ-LXRα蛋白水平測定：從THP-1巨噬細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)，并與上樣緩沖液混合,使用6%SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠，在每個泳道(20 μg)中加載等量蛋白質(zhì)電泳120 min(80 V、30 min和120 V、90 min)。將相關(guān)蛋白質(zhì)在200 mA下轉(zhuǎn)移至PVDF膜2 h，然后用5%脫脂奶粉封閉并與PPARγ-LXRα抗體一起在4℃溫度下孵育過夜;然后將膜用PBS洗滌3次(每次10 min)，然后與HRP綴合的第二抗體一起溫育2 h。用BeyoECL Plus(Beyotime)和Tanon 5500觀察Western印跡條帶。

2 結(jié) 果

2.1 各組THP-1巨噬細(xì)胞的OD值、存活率比較 與對照組比較，ox-LDL組OD值、存活率均明顯升高(P<0.05)，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組OD值、存活率明顯降低(P均<0.05)，且隨著瑞舒伐他汀劑量的增加，各組OD值、存活率逐漸降低(P均<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組THP-1巨噬細(xì)胞OD值、存活率比較

圖1 各組THP-1巨噬細(xì)胞增殖情況(甲基紫染色,×200)

2.2 各組THP-1巨噬細(xì)胞凋亡率比較 與對照組THP-1巨噬細(xì)胞凋亡率(12.2±0.19)%比較，ox-LDL組(1.13±0.24)%降低(t/P=12.547/0.000)，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀低(3.38±0.20)%、中(7.11±0.21)%、高(7.69±0.18)%劑量組凋亡率水平依次升高(F/P=19.632/0.000)，見圖2。

2.3 各組THP-1巨噬細(xì)胞TC、FC、CE水平比較 與對照組比較， ox-LDL組TC、FC、CE水平明顯升高(P均<0.05)；與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組隨著瑞舒伐他汀劑量的增加TC、FC、CE水平逐漸降低(P<0.05)，見表2。

2.4 各組THP-1巨噬細(xì)胞PPARγ、LXRα mRNA表達水平比較 與對照組比較， ox-LDL組PPARγ、LXRα mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)；與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組隨著瑞舒伐他汀劑量的增加PPARγ、LXRα mRNA水平逐漸升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組THP-1巨噬細(xì)胞PPARγ、LXRα mRNA表達水平比較

2.5 各組THP-1巨噬細(xì)胞 PPARγ、LXRα蛋白表達水平比較 與對照組比較， ox-LDL組PPARγ、LXRα 蛋白表達水平均降低(P<0.05)；與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組隨著瑞舒伐他汀劑量的增加PPARγ、LXRα蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)。見表4、圖3。

圖2 各組THP-1巨噬細(xì)胞凋亡情況

表2 各組THP-1巨噬細(xì)胞TC、FC、CE水平比較

組 別復(fù)孔數(shù)TCFCCE對照組6158.63±15.63120.36±19.63153.63±19.52ox-LDL組6569.63±17.25561.69±20.36526.25±18.25瑞舒伐他汀低劑量組6445.63±14.58469.32±16.58419.52±21.63瑞舒伐他汀中劑量組6334.63±13.98321.69±19.63352.36±18.63瑞舒伐他汀高劑量組6221.63±14.42186.36±18.54296.59±19.63 F值121.321259.658368.487 P值0.0000.0000.000

表4 各組THP-1 巨噬細(xì)胞PPARγ、LXRα蛋白表達水平比較

圖3各組THP-1巨噬細(xì)胞PPARγ、LXRα蛋白表達水平比較

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組OD值、存活率、TC、FC、CE水平均明顯降低，凋亡率明顯升高，提示瑞舒伐他汀能抑制THP-1巨噬細(xì)胞增殖，促進THP-1巨噬細(xì)胞凋亡，促進THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇流出抑制泡沫細(xì)胞的形成。瑞舒伐他汀在多種疾病中具有多種生物學(xué)功能，如心血管疾病和糖尿病腎病，其具有預(yù)防脂質(zhì)積聚，降低血壓，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。研究表明，瑞舒伐他汀通過降低TC、LDL-C、TG和增加HDL-C的水平起到抗動脈粥樣硬化作用[11]。瑞舒伐他汀可抑制巨噬細(xì)胞活化和泡沫細(xì)胞形成，還可以保護HUVEC免于細(xì)胞凋亡，并提示通過保護免受H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激機制進行保護[12-14]。此外，瑞舒伐他汀降低膽固醇水平并抑制由脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞因子產(chǎn)生，并改變喂食高脂肪酸飲食的小鼠或大鼠中脂肪酸的組成[15-17]。瑞舒伐他汀可通過延遲LDL氧化保護血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過抑制血小板聚集防止血液凝固，增加HDL-C并降低TC、TG和LDL水平。動物實驗還顯示，瑞舒伐他汀可降低LDLR -/-和ApoE -/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊面積，并顯著降低小鼠膽固醇水平，然而，所涉及的分子機制尚不清楚[18-19]。隨后的研究表明，瑞舒伐他汀可以調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，并抑制白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的表達。炎性反應(yīng)和膽固醇代謝紊亂被認(rèn)為是引起動脈粥樣硬化的主要危險因素，而瑞舒伐他汀可潛在地用作抗動脈粥樣硬化。

PPARγ/LXRα途徑是調(diào)節(jié)ABCA1表達的核心機制，該途徑對ABCA1表達的影響已被廣泛接受。LXRα作為核轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)膽固醇轉(zhuǎn)運途徑中的多個基因，例如ABCA1和ABCG1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[20]。另一項研究表明，LXRα興奮劑T0901317可抑制小鼠動脈粥樣硬化的進展。細(xì)胞實驗證實，T0901317通過激活巨噬細(xì)胞中的LXRα上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達，從而驅(qū)使細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流向ApoA1和HDL并抑制泡沫細(xì)胞的形成。另一項研究表明，LXRα表達受其他核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，如PPAR。 PPAR是一種核轉(zhuǎn)錄因子，具有3種亞型：PPARα、PPARβ和PPARγ[21]。這些核轉(zhuǎn)錄因子與其配體組合可改變空間構(gòu)象，隨后與靶基因啟動子內(nèi)的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[22]。這些核轉(zhuǎn)錄因子也可以激活LXRα并與AX受體結(jié)合形成異二聚體，其調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在3種PPAR亞型中，PPARγ可調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝，以及炎性反應(yīng)和免疫作用[23]。因此，這些轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組PPARγ、LXRα mRNA和蛋白表達明顯升高，這與上述討論一致，同時提示，瑞舒伐他汀促進PPARγ、LXRα mRNA、蛋白表達，進而介導(dǎo)PPARγ/LXRα途徑，促進膽固醇流出，并減少THP-1泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。已經(jīng)證實PPARγ上調(diào)LXRα表達。研究表明，瑞舒伐他汀在高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中表達PPARγ，并且還激活腺苷5'-一磷酸(AMP)介導(dǎo)的蛋白激酶(AMPK)信號通路。這些研究也與本結(jié)果一致。

綜上所述，瑞舒伐他汀能促進THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇流出，減少THP-1泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)積累；其機制與瑞舒伐他汀促進PPARγ、LXRα mRNA、蛋白表達，進而激活PPARγ/LXRα途徑有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

孫定軍：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫及修改；邢波、陳漠水：參與實驗過程并進行數(shù)據(jù)分析，論文審核；馬添翼：細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)實驗；張福偉：細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)實驗檢查。